Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dei National Institutes of Health 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov

1) Preparazione dello scivolo cromosomico di Polytene per la microdisezione di cattura laser
<ol><li>Seziona le femmine di anopheles semi-gravide a 25 ore di alimentazione post-sangue. Fissare le ovaie di circa cinque femmine in 500 μl di soluzione di Carnoy fresca modificata (100% metanolo: acido acetico glaciale, 3:1) a temperatura ambiente per 24 ore. Trasferire le ovaie a -20 °C per una conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Preparare la soluzione di Carnoy (100% etanolo: acido acetico glaciale, 3:1) e acido propionico al 50% poco prima di fare scivoli cromosomici.</li>
	<li>Posizionare un paio di ovaie in una goccia della soluzione di Carnoy su uno scivolo a membrana in PET Zeiss 1.0. A seconda delle dimensioni, dividere le ovaie in circa 2-4 sezioni con aghi sezionanti e posizionarle in una goccia di acido propionico al 50% su vetrini puliti sotto un microscopio a dissezione.</li>
	<li>Separare i follicoli e rimuovere il tessuto rimanente usando un tovagliolo di carta sotto uno stereomicroscopio a dissezione. Aggiungere un nuovo calo di acido propionico al 50% ai follicoli e consentire loro di sedersi per 3-5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare una coverslip siliconizzata sopra la goccia. Lasciare riposare lo scivolo per circa 1 minuto.</li>
	<li>Coprire il vetrino con un materiale assorbente (la carta da filtro viene utilizzata per questo metodo) e, durante l'utilizzo del lato gomma di una matita, applicare una generosa quantità di pressione sul copricapo toccandolo ripetutamente con la gomma.</li>
	<li>Riscaldare lo scivolo a 60 °C su un sistema di denaturazione/ibridazione dello scivolo per 15-20 minuti per aiutare ad appiattire i cromosomi di politene. Posizionare gli scivoli in una camera umida a 4 °C durante la notte per consentire all'acido di appiattire ulteriormente i cromosomi.</li>
	<li>Posizionare i vetrini a freddo 50% di etanolo per 10 minuti. Rimuovere delicatamente il coverslip e sostituire a freddo il 50% di etanolo per altri 10 minuti.</li>
	<li>Scivoli disidratati nel 70%, 90%, 100% etanolo per 5 minuti ciascuno. Scivoli ad aria asciutta.</li>
	<li>Preparare una soluzione di soluzione tampone GURR aggiungendo una singola compressa tampone a 1 L di acqua distillata. autoclave.</li>
	<li>Preparare la soluzione di Giemsa aggiungendo 1 ml di soluzione di colorazione Giemsa a 50 ml di tampone GURR.</li>
	<li>Posizionare gli scivoli essiccati all'aria nella soluzione Giemsa per 10 minuti e lavare tre volte in 1X PBS. L'aria secca scivola di nuovo in un clima sterile controllato per evitare contaminazioni.</li>
</ol>2) Microdissezione di cattura laser di un singolo braccio cromosomico di politene
Questa sezione descrive in dettaglio l'utilizzo del software PALMRobo, fornito con il sistema palm MicroBeam Laser Microdissection. 
<ol><li>Pulire il microscopio con etanolo al 100%. Sterilizzare guanti e tubi con una luce UV in un reticegliatore UV.</li>
	<li>Accendi il microscopio a microdisezione laser PALM MicroBeam e accendi il laser. Aprire la suite di dissezione laser PALMRobo e configurare le impostazioni "Power" e "Focus" in base alle esigenze.</li>
	<li>Cerca il braccio cromosomico di politene di interesse.</li>
	<li>Utilizzando lo strumento "Matita", delineare l'area selezionata.</li>
	<li>Aprire la "finestra Elementi" dalla barra dei menu.</li>
	<li>Selezionate l'elemento "Disegnato", assicurate di aver selezionato "Taglia".</li>
	<li>Installare il tubo del cappuccio adesivo nel supporto e posizionarlo sopra lo scivolo, lasciando un piccolo spazio di <1 mm di dimensioni, e avviare il taglio laser.</li>
	<li>Posizionare la "selezione catapulta" all'interno del sito di taglio, lasciando spazio tra il bordo e il cromosoma.</li>
	<li>Selezionare "LPC" dall'opzione a discesa e iniziare a catapultare.</li>
	<li>Verificare che il campione sia stato catapultato in cappuccio premendo l'icona "Occhio".</li>
</ol>3) Purificazione del DNA da un singolo braccio cromosomico in politene microdissecato
Seguire le istruzioni del QIAamp DNA Micro Kit per rilasciare e purificare il DNA raccolto. Il passaggio 3.1 è stato modificato per adattarsi al tubo invertito. 
<ol><li>Aggiungere 15 μl Tampon ATL e 10 μl proteinasi K al tubo invertito (all'interno del tappo) e incubare a 56 °C per 3 ore.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl tampone ATL, 50 μl buffer AL, e 1 μl RNA portante; aggiungere 50 μl 100% EtOH; mescolare.</li>
	<li>Trasferire il lysate nella colonna QIAamp; centrifuga. Lavare aggiungendo tampone AW1 da 500 μl; centrifuga. Posizionare la colonna nel nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 μl tampone AW2; centrifuga. Posizionare la colonna in un nuovo tubo; centrifuga per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
	<li>Posizionare la colonna in un tubo di microcentrifugo da 1,5 μl e aggiungere 20 μl di acqua per eludere; centrifuga.</li>
	<li>Evaporare il DNA appena eluito fino a un volume finale di 9 μl usando unfugo sottovuoto.</li>
</ol>4) Amplificazione del DNA da un singolo braccio cromosomico di politene microdissecato
Due diversi protocolli sono stati utilizzati per la WGA di un singolo braccio cromosomico. 
<ol><li>Amplificazione del DNA e preparazione della sonda tramite GenomePlex WGA<ol>
<li>Segui il protocollo GenomePlex Single Cell WGA4 Kit per produrre il primo lotto di DNA amplificato:<ol>
<li>Aggiungere la soluzione proteica k preparata al campione da 9 μl; incubare il DNA a 50 °C per 1 ora, quindi riscaldare a 99 °C per 4 min. Tieniti sul ghiaccio.</li>
			<li>Aggiungere 2 μl 1X tampone di preparazione della libreria a cella singola e 1 μl di soluzione di stabilizzazione della libreria; campione di calore a 95 °C per 2 min. Raffreddare su ghiaccio e centrifuga.</li>
			<li>Aggiungere 1 μl di enzima di preparazione della biblioteca; mescolare e centrifugare. Incubare come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Aggiungere 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 48,5 μl di acqua. 5,0 μl WGA DNA polimerasi; mescolare e centrifugare.</li>
			<li>Termociclo come segue: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificare il DNA utilizzando il Kit Genomic DNA Clean & Concentrator. Il protocollo è il seguente:<ol>
<li>Aggiungere il campione di DNA-DNA binding buffer:DNA 5:1 (specifico per dna genomico inferiore a 2 kb. Se il DNA del campione è maggiore di 2 kb, utilizzare un rapporto 2:1) e trasferirlo alla colonna di spin fornita. centrifuga.</li>
			<li>Aggiungere tampone di lavaggio del DNA da 200 μl e centrifuga. Ripetere il passaggio di lavaggio. Quindi, aggiungere 50 μl di acqua ed elutare il DNA in un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Riamplificare il DNA campione utilizzando il GenomePlex WGA3 Reamplification Kit come segue:<ol>
<li>Aggiungere 10 μl di DNA al tubo PCR (il kit consiglia 10 ng totali di DNA) con 49,5 μl di acqua, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM di miscela DNTP e 5,0 μl WGA DNA Polimerasi. Mescolare e centrifugare.</li>
			<li>Utilizzare il seguente profilo per la reazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Conservare il DNA a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Etichettare il DNA per FISH utilizzando il GenomePlex WGA3 Reamplification Kit come segue:<ol>
<li>Creare un mix master dal Kit di ricampionamento GenomePlex WGA3 aggiungendo 10 μl di DNA al tubo PCR con acqua da 49,5 μl, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP mix (1 mM di dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - se si utilizza dUTP etichettato), 1 μl di 25 nM etichettato dUTP , e 5,0 μl WGA DNA Polimerasi.</li>
			<li>Utilizzare il seguente profilo per la reazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>L'etanolo precipita la sonda etichettata aggiungendo 1/10 del volume di reazione finale (7,5 μl per reazione di 75 μl) di 3 M acetato di sodio pH 5.2 e 2-3 volumi di etanolo al 100%. Raffreddare il campione di DNA a -80 °C per almeno 30 minuti.</li>
			<li>Centrifugare il campione a 4 °C per 10 minuti per creare pellet etichettato e rimuovere il pellet supernatante e asciutto all'aria.</li>
			<li>Creare il buffer di ibridazione come segue: 0,2 g Disgrasso di Dextran 1200 μl Formamide deionizzata 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Aggiungere 40 μl di tampone di ibridazione al pellet essiccato all'aria.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificazione del DNA e preparazione della sonda tramite REPLI-G Single Cell WGA seguita da nick-translation<ol>
<li>Segui il protocollo REPLI-g Single Cell WGA Kit per produrre il DNA amplificato:<ol>
<li>Preparare il buffer D2 (3 μl di 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB).</li>
			<li>Mescolare 4 μl di materiale microdissecato purificato con 3 μl Buffer D2. Tubo di film da mescolare. Incubare per 10 min a 65 °C. Aggiungere 3 μl di soluzione di arresto; mescolare.</li>
			<li>Aggiungere 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g Reaction Buffer e 2 μl di REPLI-g DNA Polimerasi al campione. Incubare a 30 °C per 8 ore. Inattivare la DNA polimerasi riscaldando a 65 °C per 3 min. Conservare il DNA a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segui il protocollo di traduzione nick per etichettare il DNA amplificato REPLI-g:<ol>
<li>Preparare la seguente combinazione di etichette: 1 μg di DNA amplificato Tampone di DNA polimerasi 5 μl 10X 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Etichettato dNTP 4 μl 1 U/μl DNasi I 1 μl 10 U/μl DNA polimerasi I DaH 2O a 50 μl</li>
			<li>Incubare a 15 °C per 2 ore. Aggiungere 2 μl di EDTA da 0,5 M per interrompere la reazione. Controlla le dimensioni dei frammenti di DNA correndo sul gel.</li>
			<li>Seguire i passaggi dal 4.1.4.3-4.1.4.6 per precipitare e solubilizzare il pellet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) PESCE 2D su preparati di zucca del politene e cromosomici mitotici
Si prega di fare riferimento a protocolli dettagliati per FISH sui preparati di politene squashes 47 e diapositive cromosomtiche mitotiche 48. Qui forniamo brevi protocolli.
<ol><li>FISH su preparati per zucca cromosomici di politene<ol>
<li>Immergere le diapositive in 1X PBS per 20 minuti a RT. Correggere le diapositive in paraformaldeide al 4% in 1X PBS per 1 min.</li>
		<li>Scivoli disidratati attraverso lavaggi di etanolo: 50%, 70%, 90%, 100% per 5 minuti ciascuno a RT. Scivoli ad aria secca.</li>
		<li>Prewarm la sonda in tampone di ibridazione a 37 °C. Aggiungere 10-20 μl di sonda per far scorrere. Coperchio con coperchio da 22 X 22 mm. Premere eventuali bolle d'aria utilizzando una punta di pipetta.</li>
		<li>Cromosomi denaturati e sonda a 90 °C per 10 min. Bordi di tenuta di coverslip con cemento di gomma. Trasferire lo scivolo in camera umida e incubare a 39 °C durante la notte.</li>
		<li>Lavare gli scivoli con 1X SSC a 39 °C per 20 min. Lavare le diapositive con 1X SSC a RT per 20 minuti. Risciacquare le diapositive in 1X PBS, quindi aggiungere Prolunga anti-dissolvenza con DAPI. Coprire con coverlip e archiviare in una casella di scorrimento a 4 °C per almeno un'ora prima della visualizzazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FISH sui preparati mitotici cromosomici<ol>
<li>Estrarre cromosomi mitotici da dischi immaginari di 4th larva instar di An. gambiae.</li>
		<li>Preparare diapositive cromosomtiche adatte a FISH.</li>
		<li>Aggiungere 2-3 μl di sonda di DNA etichettata al tampone di ibridazione in un tubo e mescolare delicatamente pipettando.</li>
		<li>Applicare 10 μl della miscela di sonda sul vetrino e coprire con un coverslip da 22 X 22 mm. Premere eventuali bolle d'aria utilizzando una punta di pipetta.</li>
		<li>Per la controsottenzione e il rilevamento, applicare Prolunga anti-dissolvenza con DAPI alla preparazione e rimanere al buio per almeno un'ora prima della visualizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) PESCE 3D su tessuto ovarico a montaggio intero
<ol><li>Preparare la combinazione buffer A seguente: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM spermidina 0,15 mM Spermina 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA TUBI DA 15 mM</li>
	<li>Preparare le diapositive per la visualizzazione nucleare aggiungendo uno strato di smalto in un motivo quadrato in modo che corrisponda alle dimensioni dei copripavimenti. Ciò crea una superficie rialzata per evitare la schiacciamento dei nuclei quando si posiziona su coverslip in futuro.</li>
	<li>Sezionare le ovaie fresche delle femmine dello stadio 3 di Christopher e conservare in una soluzione di 150-250 μl Tampone A con 0,5% di digitonina. Eseguire ago di dissezione più grande sui follicoli (in tubo con buffer A con 0,5% di digitonina) per distruggere la membrana follicolare.</li>
	<li>Vortice per 5-10 minuti per disturbare ulteriormente i follicoli. Raschiare eventuali pezzi follicolari di grandi dimensioni e tubo di centrifuga per 30 secondi all'impostazione più bassa di ~ 500 giri al minuto (RPM). Trasferire il supernatante in un nuovo tubo Eppendorf da 2 ml e aggiungere 100 μl di Tampone A. Ripetere il passaggio 6.3 tra 5-7 volte, fino a quando il tessuto visibile non viene rotto in piccole particelle.</li>
	<li>Ruota entrambi i tubi per 10 minuti a 2.000 giri/min. Scartare il supernatante in entrambi i tubi. Nota: entrambi i tubi verranno utilizzati per realizzare diapositive finali di visualizzazione nucleare. Il tubo con supernatante raccolto dovrebbe contenere principalmente nuclei estratti, mentre il tubo originale con tessuto conterrà una miscela di tessuto e nuclei incorporati nelle cellule di alttanti. Aggiungere 200 μl di Tampone A - 0,1% Tritone e incubare durante la notte a 4 °C. Centrifugare 5 min a 10.000 giri/min (10.621 x G) e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 μl 4% di paraformaldeide in PBS. Incubare in termomisore per 30 minuti, mescolando a 450 giri/min. Centrifugare 5 min a 5.000 giri/min (2.655 x G) e rimuovere il supernatante. Lavare con tampone A con 0,1% Tritone per 5 min, mescolando a 450 giri/min in thermomixer. Centrifugare 5 min a 5.000 giri/min (2.655 G) e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere la sonda prerifascita a 37 °C etichettata sul tubo. Denatura a 95 °C in termomixer, miscelazione a 450 giri/min, per 10 min. Continuare la denaturazione a 80 °C per 15 minuti con miscelazione continua. Incubare a 37 °C in termomisore, con miscelazione a 450 giri/min durante la notte. Centrifuga 5 min a 5.000 giri/min (2.655 x G). Rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Lavare con tampone A con 0,1% Tritone per 5 min. Centrifuga 5 min a 5.000 giri/min (2.655 x G). Ripetere 2 volte. Applicare la goccia di Prolunga anti-dissolvenza con DAPI.</li>
	<li>Pipet fuori nuclei/soluzione DAPI con attenzione (evitando bolle), applicare su scivolo e coprire con coverslip.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono più passaggi fondamentali per amplificare con successo il DNA da campioni cromosomici di politene microdissecati. Il protocollo utilizza l'uso di LCM, un metodo che aumenta l'efficienza complessiva e riduce l'esposizione al DNA estraneo rimuovendo l'interazione degli strumenti fisici con il campione. Tuttavia, l'amplificazione del DNA estraneo è ancora la più grande insidia potenziale di questo esperimento. Pertanto, durante l'intero processo, è essenziale proteggere i campioni dalla contaminazione. Durante le fasi di preparazione dello scivolo e microdisezione, è essenziale lavare aghi di dissezione di lavaggio dell'etanolo, scivoli, scivolamenti di copertura e spazio di lavoro.  Si consiglia inoltre ai raggi UV di trattare tutte le apparecchiature applicabili (aghi, scivoli, coverlips) prima dell'uso.
La membrana sulle diapositive di dissezione rende molto difficile la diffusione dei cromosomi.  È importante utilizzare più ovaio (da metà a un paio completo di ovaie) quando si fanno queste diapositive, per fornire una maggiore possibilità di trovare un nucleo ben diffuso.  Si consiglia inoltre di utilizzare tessuti freschi durante la creazione di diapositive, poiché i tassi di amplificazione sembrano scendere man mano che i tessuti hanno 49 anni e la diffusione cromosoma diventa più impegnativa.  La preparazione delle diapositive per la microdisezione è il passaggio più dispendioso in termini di tempo in questo protocollo.  I cromosomi devono essere ben diffusi per evitare l'acquisizione accidentale di materiale indesiderato.  La colorazione Giemsa consente all'utente di controllare la qualità della diffusione con un microscopio a contrasto di fase prima di utilizzare il sistema di microdisezione.
La combinazione di microdissezione e amplificazione offre l'opportunità di estrarre e analizzare frammenti cromosomici di dimensioni che vanno da piccole regioni di interesse alla maggior parte delle braccia.  Questo protocollo consente all'utente di ottenere DNA da regioni morfologicamente distinte come inversioni, specifiche bande e uchromatiche e interbandi, eterocromatina telomerica, centromerica e intercalare. L'utente può applicare le sonde di pittura generate all'esame dei cromosomi aberranti, allo studio dell'omologia tra specie in particolari loci o alla caratterizzazione dell'organizzazione spaziale dei cromosomi in un nucleo 3D intatto. Per lo sviluppo di vernici cromosomiche, abbiamo selezionato segmenti eucromatici per evitare l'ibridazione di DNA ripetitivo con più regioni cromosomiche. Di conseguenza, abbiamo ottenuto una pittura specifica per braccio senza usare un concorrente, come il DNA genomico totale o la frazione di DNA C0t-1.
Abbiamo scelto di utilizzare i kit GenomePlex WGA e REPLI-G basati su recensioni che hanno confrontato l'efficienza e il tasso di abbandono di più kit di amplificazione 40,44.  Entrambi i kit hanno ottenuto il meglio tra i metodi disponibili in entrambi i drop-out rate (GenomePlex ha avuto un tasso del 12,5% rispetto al 37,5% di REPLI-g) e percentuale di marcatori amplificati (GenomePlex aveva un tasso di amplificazione del 45,24% rispetto al 30,0% di REPLI-g) 40. Il kit GenomePlex ha anche fornito una maggiore quantità di DNA, e quindi lo ha reso un candidato migliore per più tecniche a valle.  È disponibile anche un kit di ri-amplificazione per il sistema GenomePlex, che consente un'ulteriore amplificazione del DNA. Tuttavia, è importante notare che l'amplificazione non è perfetta.  Resta la possibilità che un'amplificazione riuscita possa introdurre errori o avere un pregiudizio verso loci specifici nel DNA bersaglio. È importante considerare la dimensione finale del frammento dei metodi di amplificazione del genoma disponibili.  La frammentazione GenomePlex si traduce in una libreria con frammenti che vanno da 200-500 bp, mentre il kit REPLI-g produce frammenti di circa 10-20 kb di dimensioni. L'applicazione a valle prevista di questo protocollo è FISH, rendendo così il kit GenomePlex un'opzione più fattibile, in quanto forniva la dimensione del frammento desiderata e la capacità di etichettare i frammenti di DNA direttamente attraverso WGA. Le molecole di DNA lunghe prodotte dall'amplificazione REPLI-g devono essere frammentate nella reazione di etichettatura a valle della traduzione.
Questo protocollo è stato adattato per amplificare con successo il DNA da un singolo braccio cromosomico di politene.  Altri protocolli richiedono la messa in comune di molti frammenti cromosomici (tipicamente 10-30) al fine di amplificare con successo il campione 7,11,28,40.  Sebbene la messa in comune di cromosomi multipli sia possibile utilizzando il nostro metodo, l'aumento della probabilità di contaminazione del campione sottolinea l'importanza di iniziare l'esperimento con il minor numero possibile di cromosomi. Se i cromosomi politene non sono disponibili, il nostro protocollo potrebbe essere adattato per l'uso nei cromosomi mitotici. Può essere necessario, tuttavia, mettere in comune 10-15 cromosomi mitotici prima dell'amplificazione per il successo FISH 11. La distorsione di amplificazione è inferiore con elevate quantità di DNA modello iniziale 50. I cromosomi polytene forniscono circa 512 copie di una singola sequenza di DNA e 1024 copie di due sequenze di DNA omologhe.  Pertanto, mettere in comune i cromosomi mitotici aiuterà ad aumentare la qualità complessiva del prodotto del DNA dopo l'amplificazione.
Questa procedura ha molti usi potenziali negli studi citogenetici e genomici. Qui, abbiamo usato vernici cromosomiche per stabilire la corrispondenza tra segmenti eunuromatici di politene e bracci cromosomici mitotici in An. gambiae. Le stesse sonde pittoriche possono essere applicate alla caratterizzazione citogenetica delle linee cellulari di An. gambiae. Ampi riarrangiamenti genomici e cambiamenti nei numeri cromosomici sono caratteristiche comuni delle linee cellulari 51,52. Riarrangiamenti aneuploidici, poliploidi e cromosomici come traslocazioni, inversioni, derelezioni e cromosomi ad anello sono stati rilevati in diverse linee cellulari di zanzara 53,54. Le osservazioni citogenetiche classiche 55 e la mappatura fisica 56 hanno dimostrato la presenza di traslocazioni cromosomiche a braccio intero nell'evoluzione delle zanzare della malaria. Pertanto, il materiale microdissecato può essere utilizzato in combinazione con esperimenti FISH per confrontare l'omologia delle regioni cromosomiche tra le specie. Abbiamo eseguito con successo 3D FISH con la sonda di verniciatura 2R sui cromosomi di politene in cellule infermieristiche ovariane a montaggio intero. Questo metodo faciliterà il tracciamento delle traiettorie cromosomici e lo studio dell'architettura nucleare in Anopheles. Tecniche come il genotipizzazione del DNA 57,58, il sequenziamento del genoma di nuova generazione 26,27, lo sviluppo fisico e della mappa di collegamento e la generazione di sonde per la pittura cromosomica 33,59 possono tutti beneficiare della microdisezione specifica del braccio e della regione. Combinando la tecnologia LCM e avanzando il WGA a una cellula, dimostriamo un metodo efficiente e pratico per produrre quantità ragionevoli di DNA da un singolo braccio cromosomico di politene.

La pittura cromosomica è una tecnica utile per studiare l'evoluzione dei cariotipi 1-5 e per visualizzare le anomalie citogenetiche attraverso l'ibridazione del DNA cromosomico etichettato fluorescentmente 1,6-8. Questo metodo viene applicato anche allo studio della dinamica 3D dei territori cromosomici nello sviluppo 9 e della patologia 10. Le vernici cromosomico etichettate in modo differenziato sonoutilizzate per la visualizzazione di singoli cromosomi mitotici 11,12,meiotici 13,14o interfase non politene 15,16 e politene 9,11,17 cromosomi. Un protocollo semplice e robusto per ottenere vernici cromosomche sarebbe molto utile per espandere questa tecnica ad organismi non modello, come le zanzare. Il complesso delle Anopheles gambiae è un gruppo di sette zanzare morfologicamente indistinguibili che variano nel comportamento e nell'adattamento, inclusa la capacità di trasmettere la malaria.  Queste zanzare fungono da modello eccellente per comprendere meglio l'evoluzione di specie strettamente correlate che differiscono notevolmente nella loro capacità vettoriale.  La maggior parte degli studi citogenetici sulle zanzare della malaria sono stati fatti utilizzando cromosomi ben sviluppati e altamente politenizzati (esaminati in 18,19). I modelli di bande leggibili dei cromosomi politene hanno permesso ai ricercatori di dimostrare l'associazione tra inversioni polimorfiche e adattamenti ecologici in Anopheles gambiae 20. Inoltre, le caratteristiche 21 specifiche dei tessuti e delle specie 22 dell'organizzazione cromosomica del politene 3D sono state caratterizzate nel complesso di An. macullipennis. Tuttavia, lo studio dei cromosomi mitotici potrebbe fornire ulteriori informazioni importanti. Ad esempio, un più alto livello di polimorfismo dell'eterocromatina osservato nei cromosomi mitotici è stato correlato con la ridotta attività di accoppiamento e fertilità in An. gambiae 23. La corrispondenza tra i segmenti eunuromatici dei bracci del politene e del cromosoma mitotico potrebbe essere difficile da stabilire solo confrontando le loro lunghezze relative. Questo perché l'eterocromatina costituisce una porzione significativa dei cromosomi mitotici, ma è sottorappresentata nei cromosomi politene 24. La disponibilità di vernici cromosomiche per le zanzare della malaria consentirebbe ai ricercatori di espandere significativamente gli studi citogenetici includendo altre specie, riducendo sostanzialmente il costo e il tempo nelle analisi dell'evoluzione cariotipica e della dinamica 3D dei cromosomi in questo gruppo di insetti epidemiologicamente importanti.
Al fine di ottenere grandi tratti di cromosomi, la microdisezione è diventata una tecnica integrale per manipolare e isolare specifiche regioni di interesse del complemento cromosomico.  Se accoppiata con l'amplificazione dell'intero genoma (WGA), la microdisezione si traduce in potenti applicazioni a valletracui FISH 11,12 e sequenziamento del genoma di nuova generazione 25-27. In precedenza, la tecnica richiedeva l'uso di aghi specializzati di microdisezione che dovevano essere controllati manualmente da un utente esperto 28.  L'avanzamento della microdisezione di cattura laser (LCM) ha portato a uno strumento semplificato più adatto per isolare singole cellule 29,30 o singoli cromosomi 31-33 con un ridotto rischio di contaminazione. Questo approccio consente all'utente di studiare le eterogeneità genetiche e le anomalie cromosomiche che si verificano in singole cellule, invece di un panorama di consenso che deriva dalla messa in comune di più cellule insieme 34-36. Sono stati utilizzati diversi metodi per amplificare il DNA prodotto dalla microdisezione.  DOP-PCR, una tecnica utile per l'amplificazione di sequenze altamente ripetitive, è stata utilizzata per amplificare i cromosomi microdissecati da specie tra cui la cavalletta 37,l'anguilla spinosa 38e la tilapia del Nilo 39.  Più recentemente, il kit GenomePlex WGA4 Single Cell basato su PCR e il kit repli-g single cell basato sull'amplificazione a spostamento multiplo (MDA) sono diventati strumenti preziosi per esperimenti che coinvolgono l'analisi genetica di singole cellule umanee cromosomi 40-42,inclusi i sistemi cromosomici B nelle cavallette 37 e locuste 43. Questi due kit hanno ciascuno vantaggi e svantaggi, ma la loro apparente superiorità rispetto ad altri sistemi di amplificazione disponibili è stata dimostrata 44.
La quantità di DNA che può essere ottenuta da un singolo cromosoma o da un segmento cromosomico è significativamente inferiore a quella di un intero nucleo. Pertanto la microdisezione, l'amplificazione e la successiva analisi di un singolo cromosoma sono molto più impegnative, specialmente negli organismi con piccoli genomi come in Drosophila o Anopheles.  Sebbene le vernici siano state sviluppate da singoli cromosomi microdissecati di un umano 33 e una vespa 45,un esperimento FISH di successo ha richiesto più (almeno 10-15) cromosomi mitotici microdissecati di una mosca della frutta 11. Tuttavia, la capacità di microseleggere e amplificare un singolo cromosoma sarebbe importante per (i) ridurre la possibilità di contaminazione con materiale proveniente da un cromosoma diverso, (ii) ridurre al minimo il numero di preparati cromosomici necessari per la microdisezione, (iii) abbassare il nucleotide e il polimorfismo strutturale del campione microsacrato sia nelle applicazioni FISH che sequenziando le applicazioni a valle. I cromosomi polytene presenti in molte specie di Ditteri offrono un'opportunità unica di acquisire una quantità iniziale di DNA molto più elevata. Forniscono anche una risoluzione più elevata e una struttura cromosoma che non può essere raggiunta attraverso l'uso di cromosomi mitotici. Questa risoluzione aggiunta può essere fondamentale per visualizzare riarrangiamenti cromosomici, struttura della cromatina e segmenti cromosomici da microdissacrare 28,46.
Qui presentiamo una procedura per isolare efficacemente un segmento eufomatico da un singolo braccio cromosomico di politene, amplificare il DNA e usarlo nelle applicazioni FISH a valle nelle zanzare della malaria.  In primo luogo, applichiamo LCM per isolare ed estrarre un singolo braccio cromosomico da diapositive a membrana appositamente preparate. In secondo luogo, il WGA viene utilizzato per amplificare il DNA dal materiale microdissecato. In terzo luogo, ibridamo il DNA amplificato negli esperimenti FISH ai preparati di politene squash 47, alle diapositive cromosome metafase e interfase 48, nonché ai campioni di supporto intero ovarico 3D. Questa procedura è stata fatta per dipingere con successo la maggior parte dell'eucromatina in braccia cromosomiche di An. gambiae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) delle sonde cromosomiche intere del braccio è una tecnica robusta per mappare le regioni genomiche di interesse, rilevare riarrangiamenti cromosomici e studiare l'organizzazione tridimensionale (3D) dei cromosomi nel nucleo cellulare. L'avvento della microdisezione di cattura laser (LCM) e dell'amplificazione dell'intero genoma (WGA) consente di ottenere grandi quantità di DNA da singole cellule. La maggiore sensibilità dei kit WGA ci ha spinto a sviluppare vernici cromosomico e ad usarle per esplorare l'organizzazione cromosoma e l'evoluzione in organismi non modello. Qui presentiamo un metodo semplice per isolare e amplificare i segmenti eunuromatici dei singoli bracci cromosomici di politene dalle cellule infermiere ovariane della zanzara malaria africana Anopheles gambiae. Questa procedura fornisce una piattaforma efficiente per ottenere vernici cromosomche, riducendo al contempo il rischio complessivo di introdurre DNA estraneo nel campione. L'uso di WGA consente diversi cicli di ri-amplificazione, con conseguente elevate quantità di DNA che possono essere utilizzate per più esperimenti, tra cui 2D e 3D FISH. Abbiamo dimostrato che le vernici cromosomiche sviluppate possono essere utilizzate con successo per stabilire la corrispondenza tra porzioni eunuromatiche di politene e bracci cromosomici mitotici in An. gambiae. Nel complesso, l'unione di LCM e WGA mono cromosomico fornisce uno strumento efficiente per creare quantità significative di DNA bersaglio per futuri studi citogenetici e genomici.

La figura 1 descrive il flusso complessivo del protocollo descritto in questo articolo.  L'utente inizia inizialmente microdissecando campioni di DNA cromosomico da diapositive a membrana.  Il materiale microdissecato viene estratto e purificato. Il DNA purificato viene quindi amplificato, ri-amplificato, etichettato e quindi utilizzato per FISH per etichettare le diffusioni cromosomtiche.
Il protocollo LCM può essere suddiviso in tre fasi complessive: 1) Trovare cromosomi di interesse e preparare la regione per iltaglio (Figura 2A),2) Taglio e catapultazione della regione cromosomica di interesse tramite laser (Figura 2B) e 3) Controllo per determinare se il campione è effettivamente catapultato in tappo adesivo(Figura 2C). Il processo di LCM utilizzato sui cromosomi politene a tensione An. gambiae Sua è mostrato nel Video 1. Il video descrive in dettaglio l'intero processo dall'avvio del programma, incluse importanti funzioni software e suggerimenti.
I kit WGA a cella singola GenomePlex e REPLI-g utilizzati in questo protocollo differiscono notevolmente per le dimensioni del prodotto risultanti e la resa complessiva.  La figura 3 mostra i risultati dell'elettroforesi del gel eseguito per i kit GenomePlex e REPLI-g, nonché la quantificazione dei campioni da parte di Nanodrop.
Il materiale microdissecato è stato utilizzato per creare sonde FISH che prendono di mira le regioni eunucomatiche di un cromosoma.  La figura 4 mostra FISH di cinque sonde generate da materiale microsacrato su cromosomi di politene di An. gambiae.  Quattro bracci autosomici sono stati etichettati con tre fluorofori usando il kit WGA3: il cromosoma 3R è etichettato in verde (fluoresceina), il cromosoma 3L è in una miscela di rosso (Cy-3) e giallo (Cy-5), il cromosoma 2R è in giallo (Cy-5) e il cromosoma 2L è in rosso (Cy-3). Il cromosoma X è stato etichettato in arancione (Cy-3) usando la nick-traduzione del materiale REPLI-g in un esperimento separato. Per stabilire la corrispondenza tra porzioni eunucomatiche di bracci cromosomici politene e mitotici, le vernici cromosomiche sono state ibridate per interfase, propase, prometafase e cromosomi metafase di An. gambiae (Figura 5).  Per visualizzare l'organizzazione 3D di un singolo braccio cromosomico di politene nel nucleo cellulare, l'intero supporto FISH è stato eseguito su cellule di infermiera ovarica ceppo An. gambiae Sua (Video 2).  Territori del braccio cromosomico distinti sono chiaramente visti nei nuclei con cromosomi interfase(Figura 5D)e politene (Video 2).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figura 1. Rappresentazione schematica delle procedure sperimentali verso la preparazione delle vernici cromosomtiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figura 2. I passi principali nella microdisezione cromosomica. A) Taglio laser-assistito della regione cromosomica di interesse attraverso la membrana. B) La membrana con un foro dopo la catapultazione. C) La vista del pezzo catapultato della membrana con un segmento cromosomico in esso attaccato al cappuccio adesivo. La freccia indica l'eterocromatina del cromosoma X che è rimasta sulla diapositiva. L'asterisco mostra un pezzo di un altro cromosoma che è rimasto sulla diapositiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figura 3. Immagini in gel di agarosio che mostrano il DNA dopo la WGA. A) Dna a basso peso molecolare (200-500 bp) dal braccio 3R dopo aver utilizzato i kit GenomePlex WGA4 e WGA3. B) DNA ad alto peso molecolare (10-20 kb) dal braccio 2L dopo l'amplificazione REPLI-g. La scala da 100 bp è mostrata nelle corsie di sinistra. Le tabelle seguenti mostrano le concentrazioni di DNA misurate da Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figura 4. Pittura di cromosomi politene da cellule di infermiere ovarica di An. gambiae utilizzando quattro sonde generate da materiale microdissecato. Il cromosoma X è etichettato in arancione (Cy-3) mediante nick-traduzione del materiale REPLI-g. Il braccio 2R è etichettato in giallo (Cy-5); il braccio 2L è in rosso (Cy-3); il braccio 3R è etichettato in verde (fluoresceina); il braccio 3L è etichettato in una miscela di rosso (Cy-3) e giallo (Cy-5). Gli autosomi sono etichettati con il kit di amplificazione WGA3. La cromatina è macchiata di blu (DAPI). I nomi cromosomici sono posizionati vicino alle regioni telomeriche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figura 5. Verniciatura di cromosomi interfase (A), prophase (B), prometafase (C) e metafase (D) da dischi imaginali larvali del ceppo An. gambiae Mopti utilizzando tre sonde generate da materiale microdissecato etichettato da WGA3. Il braccio 2R è etichettato in verde (fluoresceina); il braccio 2L non è etichettato; il braccio 3R è in rosa, una miscela di rosso (Cy-3) e arancione (Cy-5); il braccio 3L è etichettato in arancione (Cy-5). Il cromosoma X ha un'etichetta rossa corrispondente alla sonda rDNA 18S. La cromatina è macchiata di blu (DAPI). Le regioni dei cromosomi macchiate brillantemente corrispondono all'eterocromatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.</a>
Video 1. Il processo di LCM dei cromosomi Politene An. gambiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il video 1.</a>
Video 2. Intero supporto 3D FISH eseguito su cellule infermiere ovare An. gambiae. La sonda è etichettata in Cy-3 (raffigurata in blu) ed è stata realizzata con un braccio cromosomico 2R microdissecato.  La cromatina era macchiata di DAPI ed è raffigurata da pseudocolorazione ciano (azzurro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il video 2.</a>

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2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

La pittura cromosoma è un metodo utile per studiare l'organizzazione del nucleo cellulare e l'evoluzione del cariotipo. Qui, dimostriamo un approccio per isolare e amplificare specifiche regioni di interesse da singoli cromosomi di politene che vengono successivamente utilizzati per l'ibridazione fluorescente in situ bi-e tridimensionale (FISH).

Pittura cromosoma 2D e 3D nelle zanzare della malaria

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Virginia Tech. La pittura cromosoma è un metodo utile per studiare l'organizzazione del nucleo cellulare e l'evoluzione del cariotipo. Qui, dimostriamo un approccio per isolare e amplificare specifiche regioni di interesse da singoli cromosomi di politene che vengono successivamente utilizzati per l'ibridazione fluorescente in situ bi-e tridimensionale (FISH).

Video: 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocollo Chelex semplice per l&#39;estrazione del DNA da<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

I metodi per aumentare la sensibilità di High Resolution Melting polimorfismo a singolo nucleotide genotipizzazione a malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...