Os autores agradecem Gilbert Verde para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios da NIAMS / NIH (R01-AR060484) e DOD (W81XWH-12-1-0555) atribuído a SMY e do NIH (CA92871 U24 U54 e CA151838) concedidos a MGP

Todos os estudos com animais foram realizados em conformidade com os regulamentos do Comitê Animal Care e Use a Johns Hopkins. 1. Infravermelho Próximo (NIR) imagens de fluorescência de Skeletal Colágeno Remodelação In vivo <ol><li> Photo-ativação da injeção veia CMP ea cauda enjaulado <ol><li> Prepare 110 ml de solução CMP enjaulado para cada rato (20-30 g de peso do rato): 100 ml de solução para a dosagem, com um extra de 10 mL de almofada para a possível perda durante a transferência e injeção. Misturar 11 ul de IR680-Ahx-NB (GPO) solução stock 9 (400 uM) com 11 ul de 100 uM de cisteína em solução de PBS estéril, em seguida, levar o volume total de 110 ul com tampão de PBS 1x. A solução final contém péptido 4 nmol de IR680-Ahx-NB (GPO) 9 e 1 nmol de cisteína em 100 ul de solução de PBS 1x. </li><li> Lentamente withdraw a solução de peptídeo em um 0,5 ml seringa de insulina, com um cano transparente e um pequeno calibre (28-30 G) agulha e, cuidadosamente, remova as bolhas de ar. Ligue a lâmpada UV para permitir que a lâmpada aqueça por 2-5 min. </li><li> Colocar a seringa contendo o péptido directamente sob uma lâmpada de UV (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) durante 5 min para permitir a foto-activação. </li><li> Enquanto isso, posicione o mouse em um limitador sob uma lâmpada aquecida; rotular o mouse com um marcador permanente na cauda ou outros métodos de identificação, tais como etiqueta de orelha ou dedo do pé tatuagem, e desinfectar a cauda com 70% de álcool. </li><li> Imediatamente após a activação de UV, injectar 100 ul de activado por UV IR680-Ahx-NB (GPO) 9 solução na veia da cauda, ​​de preferência, na parte posterior da cauda. Posicione o mouse de volta para a jaula após a injeção. </li></ol></li><li> NIR imagens de fluorescência de atividade remodelação do colágeno <ol><li> Conjuntoa placa de aquecimento do leito de imagem do sensor de imagem de impulso a 37 ° C usando o software 2.0 Pérola impulso. </li><li> Coloque o mouse nu ou raspada para a câmara de indução anestésica contendo 2% de isoflurano em oxigênio. Verifique a profundidade do plano de anestesia por falta de movimento do mouse durante o manuseio e pelo monitoramento da freqüência de respiração (~ 1/seg). </li><li> Depois que o mouse é anestesiado, abrir a gaveta imager Pérola, e coloque o animal na cama de imagem. Remover rapidamente o cone plugue nariz e deslize o focinho do rato dentro do cone do nariz para manter o rato sob anestesia (2% de isoflurano em oxigênio fornecido a 2 L / min através do cone do nariz) durante o processo de geração de imagens. Uma vez que o rato está no lugar, fechar a gaveta. </li><li> Quando o instrumento indica &quot;pronto&quot; no painel de software de imagem, clique no botão &quot;700 canal&quot;, &quot;luz branca&quot; e &quot;85 mícron&quot; caixas seguido pelo &quot;botão adquirir imagem&quot;. NIR (excitação 685 nm, emissão 720 nm) umd brancas fotos de luz será levado usando o foco automático ea exposição. </li><li> Quando a gravação terminar, abra a gaveta, vire o mouse, e adquirir imagens de um outro ângulo. O mouse pode ser colocado com a sua frente (ventral), costas (dorsal) ou nas laterais de frente para a câmera. Estreitas faixas de fita pode ser usada como restrições para esticar seus membros para obter a melhor vista da região de interesse (por exemplo, caixa torácica, tornozelos e pulsos). </li><li> Um tempo adequado para observar a absorção do esqueleto de IR680-CMP é entre 24-96 horas pós-injecção (hpi), com base na dosagem (~ 4 nmol / murganho). Para adquirir imagens de alta resolução, sacrificar o mouse por deslocamento cervical sob anestesia profunda após 72 hpi, retire a pele (e cabelo), usando uma pinça cirúrgica e tesouras, e da imagem que por NIR fluorescência como descrito acima. </li><li> Analisar as imagens de fluorescência adquiridos NIR. </li></ol></li></ol> 2. Visualização de colágenos em Ex vivo0; tecido Seções <ol><li> Preparação do material <ol><li> Prepare 1 ml de 10% (w / v) de solução de BSA em água desionizada. Descongelar 1 ml de soro de cabra em um banho de água à temperatura ambiente. Cortar algumas peças de Parafilm no tamanho de cerca de 2 cm x 5 cm. </li><li> Preparar 10 ml de tampão de bloqueio, através da mistura de 500 mL de soro de cabra, 1 ml de 10x de PBS e 8,5 ml de água desionizada. Prepare 5 ml de tampão de diluição de CMP diluindo 50 ul de 10% (w / v) de BSA com 4,45 ml de água desionizada e 500 ul de PBS 10x. </li><li> Dilui-se as soluções de reserva de marcado-carboxifluoresceína enjaulado CMP, CF NB (GPO) 9 (480 uM), a 5 uM, utilizando o tampão de diluição de CMP. CMP concentração óptima varia 2,5-30 uM, dependendo do tipo de tecidos e a natureza de amostras de tecido. Um volume de 100 uL é recomendado para coloração de uma secção de tecido deslizante. Guarde o solut CMP formuladoíons no escuro. </li><li> Deixe o mouse lâminas de tecido da córnea atinjam a temperatura ambiente. Incubar as lâminas em tampão PBS 1x por 5 min. Os tecidos da córnea de ratinho usados ​​nesta demonstração foram prefixados com paraformaldeído a 4% em solução de PBS, durante 1 hora, criopreservadas em Tissue-Tek outubro médio, cryosectioned a 8 espessura mM, e montadas em lâminas de vidro carregadas. </li></ol></li><li> Coloração de tecidos e de imagem <ol><li> Colocar as lâminas em câmara úmida. Para cada lâmina, aplicar 0,5 ml de solução de bloqueio e incubar as lâminas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Remover a solução de bloqueio por secagem das lâminas sobre uma toalha de papel. </li><li> Aplicar a cerca de 100 ul de CF NB (GPO) 9 soluções para cobrir as secções de tecido de cada lâmina. Incubar as lâminas durante 2 min para permitir que a solução de CMP para permear tecidos. </li><li> Ligue a lâmpada UV. Quando a lâmpada é aquecido, expor o tecido CMP-se cobertoCÇÕES à luz UV durante 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) para desproteger os PGZC gaiolas. Após a exposição à radiação UV, cobrir as secções de tecido de cada lâmina com um pedaço de Parafilm para evitar a secagem. Colocar as lâminas na câmara húmida e incubar a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Prepara-se uma diluição de 1:3.000 de solução DAPI em PBS 1x. Após a coloração CMP, retire delicadamente o Parafilm com uma pinça, e secar os slides em um papel toalha para remover o excesso de solução CMP. Aplicar a cerca de 100 ul de soluções diluídas DAPI para cada lâmina de tecido e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a coloração, mergulhe as lâminas em tampão PBS 1x em uma tina de coloração por 5 min. Repita este 3x em fresco 1x PBS para lavar os agentes de coloração não ligados. </li><li> Adicionar uma gota de meio de montagem na secção de tecido e cubra com uma lamela de vidro, evitando bolhas de interceptação. Coloque os slides em uma bandeja deslizante de papelão para protegê-los da luz. </li><li>Imagem os fios de colágeno (canal FITC) e núcleo das células (canal DAPI) nas lâminas de tecido, utilizando um microscópio de fluorescência. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Como pode ser visto neste protocolo, a entrega do CMP é simples já que o UV-ativação das CMPs enjaulados é o único passo adicional para a cauda comum protocolos de injeção veia 19. A chave é injetar as sondas de peptídeos em um estado de um único fio uncaged e metaestável. O grupo gaiola impede CMP de auto-montagem e ligação para colagénios (Figura 2B), até que seja removido por luz de UV a que o ponto de CMP começa a dobrar-se em hélice tripla. A formulação injectável contém cisteína, que pode reagir rapidamente com o grupo gaiola clivada durante a irradiação de UV para minimizar a toxicidade. Inúmeros ratos com diferentes estirpes (por exemplo SKH-1 e DR-1) foram testados utilizando esta formulação, e não detectamos quaisquer defeitos de saúde comportamental ou outros nesses camundongos até seis meses. Se a injecção não se segue imediatamente após a exposição UV, as CMPs vai dobrar em hélices triplas homotrimérica, que não têm capacidade de hibridização. Figura 2C mostra um caso extremo, onde antes da injeção das CMPs foram totalmente remontada em hélices triplas por tempo de atraso longo (&gt; 2 dias). Para contornar este problema, solução CMP deve ser preparado em concentração relativamente baixa (por exemplo, ~ 40 mM), e injectado nos ratinhos imediatamente após UV-decaging. Devido à lenta taxa de hélice tripla dobragem das CMP em condições diluídas (metade do tempo de re-enrolamento:&gt; 50 min) e a exposição à radiação UV e curto tempo de injecção (5 ~ 7 total min), a maioria dos PGZC entram na corrente sanguínea em única vertente formulário quando este protocolo é seguido. Uma vez injectados, PGZC devem permanecer como cadeias simples, como a concentração é reduzida por um factor de 20 numa acumulação de sangue, levando a uma redução dramática na taxa de remontagem 18. Se a injeção é adiada (por exemplo, devido ao manuseio de animais) e é suspeito de redobramento homotrimérica, os peptídeos parcialmente montados pode ser reativado por aquecimento acima de 7076; C dissociar as CMPs para-cadeias simples, seguido de imediato resfriamento e injeção. Embora menos conveniente, tais CMPs dissociado ao calor também mostram resultados in vivo de segmentação (Figura 2D) esperado. Na presente demonstração, os ratinhos nus foram utilizadas para imagens de fluorescência de NIR porque até 50% do sinal de NIR pode ser bloqueada pelo cabelo. Quando se trabalha com modelos de ratos de cabelos (especialmente os com pêlos pretos), recomendamos raspar o mouse na região de interesse antes da imagem usando um barbeador elétrico ou removedor de pêlos. Na Figura 1, existem sinais de falsos positivos a partir da região abdominal do animal, o qual é causado por auto-fluorescência da clorofila na dieta dos animais. Tais sinais de fundo pode ser significativamente reduzida, passando o mouse para dietas purificadas cerca de 4 dias antes da imagem. Como pode ser visto nas Figuras 1 e 2A, existem fortes absorções CMP no piruetae. Portanto, para evitar artefactos resultantes injecções na veia da cauda imperfeitos, recomendamos a injecção na parte posterior da cauda de modo que o local da injecção não é capturada na imagem de fluorescência. A CMP rotulado permite segmentação e imagens de locais específicos de remodelação do colágeno in vivo que são difíceis de detectar por outros métodos. Por exemplo, o sangue e urina, ensaios baseados em ELISA são sensíveis para os fragmentos de colagénio telopéptido clivados, mas o método não pode localizar a fonte do turnover do colagénio, uma vez que tem como alvo antigénios solúveis. As principais limitações da técnica de imagem in vivo utilizando NIR rotulado CMPs são atenuação da profundidade de penetração e têmpera por proximais agrupados células vermelhas como hemoglobina é um supressor endógeno de 680/710 nm corantes NIR. As aplicações futuras da CMP em imagem in vivo incluem SPECT ou PET imagem usando CMPs marcados com radionuclídeos emissores de radiação gama, diretos ou com pósitrons emitters, para diagnóstico de estados de doença que envolvem a remodelação do colagénio (por exemplo, osteoporose, artrite, aterosclerose, e fibrose). Estes análogos CMP radiomarcados irá eliminar as limitações de perda de sinal, devido à profundidade de tecido quanto à presença de glóbulos vermelhos combinados, e irá permitir que as medições quantitativas de tecidos doentes. Além disso, o tempo de imagem relativamente tarde (por exemplo, 48-96 hpi) resultante da liberação de ligação e lenta de CMPs poderia tornar difícil acompanhar as mudanças rápidas na remodelação do colágeno. Essa limitação pode ser superada por mais engenharia da cinética de ligação e afinidade dos agentes de imagem CMP. Desde CMP liga a colágenos desnaturados que têm pouca estrutura, a imagem de colágeno baseado em CMP é complementar ao segundo microscopia geração harmônica que só pode imagem fibras de colágeno 5. Quando coloração cortes de tecidos com fluorescente etiquetado CMPs, descobrimos que é benéfico para incubar aAs amostras das soluções de péptido activado por UV, a 4 ° C, porque a hibridação de tripla hélice é facilitada a temperatura mais baixa de 1,20. Constatou-se também que a imersão das lâminas em tampão PBS fresco em uma tina de coloração é a maneira mais eficaz para lavar CMPs não ligados, o que funciona muito melhor do que simplesmente pipetagem tampões de lavagem sobre as amostras. A hibridização vertente CMP-colágeno é muito específico e robusto, por isso o protocolo de coloração simples apresentadas neste vídeo pode ser facilmente modificado para costaining biomarcadores adicionais, e para a identificação de colágenos degradadas em cortes de tecido não corrigidos. Isto é uma alternativa eficaz e conveniente para o uso de anticorpos anti-colagénio para a detecção de colagénios fibrosos em várias amostras histológicas.

O colagénio, a proteína mais abundante em mamíferos, desempenha um papel crítico no desenvolvimento e regeneração de tecidos, apoiando a proliferação e diferenciação de células. Enquanto colagénios fibrosos (por exemplo, tipo I, II), em tecidos conjuntivos dar resistência mecânica para os tecidos, o colagénio do tipo de rede (tipo IV) formam andaime de base da membrana basal em células de prender e formar tecidos organizados. Remodelação do colágeno envolve tanto a degradação do colágeno (por proteases) e síntese (promovido por fatores de crescimento). Apesar de remodelação do colágeno, por exemplo, em osso, é parte do processo normal de renovação dos tecidos, o excesso de atividade de remodelação, ou sua ocorrência em locais anormais, geralmente indica ferida resposta a uma lesão ou patologias crônicas, como câncer, osteoporose, artrite cura, e fibrose 1-4. A capacidade de colágenos imagem diretamente em remodelação in vivo pode levar a compreensão do progressoião destas doenças, bem como de novos diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, imagens ao vivo pode fornecer informações sobre a gravidade e o local de doenças, e também pode ser utilizado para avaliar a eficácia dos novos agentes terapêuticos. Microscopia de varredura a laser Multiphoton e geração de segundo harmônico foram aplicadas a colágenos fibrilares imagem para monitorar remodelamento da matriz extracelular em tumores em camundongos vivos 5. No entanto, esta técnica requer que os animais a serem montados com as câmaras de dobras cutâneas dorsal transparentes, o que é um procedimento invasivo. Imagem direta e não invasiva da remodelação do colágeno vai beneficiar de uma sonda que visa especificamente o colágeno em remodelação. Essa sonda é difícil de preparar, pois precisa distinguir os colágenos remodelação do colágeno intacta e maduros, que são abundantes em tecidos normais 6. O colagénio é constituído por estrutura de proteínas extremamente rara chamada tripla hélice, que éclivada por proteases, tais como metaloproteinases de matriz (MMP), durante a remodelação do colagénio. Os fragmentos de colagénio clivado perdem a sua estrutura de tripla hélice e tornam-se fios desdobradas (gelatina), que são ainda digeridos por proteases não específicas 1. Foi descoberto recentemente que o péptido mimético de colagénio (CMP), que tem a propensão para dobrar na estrutura helicoidal tripla pode visar especificamente cadeias de colagénio que estão dissociados do seu estado de tripla hélice por qualquer desnaturação ou por degradação enzimática de 1,7. A ligação é impulsionada principalmente pelo triple-hélice hibridação entre CMPs monoméricas e os fios de colágeno desnaturado. Porque PGZC auto-montar em hélices triplas homotrimérica à temperatura ambiente com pouca força de condução para a hibridação de colagénio, uma CMP enjaulado [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, designado como NB (GPO) 9, O: hidroxiprolina], foi desenvolvido , que contém uma nitrobenzilo foto-cliváveisgrupo (NB), fixado no centro de glicina do péptido. O grupo gaiola NB impede estericamente o CMP de dobragem em hélice tripla, ainda, a remoção do grupo gaiola por irradiação UV imediatamente desencadeia a dobragem de tripla hélice do colagénio e de hibridação 1. Quando CMPs monoméricas marcados com infravermelho próximo (NIR) fluoróforos são sistemicamente entregues para modelar ratos, eles podem objetivar especificamente e permitir in vivo de imagens de colágenos desnaturados em tecidos submetidos a normal (por exemplo, no osso e cartilagem) e patológico (por exemplo, em tumores) remodelando 1 . PGZC marcados com fluorescência também pode ser usado para imagiologia de colagénio em secções de tecido histológico. No estudo histológico, os tecidos colhidos são frequentemente preservados por fixação para manter os componentes celulares e morfologia do tecido geral de deterioração. Os procedimentos de fixação, que incluem o calor, e um tratamento com solventes orgânicos, e trans-linkin químicareagentes de g (por exemplo, paraformaldeído), desnaturar a estrutura helicoidal tripla de colagénio 8. Esta desnaturação gera locais para a CMP hibridação. Tem sido demonstrado que PGZC fluorescentemente marcadas podem ligar-se especificamente ao colagénio em secções de tecido fixado (por exemplo, pele, córnea, e osso) ainda mais eficaz do que o anticorpo anti-colagénio, o que permitiu a identificação fácil de condições patológicas em tecidos do fígado fibróticas 9. A CMP tem como alvo fios de colágeno desnaturado contendo seqüência de aminoácidos de motivos de tripla hélice, que é comum a todos os tipos de colágenos. Portanto CMP pode ser considerado um largo espectro do agente de coloração de colagénio. Aqui, apresentamos os procedimentos experimentais detalhados para i) imagiologia fios de colágeno desnaturado in vivo e ii) visualizando colágenos em cortes de tecidos ex vivo utilizando CMPs Caged fluorescente etiquetado. A tag NIR, IR680, foi conjugada com a CMP enjaulado para geração de imagens ao vivo, while carboxifluoresceína (FC) foi utilizado em tecido de trabalho de coloração para a sua compatibilidade com os microscópios de fluorescência padrão. Este protocolo centra-se na aplicação de imagem de CMPs como relacionados com a remodelação do colágeno. Métodos de síntese CMP pode ser encontrada nos relatórios anteriores 1,7,9-15. Neste relatório, vídeo, imagem tecidos esqueléticos em ratos normais e cortes de tecidos de rato córnea foram escolhidos para fins de demonstração, no entanto os métodos apresentados aqui podem ser facilmente aplicada a muitas patologias e modelos biológicos que envolvem a remodelação do colágeno (por exemplo, tumores, cicatrização de feridas), como bem como para praticamente qualquer amostra de tecido que contém o prefixo colagénios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

O colagénio é um componente estrutural principal da matriz extracelular que suporta a formação e manutenção dos tecidos. Embora a remodelação do colagénio é uma parte integrante da renovação do tecido normal, uma quantidade excessiva de actividade está envolvida na remodelação de tumores, da artrite, e em muitas outras situações patológicas. Durante a remodelação do colagénio, a estrutura helicoidal tripla das moléculas de colagénio é interrompido por proteases no meio ambiente extracelular. Além disso, os colagénios presentes em várias amostras de tecidos histológicos são parcialmente desnaturadas por os processos de fixação e de conservação. Portanto, esses fios de colágeno desnaturado pode servir como alvos eficazes para imagiologia biológica. Nós já desenvolveu um peptídeo mimético colágeno enjaulado (CMP), que pode ser de hibridizar com fios de colágeno desnaturado pela formação de estrutura de tripla hélice, que é exclusivo para colágenos acionada por foto. Os objetivos gerais deste procedimento são: i) a imagem fios de colágeno desnaturado resulting das atividades normais de remodelação in vivo, e ii) para visualizar colágenos em cortes de tecidos ex vivo utilizando as CMPs Caged acionada por fotos. Para conseguir a hibridação eficaz e bem sucedida in vivo e ex vivo de imagens, CMPs Caged fluorescente etiquetado são ou imediatamente antes da injeção intravenosa ativado por foto, ou são directamente accionados em cortes de tecido. Remodelagem do colágeno ósseo normal em camundongos nude e colágenos em cortes de tecido da córnea prefixadas rato são gravadas neste procedimento. O método de imagem baseado na tecnologia de hibridação de CMP-colagénio aqui apresentada poderia levar a uma compreensão mais profunda do processo de remodelação de tecidos, bem como a permitir o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico para doenças associadas com a actividade de remodelação elevado colagénio.

A Figura 1 mostra um resultado típico de como IR680-Ahx-(GPO) acionada por foto 9 distribui em um SKH1 fêmea rato nu saudável após 24-96 horas pós injeção. Ele mostra acumulação CMP aparente no esqueleto após 24 hpi, altura em que a maioria dos peptídeos não ligados foram em grande parte esvaziados. O processo de hibridação de CMP com os fios de colágeno remodelação parece ser relativamente lento, especialmente em contraste com outras sondas de imagem (por exemplo, péptido RGD 16). Isso provavelmente é por causa da taxa de dobramento lento da tripla hélice de colágeno 17,18. No entanto, uma vez hibridados, as cadeias CMP estão fortemente ligados aos tecidos colagenosos, com apenas uma ligeira redução do sinal é observada após 24 hpi (Figura 1). Em 96 hpi, a imagem de fluorescência de NIR o rato após a remoção da pele demonstra claramente a absorção do esqueleto de IR680-Ahx-(GPO) 9 na coluna vertebral e as costelas, bem como dentro dos joelhos, os tornozelos,pulsos e mandíbulas inferiores (Figura 2A). Em ex vivo coloração de tecidos, desencadeada foto-fluorescente-rotulados CMPs Caged hibridizar especificamente para fios de colágeno desnaturado em cortes de tecido. Na Figura 3, a coloração de CMP revela claramente as finas fibras de colagénio paralelas no estroma da córnea, o que demonstra a sua utilização como um agente de coloração específica de colagénio. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figura 1. Imagens de fluorescência NIR serial de um rato nu administrado por via intravenosa com foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 mostrando a absorção óssea ao longo de quatro dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width = &quot;4 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. NIR imagens de fluorescência de camundongos administrados com foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), enjaulado IR680-Ahx-NB (GPO) 9 sem exposição aos raios UV (B), pré-dobrados triple-helicoidal [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), ou dissociado ao calor única vertente IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) em 96 hpi após a remoção da pele. segmentação Skeletal pela CMP só pode ser observado em A e D. Sinais de fluorescência NIR são mostrados na escala do arco-íris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografias de fluorescência de uma co ratosecção de tecido rneal prefixado em paraformaldeído, e corados com DAPI e CF acionada por foto (GPO) 9 usando Protocolo 2, exibindo estroma colágeno denso (manchada pela CMP, em verde), bem como epitélio celular e endotélio (manchado por DAPI, em azul ) (barra de escala: 100 mm).

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Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Este procedimento demonstra in vivo perto IR imagens de fluorescência de atividades de remodelação do colágeno em ratos, bem como ex vivo coloração de colágenos em cortes de tecido usando enjaulados peptídeos de colágeno miméticas que podem ser foto-acionado para cruzar com fios de colágeno desnaturado.

Imagiologia desnaturadas colágeno Vertentes<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via foto desencadeada Hibridização do Caged Colágeno mimético Peptídeos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K visualizações.  University of Utah.  Este procedimento demonstra in vivo perto IR imagens de fluorescência de atividades de remodelação do colágeno em ratos, bem como ex vivo coloração de colágenos em cortes de tecido usando enjaulados peptídeos de colágeno miméticas que podem ser foto-acionado para cruzar com fios de colágeno desnaturado. 

Vídeo: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bioengenharia

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...