Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri 1R21AI094289'dan Igor V. Sharakhov'a verilen hibe ile desteklendi.

1) Lazer yakalama mikrodisksiyonu için politen kromozom slayt hazırlığı
<ol><li>Kan sonrası 25 saat beslenmede yarı gravid Anopheles kadınlarını parçalara ayırma. Yumurtalıkları yaklaşık beş dişiden 500 μl taze modifiye Carnoy çözeltisine (%100 metanol: buzul asetik asit, 3:1) 24 saat boyunca oda sıcaklığında sabitlayın. Uzun süreli depolama için yumurtalıkları -20 °C'ye aktarın.</li>
	<li>Kromozom slaytları yapmadan hemen önce Carnoy'un çözeltisini (%100 etanol: buzul asetik asit, 3:1) ve %50 propiyonik asit hazırlayın.</li>
	<li>Bir Zeiss 1.0 PET membran kaydırağına Carnoy çözeltisinin bir damlasına bir çift yumurtalık yerleştirin. Boyutuna bağlı olarak, yumurtalıkları diseksiyon iğneleri ile yaklaşık 2-4 bölüme bölün ve diseksiyon mikroskobu altında temiz slaytlarda% 50 propiyonik asit damlasına yerleştirin.</li>
	<li>Folikülleri ayırın ve diseksiyon stereomikroskopu altında kağıt havlu kullanarak kalan dokuyu çıkarın. Foliküllere% 50 propiyonik asit yeni bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika oturmalarını izin verin.</li>
	<li>Damlanın üzerine silikonize bir kapak kılıfı yerleştirin. Slaytı yaklaşık 1 dakika bekletin.</li>
	<li>Slaydı emici bir malzemeyle örtün (bu yöntem için filtre kağıdı kullanılır) ve bir kalemin silgi tarafını kullanırken, silgi ile tekrar tekrar dokunarak kapak ucuna bol miktarda basınç uygulayın.</li>
	<li>Politen kromozomlarının düzleştirilmesine yardımcı olmak için slaytı 15-20 dakika boyunca bir slayt denatürasyon / hibridizasyon sisteminde 60 °C'ye ısıtın. Asidin kromozomları daha da düzleştirmesini sağlamak için slaytları gece boyunca 4 °C'de nemli bir odaya yerleştirin.</li>
	<li>Slaytları 10 dakika boyunca soğuk% 50 etanol içine yerleştirin. Kapak kılıfını yavaşça çıkarın ve 10 dakika daha soğuk% 50 etanol değiştirin.</li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca% 70, % 90,% 100 etanolde dehidrat slaytlar. Hava kuru kaydıraklar.</li>
	<li>1 L damıtılmış suya tek bir tampon tablet ekleyerek gurr tampon çözeltisi çözeltisi hazırlayın. otoklav.</li>
	<li>50 ml GURR tampona 1 ml Giemsa boyama çözeltisi ekleyerek Giemsa çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Hava kurutulmuş slaytları Giemsa çözeltisine 10 dakika yerleştirin ve 1X PBS'de üç kez yıkayın. Hava kuru, kirlenmeyi önlemek için kontrollü steril bir iklimde tekrar kayar.</li>
</ol>2) Tek bir politen kromozom kolunun lazer yakalama mikro disseksiyonu
Bu bölümde PALM MicroBeam Lazer Mikrodiseksiyon sistemi ile birlikte gelen PALMRobo yazılımının kullanımı ayrıntılı olarak açıklanıyor. 
<ol><li>Mikroskobu % 100 etanol ile temizleyin. Eldivenleri ve tüpleri UV çapraz bağlantıda UV ışığıyla sterilize edin.</li>
	<li>PALM MicroBeam Lazer Mikrodiseksiyon mikroskobuna güç katın ve lazeri açın. Lazer diseksiyon paketi PALMRobo'yu açın ve "Güç" ve "Odak" ayarlarını gerektiği gibi yapılandırın.</li>
	<li>İlgi çekici politen kromozom kolunu arayın.</li>
	<li>"Kurşun Kalem" aracını kullanarak seçili bölgeyi anahat uzadı.</li>
	<li>Menü çubuğundan "Öğeler penceresini" açın.</li>
	<li>"Çizilmiş öğeyi" seçin, "Kes"i seçtiğinizden emin olun.</li>
	<li>Yapışkan kapak tüpünü tutucuya takın ve kaydırağın üzerine yerleştirin, <1 mm boyutunda küçük bir boşluk bırakın ve lazer kesimini başlatın.</li>
	<li>"Mancınık seçimini" kenar ve kromozom arasında boşluk bırakarak kesim bölgesine yerleştirin.</li>
	<li>Açılan seçenekten "LPC" yi seçin ve mancınıklamaya başlayın.</li>
	<li>"Göz" simgesine basarak numunenin kapağa mancınıkla atıldığından emin olun.</li>
</ol>3) DNA'nın tek bir mikrodissektif politen kromozom kolundan arındırılması
Toplanan DNA'yı serbest bırakmak ve arındırmak için QIAamp DNA Mikro Kiti'nin talimatlarını izleyin. Adım 3.1 ters tüpe uyacak şekilde değiştirildi. 
<ol><li>Ters boruya (kapağın içine) 15 μl Tampon ATL ve 10 μl proteinaz K ekleyin ve 3 saat boyunca 56 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>25 μl tampon ATL, 50 μl tampon AL ve 1 μl taşıyıcı RNA ekleyin; karıştırın. 50 μl% 100 EtOH ekleyin; karışım.</li>
	<li>Lisat'ı QIAamp sütununa aktarın; merkezkaç. 500 μl tampon AW1 ekleyerek yıkayın; merkezkaç. Sütunu yeni toplama tüpüne yerleştirin, 500 μl tampon AW2 ekleyin; merkezkaç. Sütunu yeni bir tüpe yerleştirin; fazla sıvıyı çıkarmak için santrifüj.</li>
	<li>Sütunu 1,5 μl mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve elute etmek için 20 μl su ekleyin; merkezkaç.</li>
	<li>Taze elflenmiş DNA'yı vakumla 9 μl'lik son hacme kadar buharlaştır.</li>
</ol>4) Tek bir mikrodissektif politen kromozom kolundan DNA'nın amplifikasyonu
Tek bir kromozom kolunun WGA'ları için iki farklı protokol kullanılmıştır. 
<ol><li>GenomPlex WGA ile DNA amplifikasyonu ve prob hazırlama<ol>
<li>İlk güçlendirilmiş DNA grubunu üretmek için GenomePlex Tek Hücreli WGA4 Kit protokolünü izleyin:<ol>
<li>9 μl numuneye taze hazırlanmış Proteinaz K çözeltisi ekleyin; karıştırın. DNA'yı 1 saat boyunca 50 °C'de kuluçkaya bırakın, ardından 4 dakika boyunca 99 °C'ye ısıtın. Buzda kal.</li>
			<li>2 μl 1X Tek Hücreli Kütüphane Hazırlama Tamponu ve 1 μl Kütüphane Stabilizasyon Çözümü ekleyin; karıştırın. Numuneyi 2 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın. Buz ve santrifüj üzerinde serin.</li>
			<li>1 μl Kütüphane Hazırlama Enzimi ekleyin; karıştırın ve santrifüj. Aşağıdaki gibi kuluçkaya yaslanın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>7,5 μl 10X Amplifikasyon Ana Karışımı, 48,5 μl su ekleyin. 5.0 μl WGA DNA Polimeraz; karıştırın ve santrifüj.</li>
			<li>Termosikül aşağıdaki gibidir: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Genomik DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı Kiti kullanarak DNA'yı arındırın. Protokol aşağıdaki gibidir:<ol>
<li>5:1 DNA bağlama tamponu ekleyin:DNA örneği (özellikle 2 kb'den az genomik DNA için). Örnek DNA 2 kb'den büyükse, 2:1 oranı kullanın) ve sağlanan spin sütununa aktarın. merkezkaç.</li>
			<li>200 μl DNA Yıkama Tamponu ve santrifüj ekleyin. Yıkama adımlarını tekrarlayın. Ardından, 50 μl su ekleyin ve DNA'yı yeni bir 1,5 ml'lik tüpe dökin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GenomPlex WGA3 Reamplification Kitini kullanarak örnek DNA'yı aşağıdaki gibi yeniden güçlendirin:<ol>
<li>PCR tüpüne 10 μl DNA ekleyin (kit toplam 10 ng DNA önerir) 49,5 μl su, 7,5 μl 10x Amplifikasyon Ana Karışımı, 3,0 μl 10 mM DNTP karışımı ve 5,0 μl WGA DNA Polimeraz. Karıştırın ve santrifüjlayın.</li>
			<li>Reaksiyon için aşağıdaki profili kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>DNA'ları -20 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>GenomePlex WGA3 Reamplification Kitini kullanarak FISH için ETIKET DNA'sı aşağıdaki gibi:<ol>
<li>49,5 μl su ile PCR tüpüne 10 μl DNA ekleyerek GenomePlex WGA3 Reamplification Kitinden bir ana karışım oluşturun, 7,5 μl 10X Amplifikasyon Ana Karışımı, 3,0 μl 1 mM dNTP karışımı (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - etiketli dUTP kullanıyorsanız), 1 μl 25 nM etiketli dUTP ve 5.0 μl WGA DNA Polimeraz.</li>
			<li>Reaksiyon için aşağıdaki profili kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Etanol, 3 M Sodyum Asetat pH 5.2 ve %100 etanol 2-3 hacimli son reaksiyon hacmini (75 μl reaksiyon için 7.5 μl) 1/10 ekleyerek etiketli probu çökeltir. DNA örneğini -80 °C'de en az 30 dakika soğutun.</li>
			<li>Etiketli pelet oluşturmak ve süpernatant ve hava kuru pelet kaldırmak için 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj örneği.</li>
			<li>Karmalaştırma arabelleği aşağıdaki gibi oluşturun: 0.2 g Dektran Sülfat 1200 μl Deiyonize formamid 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Havayla kurutulmuş pelete 40 μl hibridizasyon tamponu ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>REPLI-G Tek Hücreli WGA ile DNA amplifikasyonu ve prob hazırlama ve ardından nick çevirisi<ol>
<li>Güçlendirilmiş DNA'yı üretmek için REPLI-g Tek Hücreli WGA Kiti protokolünü izleyin:<ol>
<li>Tampon D2 'si (3 μl 1 M DTT + 33 μl Tampon DLB) hazırlayın.</li>
			<li>4 μl saflaştırılmış mikrodisektif malzemeyi 3 μl Buffer D2 ile karıştırın. Karıştırmak için fiske tüpü. 65 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır. 3 μl Stop çözümü ekleyin; karışım.</li>
			<li>Numuneye 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g Reaksiyon Tamponu ve 2 μl REPLI-g DNA Polimeraz ekleyin. 8 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. DNA polimerazini 3 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtarak etkisiz hale getirin. DNA'ları -20 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>REPLI-g güçlendirilmiş DNA'yı etiketlemek için nick çeviri protokolünü izleyin:<ol>
<li>Aşağıdaki etiketleme karışımını hazırlayın: 1 μg güçlendirilmiş DNA 5 μl 10X DNA Polimeraz Tampon 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Etiketli dNTP 4 μl 1 U/μl İNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polimeraz I H2O ila 50 μl</li>
			<li>15 °C'de 2 saat kuluçkaya yatır. Reaksiyonun durdurulması için 2 μl 0,5 M EDTA ekleyin. Jel üzerinde çalıştırarak DNA parça boyutunu kontrol edin.</li>
			<li>Peleti çökeltmek ve çözünürlük hale getirmek için 4.1.4.3-4.1.4.6'dan adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) Politen ve mitotik kromozom kabak preparatları üzerinde 2D BALIK
Lütfen politen kabakları 47 ve mitotik kromozom slaytlarının preparatları hakkında FISH için ayrıntılı protokollere bakın 48. Burada kısa protokoller sunuyoruz.
<ol><li>Politen kromozomu kabak preparatları üzerinde BALIK<ol>
<li>RT'de slaytları 20 dakika boyunca 1X PBS'ye daldırın.</li>
		<li>Etanol yıkamalarında susuzluk kayar: %50, %70, %90, RT'de her biri 5 dakika boyunca %100.</li>
		<li>Probu 37 °C'de hibridizasyon tamponunda önceden ısıtın. Kaydırmak için 10-20 μl prob ekleyin. 22 X 22 mm kapaklı kapaklı kapak. Pipet ucu kullanarak hava kabarcıklarını bastırın.</li>
		<li>Denatüre kromozomları ve prob 90 °C'de 10 dakika boyunca. Kapak kenarlarını kauçuk çimento ile kapatın. Slaydı nemli odaya aktarın ve bir gecede 39 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Slaytları 39 °C'de 1X SSC ile 20 dakika boyunca yıkayın. Slaytları RT'de 1X SSC ile 20 dakika boyunca yıkayın. Slaytları 1X PBS'de durulayın, ardından DAPI ile Uzun süreli solmaya karşı ekleyin. Kapakçıkla örtün ve görselleştirmeden önce en az bir saat boyunca 4 °C'de slayt kutusunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitotik kromozom kabak preparatları üzerine FISH<ol>
<li>An. gambiae'nin4.</li>
		<li>FISH'e uygun kromozom slaytları hazırlayın.</li>
		<li>Bir tüpteki hibridizasyon tamponuna 2-3 μl etiketli DNA probu ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Prob karışımının 10 μl'lik kısmını slayda uygulayın ve 22 X 22 mm kapaklı kapakla örtün. Pipet ucu kullanarak hava kabarcıklarını bastırın.</li>
		<li>Karşı koyma ve algılama için, dapi ile uzun süreli solmaya karşı uygulama hazırlığına uygulayın ve görselleştirmeden önce en az bir saat karanlıkta tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) Tüm mount yumurtalık dokusu üzerinde 3D BALIK
<ol><li>Aşağıdaki Arabellek A karışımını hazırlayın: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidin 0,15 mM Spermin 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM BORULAR</li>
	<li>Kapak kılıflarının boyutuna uyacak şekilde kare desenli bir çivi parlatıcısı katmanı ekleyerek slaytları nükleer görselleştirme için hazırlayın. Bu, gelecekte kapak ucuna yerleştirirken çekirdeklerin ezilmesini önlemek için yükseltilmiş bir yüzey oluşturur.</li>
	<li>Christopher'ın evre 3 dişilerinden taze yumurtalıkları parçalara ayrıştırın ve % 0,5 digitonin ile 150-250 μl Tampon A çözeltisinde tutun. Foliküler zarı yok etmek için foliküller üzerinde (%0,5 digitoninli A Tamponlu tüpte) daha büyük diseksiyon iğnesi çalıştırın.</li>
	<li>Folikülleri daha fazla rahatsız etmek için 5-10 dakika boyunca girdap. Dakikada ~500 devir (RPM) en düşük ayarda 30 saniye boyunca büyük foliküler parçaları ve santrifüj tüpünü kazıyın. Süpernatantı yeni bir 2 ml Eppendorf tüpüne aktarın ve 100 μl Tampon A ekleyin.</li>
	<li>Her iki tüpü de 2.000 RPM'de 10 dakika döndürün. Her iki tüpte de süpernatant atın. Not: Her iki tüp de son nükleer görselleştirme slaytlarını yapmak için kullanılacaktır. Toplanan süpernatant içeren tüp öncelikle çıkarılmış çekirdek içermelidir, doku ile orijinal tüp ise hemşire hücrelerine gömülü doku ve çekirdek karışımı içerecektir. 200 μl Tampon A – % 0,1 Triton ekleyin ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. 10.000 RPM'de (10.621 x G) 5 dk santrifüj ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>PBS'ye 200 μl %4 Paraformaldehit ekleyin. Termomikserde 30 dakika kuluçkaya yatırın, 450 RPM'de karıştırın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) 5 dakika santrifüj ve süpernatant çıkarın. Termomikserde 450 RPM'de karıştırarak 5 dakika boyunca % 0,1 Triton ile Tampon A ile yıkayın. 5.000 RPM'de (2.655 G) 5 dakika santrifüj ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Tüpe önceden ısıtılmış 37 °C etiketli prob ekleyin. Termomikserde 95 °C'de denature, 450 RPM'de 10 dakika karıştırılır. 80 °C'de denatürasyona devam edin ve karıştırmaya devam edin. Termomikserde 37 °C'de kuluçkaya yatırın, bir gecede 450 RPM karıştırın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) santrifüj 5 dk. Üsttant kaldırın.</li>
	<li>Tampon A ile 5 dakika boyunca% 0.1 Triton ile yıkayın. 5.000 RPM'de (2.655 x G) santrifüj 5 dk. 2 kez tekrarlayın. DAPI ile Uzun Süreli Solmaya Karşı damla uygulayın.</li>
	<li>Çekirdek/ DAPI çözeltisini dikkatlice boruleyin (kabarcıklardan kaçının), slayta uygulayın ve kapakla örtün.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikrodisektif politen kromozom örneklerinden DNA'yı başarıyla yükseltmek için kritik olan birden fazla adım vardır. Protokol, hem genel verimliliği artıran hem de fiziksel araçların örnekle etkileşimini kaldırarak yabancı DNA'ya maruz kalmayı azaltan bir yöntem olan LCM'nin kullanımını kullanır. Bununla birlikte, yabancı DNA'nın amplifikasyonu hala bu deneyin en büyük potansiyel tuzaklarıdır. Bu nedenle, tüm süreç boyunca, numunelerin kirlenmeye karşı korunması esastır. Slayt hazırlama ve mikrodiseksiyon aşamaları boyunca, etanol yıkama diseksiyon iğneleri, slaytlar, kapak kaymaları ve çalışma alanı için gereklidir.  Ayrıca, UV'nin kullanımdan önce tüm uygulanabilir ekipmanları (iğneler, slaytlar, kapaklar) tedavi etmesi önerilir.
Diseksiyon slaytlarındaki zar, kromozomların yayılmasını çok zorlaştırır.  Bu slaytları yaparken daha fazla yumurtalık (yarım ila tam bir yumurtalık çifti) kullanmak, iyi yayılmış bir çekirdek bulma şansını sağlamak için önemlidir.  Ayrıca, 49 yaşındaki dokular ve kromozom yayılımları daha zor hale geldikçe amplifikasyon oranları düştüğü için slayt yaparken taze doku kullanılması önerilir.  Slaytların mikrodiseksiyon için hazırlanması, bu protokolde en çok zaman alan adımdır.  İstenmeyen malzemenin kazara edinilmesini önlemek için kromozomlar iyi yayılmalıdır.  Giemsa boyama, kullanıcının mikroseksiyon sistemini kullanmadan önce bir faz kontrast mikroskobu ile yayılma kalitesini kontrol etmesini sağlar.
Mikrodiseksiyon ve amplifikasyonun kombinasyonu, küçük ilgi çekici bölgelerden kolların çoğunluğuna kadar boyut olarak değişen kromozomal parçaları çıkarma ve analiz etme fırsatı sağlar.  Bu protokol, kullanıcının inversiyonlar, spesifik ökromatik bantlar ve interbandlar, telomerik, merkezkorik ve interkalary heterokromatin gibi morfolojik olarak farklı bölgelerden DNA elde etmesine izin verir. Kullanıcı, oluşturulan resim problarını anormal kromozomları incelemek, belirli bir loci'de türler arası homolojiyi incelemek veya sağlam bir 3D çekirdekte kromozomların mekansal organizasyonunu karakterize etmek için uygulayabilir. Kromozom boyaları geliştirmek için, tekrarlayan DNA'nın birden fazla kromozomal bölge ile melezleşmesini önlemek için ökromatik segmentler seçtik. Sonuç olarak, total genomik DNA veya C0 t-1DNA fraksiyonu gibi bir rakip kullanmadan kola özgü bir tablo elde ettik.
GenomPlex WGA ve REPLI-G kitlerini, birden fazla amplifikasyon kitinin verimliliğini ve bırakma oranını karşılaştıran incelemelere dayanarak kullanmayı seçtik 40,44.  Her iki kit de her iki bırakma oranında da mevcut yöntemler arasında en iyi performansı gösterdi (GenomePlex, REPLI-g'nin% 37.5'ine kıyasla% 12.5'lik bir orana sahipti) ve yükseltilmiş belirteçlerin yüzdesi (GenomPlex% 45.24 amplifikasyon oranına sahipti ve REPLI-g'nin% 30.0'ı) 40. GenomPlex kiti ayrıca daha yüksek miktarda DNA sağladı ve böylece birden fazla aşağı akış tekniği için daha iyi bir aday haline getirdi.  GenomPlex sistemi için DNA'nın daha da yükseltilmesini sağlayan bir yeniden amplifikasyon kiti de mevcuttur. Ancak, amplifikasyonun mükemmel olmadığını belirtmek önemlidir.  Başarılı amplifikasyonun hatalara yol açabilir veya hedef DNA'daki belirli bir loci'ye karşı önyargılı olma olasılığı devam etmektedir. Mevcut genom amplifikasyon yöntemlerinin son parça boyutunu göz önünde bulundurmak önemlidir.  GenomPlex parçalanması, 200-500 bp arasında değişen parçalara sahip bir kitaplıkla sonuçlanırken, REPLI-g kiti yaklaşık 10-20 kb boyutunda parçalar üretir. Bu protokolün amaçlanan aşağı akış uygulaması FISH'tir, böylece GenomPlex kiti istenen parça boyutunu ve DNA parçalarını doğrudan WGA aracılığıyla etiketleme yeteneğini sağladığı için daha uygulanabilir bir seçenek haline getirir. REPLI-g amplifikasyonu tarafından üretilen uzun DNA molekülleri aşağı akış nick çevirisi etiketleme reaksiyonunda parçalanmalıdır.
Bu protokol, tek bir politen kromozom kolundan DNA'yı başarıyla yükseltmek için uyarlanmıştır.  Diğer protokoller, örnek 7 , 11,28,40'ı başarıyla yükseltmek için birçok (tipik olarak10-30)kromozom parçasının birikmesini gerektirir.   Yöntemimizi kullanarak birden fazla kromozomun birleştirilmesi mümkün olsa da, numune kontaminasyon olasılığının artması, deneye mümkün olduğunca az kromozomla başlamanın önemini vurgulamaktadır. Politen kromozomları mevcut değilse, protokolümüz mitotik kromozomlarda kullanılmak üzere uyarlanabilir. Bununla birlikte, başarılı FISH 11 için amplifikasyondan önce 10-15 mitotik kromozom havuza almak gerekebilir. Amplifikasyon önyargısı, yüksek miktarlarda başlangıç şablonu DNA 50ile daha düşüktür. Politen kromozomları tek bir DNA dizisinin yaklaşık 512 kopyasını ve iki homolog DNA dizisinin 1024 kopyasını sağlar.  Bu nedenle, mitotik kromozomların havuza edilmesi, amplifikasyondan sonra DNA ürününün genel kalitesini artırmaya yardımcı olacaktır.
Bu prosedür sitogenetik ve genomik çalışmalarda birçok potansiyel kullanıma sahiptir. Burada, An. gambiae'de politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik segmentleri arasındaki yazışmaları kurmak için kromozom boyaları kullandık. Aynı boyama probları An. gambiae hücre çizgilerinin sitogenetik karakterizasyonuna uygulanabilir. Kromozom sayılarındaki kapsamlı genomik yeniden düzenleme ve değişiklikler hücre hatlarının ortak özellikleridir 51,52. Farklı sivrisinek hücre hatlarında translokasyonlar, inversiyonlar, delesyonlar ve halka kromozomları gibi aneuploidi, poliploidi ve kromozomal yeniden düzenlemeler tespit edilmiştir 53,54. Klasik sitogenetik gözlemler 55 ve fiziksel haritalama 56, sıtma sivrisineklerinin evriminde tam kol kromozomal translokasyonların meydana gelmesini göstermiştir. Bu nedenle, mikrodiseksiyonlu malzeme, türler arasındaki kromozomal bölgelerin homolojisini karşılaştırmak için FISH deneyleri ile birlikte kullanılabilir. Tüm mount yumurtalık hemşire hücrelerindeki politen kromozomları üzerinde 2R boyama probu ile 3D FISH'i başarıyla gerçekleştirdik. Bu yöntem kromozom yörüngelerinin izlenmesini ve Anopheles'tekinükleer mimarinin incelenmesini kolaylaştıracaktır. DNA genotipleme 57,58,yeni nesil genom dizilimi 26, 27,fiziksel ve bağlantı haritası geliştirme ve kromozom boyama 33,59 için probların üretimi gibi teknikler kol ve bölgeye özgü mikrodiseksiyondan yararlanabilir. LCM teknolojisini birleştirerek ve tek hücreli WGA'yı ilerleterek, tek bir politen kromozom kolundan makul miktarlarda DNA üretmek için verimli, pratik bir yöntem gösteriyoruz.

Kromozom boyama, karyotiplerin 1-5 evrimini incelemek ve floresan etiketli kromozomal DNA 1,6-8'inmelezlenmesi yoluyla sitogenetik anormallikleri görselleştirmek için yararlı bir tekniktir. Bu yöntem ayrıca, 9 ve patoloji 10gelişiminde kromozom bölgelerinin 3D dinamiklerinin incelenmesi için de uygulanır. Farklı etiketli kromozom boyaları, bireysel mitotik 11 , 12,meiotik13, 14veya interfaz politen olmayan15, 16ve politen 9,11 ,17 kromozomlarının görselleştirilmesi için kullanılır. Kromozom boyaları elde etmek için basit ve sağlam bir protokol, bu tekniği sivrisinekler gibi model olmayan organizmalara genişletmede çok yararlı olacaktır. Anopheles gambiae kompleksi, sıtmayı iletme yeteneği de dahil olmak üzere davranış ve adaptasyonda değişen yedi morfolojik olarak ayırt edilemeyen sivrisinek grubudur.  Bu sivrisinekler, vektörel kapasitelerinde büyük farklılıklar gösteren yakından ilişkili türlerin evrimini daha iyi anlamak için mükemmel bir model görevi görer.  Sıtma sivrisineklerinde çoğu sitogenetik çalışma iyi gelişmiş, yüksek politenize kromozomlar kullanılarak yapılmıştır (18,19'dagözden geçirilmiştir). Politen kromozomlarının okunabilir bantlama desenleri, araştırmacıların Anopheles gambiae 20'depolimorfik inversiyonlar ve ekolojik adaptasyonlar arasındaki ilişkiyi göstermelerini sağladı. Ayrıca, 3D politen kromozom organizasyonunun dokuya özgü 21 ve türe özgü 22 özelliği An. macullipennis kompleksinde karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, mitotik kromozomların incelenmesi ek önemli bilgiler sağlayabilir. Örneğin, mitotik kromozomlarda gözlenen daha yüksek bir heterokromatin polimorfizmi seviyesi, An. gambiae 23'teçiftleşme aktivitesinin ve doğurganlığın azalmasıyla ilişkilendirilmiştir. Politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik segmentleri arasındaki yazışmaları ancak göreceli uzunlukları karşılaştırılarak kurmak zor olabilir. Bunun nedeni, heterokromatin'in mitotik kromozomların önemli bir kısmını oluşturur, ancak politen kromozomlarında yeterince temsil edilmemektedir 24. Sıtma sivrisinekleri için kromozom boyalarının mevcudiyeti, araştırmacıların ek türleri dahil ederek sitogenetik çalışmaları önemli ölçüde genişletmelerine izin verirken, bu epidemiyolojik olarak önemli böcekler grubundaki karyotipik evrim ve kromozomların 3D dinamiklerinin analizlerindeki maliyeti ve zamanı önemli ölçüde azaltacaktır.
Büyük kromozom esnemeleri elde etmek için, mikrodiseksiyon kromozomal tamamlayıcının belirli ilgi alanlarını manipüle etmek ve izole etmek için ayrılmaz bir teknik haline gelmiştir.  Tüm genom amplifikasyonu (WGA) ile birleştiğinde, mikrodiseksiyon FISH 11 , 12ve yeni nesil genom dizilemesi 25-27dahil olmak üzere güçlü aşağı akış uygulamaları ile sonuçlanır. Daha önce, teknik deneyimli bir kullanıcı tarafından manuel olarak kontrol edilmesi gereken özel mikrodiseksiyon iğnelerinin kullanılmasını gerektiriyordu 28.  Lazer yakalama mikroseksiyonunun (LCM) ilerlemesi, kontaminasyon riski azalmış olan 29, 30veya bireysel kromozomları 31-33 tek hücreleri izole etmek için daha uygun basitleştirilmiş bir aletle sonuçlanmıştır. Bu yaklaşım, kullanıcının birden fazla hücreyi bir araya getirmekten kaynaklanan bir konsensüs manzarası yerine, tek hücrelerde meydana gelen genetik heterojenlikleri ve kromozomal anormallikleri incelemesine izin verir 34-36. Mikrodiseksiyondan üretilen DNA'yı güçlendirmek için birden fazla yöntem kullanılmıştır.  Dop-PCR, son derece tekrarlayan dizilerin amplifikasyonu için yararlı bir teknik, çekirge 37, dikenli yılan balığı 38 ve Nil tilapia 39dahil olmak üzere türlerden mikrodissected kromozomları yükseltmek için kullanılmıştır.   Daha yakın zamanda, PCR tabanlı GenomPlex WGA4 Tek Hücre kiti ve çoklu yer değiştirme amplifikasyon tabanlı (MDA) Repli-G Tek Hücre kiti, tek insan hücrelerinin genetik analizinin yanı sıra kromozomların40-42, çekirge 37 ve çekirgelerdeki B kromozom sistemleri de dahil olmak üzere deneyler için değerli araçlar haline gelmiştir. Bu iki kitin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır, ancak mevcut diğer amplifikasyon sistemlerinden daha belirgin üstünlükleri gösterilmiştir 44.
Tek bir kromozomdan veya kromozom segmentinden elde edilebilen DNA miktarı, tüm çekirdeğinkinden önemli ölçüde daha azdır. Bu nedenle, özellikle Drosophila veya Anophelesgibi küçük genomlara sahip organizmalarda mikrodiseksiyon, amplifikasyon ve daha sonra tek bir kromozomun analizi çok daha zordur.  Boyalar bir insan 33 ve bir yabanatı 45'intek mikrodisektif kromozomlarından geliştirilmiş olmasına rağmen, başarılı bir FISH deneyi bir meyve sineğinin birden fazla (en az 10-15) mikrodisetik kromozomunu gerektirdi 11. Bununla birlikte, tek bir kromozomu mikrodisisetleme ve güçlendirme yeteneği, (i) farklı bir kromozomdan elde edilen malzeme ile kontaminasyon şansını azaltmak, (ii) mikrodiseksiyon için gerekli kromozomal preparatların sayısını en aza indirmek, (iii) mikrodisektif numunenin nükleotid ve yapısal polimorfizmini hem FISH hem de aşağı akış uygulamalarında sıralamak için önemli olacaktır. Birçok Dipteran türünde bulunan politen kromozomları, çok daha yüksek bir başlangıç DNA miktarı elde etmek için eşsiz bir fırsat sunar. Ayrıca mitotik kromozomların kullanımı ile elde edilemeyen daha yüksek çözünürlük ve kromozom yapısı sağlarlar. Bu eklenen çözünürlük, kromozomal yeniden düzenlemelerin, kromatin yapısının ve kromozomal segmentlerin mikrodissected 28,46olarak görselleştirilmesinde kritik olabilir.
Burada, tek bir politen kromozom kolundan bir ökromatik segmenti verimli bir şekilde izole etmek, DNA'yı yükseltmek ve sıtma sivrisineklerinde aşağı akış BALIK uygulamalarında kullanmak için bir prosedür sunuyoruz.  İlk olarak, özel olarak hazırlanmış membran slaytlarından tek bir kromozom kolunu izole etmek ve çıkarmak için LCM uyguluyoruz. İkinci olarak, WGA mikrodisected malzemeden DNA'yı yükseltmek için kullanılır. Üçüncü olarak, FISH deneylerindeki güçlendirilmiş DNA'yı politen kabağı preparatları 47, metafaz ve interfaz kromozomu slaytları 48ve ayrıca 3D yumurtalık bütün montaj örneklerine melezleriz. Bu prosedür, ökromatin çoğunluğunu An. gambiae kromozomal kollarında başarıyla boyamak için yapılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

Tüm kol kromozom problarının floresan yerinde hibridizasyonu (FISH), genomik ilgi alanlarını haritalamak, kromozomal yeniden düzenlemeleri tespit etmek ve hücre çekirdeğindeki kromozomların üç boyutlu (3D) organizasyonunu incelemek için sağlam bir tekniktir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ve tüm genom amplifikasyonunun (WGA) ortaya çıkması, tek hücrelerden büyük miktarlarda DNA elde edilmesini sağlar. WGA kitlerinin artan duyarlılığı, kromozom boyaları geliştirmemize ve model olmayan organizmalarda kromozom organizasyonuni ve evrimini keşfetmek için kullanmamıza neden oldu. Burada, Afrika sıtma sivrisinek Anopheles gambiaeyumurtalık hemşire hücrelerinden tek politen kromozom kollarının ökromatik segmentlerini izole etmek ve yükseltmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, kromozom boyaları elde etmek için verimli bir platform sağlarken, numuneye yabancı DNA'nın sokulma riskini azaltır. WGA kullanımı, 2D ve 3D FISH de dahil olmak üzere birden fazla deney için kullanılabilecek yüksek miktarda DNA ile sonuçlanan birkaç yeniden amplifikasyon turuna izin verir. Geliştirilen kromozom boyalarının, An. gambiae'depoliten ve mitotik kromozom kollarının ökromatik kısımları arasındaki yazışmaları kurmak için başarıyla kullanılabileceğini gösterdik. Genel olarak, LCM ve tek kromozom WGA'nın birleşmesi, gelecekteki sitogenetik ve genomik çalışmalar için önemli miktarda hedef DNA oluşturmak için etkili bir araç sağlar.

Şekil 1, bu makalede açıklanan protokolün genel akışını açıklar.  Kullanıcı başlangıçta membran slaytlarından kromozom DNA örneklerini mikro olarak ayrı göstererek başlar.  Mikrodissected malzeme çıkarılır ve saflaştırilir. Saflaştırılmış DNA daha sonra yükseltilir, yeniden yükseltilir, etiketlendi ve daha sonra FISH için kromozom yayılımlarını etiketlemek için kullanılır.
LCM protokolü üç genel adıma ayrılabilir: 1) İlgi çekici kromozomların bulunması ve bölgenin kesime hazırlanması (Şekil 2A), 2) İlgi çekici kromozom bölgesinin lazerle kesilmesi ve mancınık yapılması (Şekil 2B) ve 3) Numunenin gerçekten yapışkan kapağa mancınık olup olmadığının kontrol edilmesi (Şekil 2C). An. gambiae Sua sua sutene kromozomlarında kullanılan LCM işlemi Video 1'de gösterilmiştir. Video, önemli yazılım işlevleri ve ipuçları da dahil olmak üzere programın başlangıcından itibaren tüm süreci detaylandırıyor.
Bu protokolde kullanılan GenomPlex ve REPLI-g tek hücreli WGA kitleri, ortaya çıkan ürün büyüklüğünün yanı sıra genel verim açısından da büyük farklılıklar gösterir.  Şekil 3, GenomPlex ve REPLI-g kitleri için yürütülen jel elektroforezi sonuçlarını ve örneklerin Nanodrop tarafından nicelleştirilmesini göstermektedir.
Mikrodisektif malzeme, kromozomun ökromatik bölgelerini hedefleyen FISH probları oluşturmak için kullanılmıştır.  Şekil 4, An. gambiaepoliten kromozomları üzerinde mikrodisektif malzemeden üretilen beş probun FISH'ini göstermektedir.  WGA3 kiti kullanılarak dört otozomal kol üç floroforla etiketlenmiştir: 3R kromozomu yeşil (floresan), 3L kromozom kırmızı (Cy-3) ve sarı (Cy-5), 2R kromozom sarı (Cy-5) ve 2L kromozom kırmızı (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. X kromozomu, ayrı bir deneyde REPLI-g materyalinin nick çevirisi kullanılarak turuncu (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. Politen ve mitotik kromozom kollarının ökromatik kısımları arasındaki yazışmaları kurmak için kromozom boyaları An. gambiae'nin ara faz, profaz, prometafaz ve metafaz kromozomlarına melezlenmiştir (Şekil 5).  Hücre çekirdeğindeki tek bir politen kromozom kolunun 3D organizasyonunu görselleştirmek için, tüm mount FISH, An. gambiae Sua strain yumurtalık hemşire hücrelerine yapıldı (Video 2).  Farklı kromozom kol bölgeleri nüklelerde interfaz (Şekil 5D) ve politen (Video 2) kromozomları ile açıkça görülmektedir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Şekil 1. Kromozom boyalarının hazırlanmasına yönelik deneysel prosedürlerin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Şekil 2. Kromozom mikroseksiyonunda önemli adımlar. A) Membran yoluyla ilgi çekici kromozomal bölgenin lazer destekli kesilmesi. B) Mancınık işleminden sonra delikli zar. C) Yapışkan kapağa bağlı olarak içinde kromozomal bir segment bulunan membran mancınıklı parçasının görünümü. Ok, slaytta kalan X kromozomunun heterokromatinini gösterir. Yıldız işareti, slaytta kalan başka bir kromozomun bir parçasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Şekil 3. WGA'dan sonra DNA gösteren agarose jel görüntüleri. A) WGA4 ve WGA3 GenomPlex kitlerini kullandıktan sonra kol 3R'den düşük moleküler ağırlık (200-500 bp) DNA. B) REPLI-g amplifikasyonundan sonra kol 2L'den yüksek moleküler ağırlık (10-20 kb) DNA. 100 bp merdiven sol şeritlerde gösterilir. Jel görüntülerin altındaki tablolarda Nanodrop ile ölçülen DNA konsantrasyonları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Şekil 4. Mikrodisektif malzemeden üretilen dört prob kullanılarak An. gambiae'nin yumurtalık hemşire hücrelerinden politen kromozomlarının boyanma. X kromozomu, REPLI-g malzemesinin nick çevirisi ile turuncu (Cy-3) olarak etiketlenmiştir. 2R kol sarı (Cy-5) ile etiketlenmiştir; 2L kol kırmızıdır (Cy-3); 3R kol yeşil (floresan) olarak etiketlenmiştir; 3L kol kırmızı (Cy-3) ve sarı (Cy-5) karışımında etiketlenmiştir. Otomatikleştirmeler WGA3 amplifikasyon kiti ile etiketlenmiştir. Kromatin mavi (DAPI) ile boyanmıştır. Kromozom isimleri telomerik bölgelerin yakınına yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Şekil 5. An. gambiae Mopti suşunun larval imaginal disklerinden interfaz (A), profaz (B), prometaphaz (C) ve metafaz (D) kromozomlarının WGA3 tarafından etiketlenmiş mikrodissected malzemeden oluşturulan üç prob kullanılarak boyanır. 2R kol yeşil (floresan) ile etiketlenmiştir; 2L kol etiketsizdir; 3R kol pembe, kırmızı (Cy-3) ve turuncu (Cy-5) karışımındadır; 3L kol turuncu (Cy-5) olarak etiketlenmiştir. X kromozomu 18S rDNA probuna karşılık gelen kırmızı bir etikete sahiptir. Kromatin mavi (DAPI) ile boyanmıştır. Kromozomların parlak lekeli bölgeleri heterokromatin'e karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
Video 1. An. gambiae politen kromozomlarının LCM süreci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Video 1'i görüntülemek için tıklayınız.</a>
Video 2. Tüm mount 3D FISH, An. gambiae yumurtalık hemşiresi hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Prob Cy-3 (mavi ile tasvir edilir) ile etiketlenmiştir ve mikrodissected 2R kromozom kolundan yapılmıştır.  Kromatin DAPI ile boyanmıştır ve siyan sahte renklendirme (açık mavi) ile tasvir edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Video 2'yi görüntülemek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Görüntüleme.  Virginia Tech. Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Video: 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Bir bakteriyel yapay kromozom cDNA klon rekombinant Zika virüs kurtarma

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...