الإجراء لتحليل والفرز المتسلسلة الكريات من ثقافة نابعة من السائل القديم لمدة يومين، يتم تمثيل تخطيطي في الشكل 1. وفيما يلي تفاصيل عن هذه الطريقة. 1. النمو (بما في ذلك إعداد وسائل الإعلام والمخازن المؤقتة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 1 لتر من 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS؛ 80 غ كلوريد الصوديوم، 2 ز بوكل، 14.4 ز نا 2 هبو 4، 2.4 غ KH 2 PO 4 في 1 لتر من الماء المقطر تعديلها لدرجة الحموضة 7.4). في وقت الاستخدام إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني 10X إلى 900 مل من الماء المقطر للحصول على 1 لتر من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 1 لتر من YEME المتوسطة (3 ز Difco خلاصة الخميرة، 5 ز Bacto ببتون، 3 ز OXOID استخراج الشعير، و 10 ز الجلوكوز، والسكروز 340 غرام، الماء المقطر تصل إلى 1 L) و 100 مل من 2.5 M MgCl 2. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول على حد سواء. نلاحظ أن وسائل الإعلام الأخرى أيضا المتسلسلة يمكن استخدامها 4،14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل المتوسطة YEME و 0.2 مل 2.5 M MgCl 2 لمعقم 250 مل دورق مخروطي سعة مجهزة معدنية ملفوف الينابيع. إعداد العديد من قوارير كعينات البكتيرية للدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم كل قارورة مع 10 8 أبواغ المتسلسلة للحصول على تركيز بوغ من 10 6 جراثيم / مل. تنمو البكتيريا لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية في حين تهتز في 180 دورة في الدقيقة. </li></ol> 2. أخذ العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة 5 مل من كل ثقافة إلى 15 مل فالكون الأنبوب باستخدام 5 مل ماصة معقمة. بلطف يهز الثقافة في حين أخذ عينة للتأكد من أن العينة ممثلة لثقافة بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تحليل العينات على الفور مع COPAS ضرورية أية خطوات إعداد العينات. الحفاظ على عينة على الجليد وانتقل إلى الخطوة 3.1 من هذا البروتوكول. عندما يتم تحليل العينات في نقطة وقت لاحق، وتحديد الكريات كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،5 من هذا البروتوكول. لاحظ أن التثبيت أيضا يمنع نمو البكتيريا في نظام الأنابيب عندما لم تنظف بشكل صحيح بعد analysوفاق. ضمان أن التثبيت مع الفورمالديهايد لا يعيق التحليلات المصب. على سبيل المثال، الحمض النووي الريبي لا يمكن أن تكون معزولة عن الكريات الفطرية بعد التثبيت مع الفورمالديهايد. في المقابل، تم عزل الحمض النووي الريبي بنجاح بعد التثبيت مع الايثانول 70٪ 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ إلى 5 مل من العينة وتخلط بواسطة قلب و3X الأنبوب. إصلاح العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات في 2،500 x ج في الدوار ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف وغسل الكريات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.4 بحيث الكريات يتم غسلها 2X مع برنامج تلفزيوني. ويمكن تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. </li></ol> 3. تحليل COPAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من تشغيل COPAS زائد، ومضخة، الكمبيوتر و488 نانومتر ليزر الأرجون وعلى بدء البرنامج Biosort. على الرغم من تحول، والليزر لا يزال في عمل الاستعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معرفة ما اذا كان زجاجة السائل غمد مليء وزجاجة فارغة النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;ستارت&quot; ثم &quot;RUN&quot; لتبديل 488 نانومتر ليزر الأرجون من الاستعداد ليوم. بعد حوالي 60 ثانية، وعندما ليزر على، انقر فوق &quot;تم&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أجهزة قياس الضغط. الضغوط ل &#39;غمد&#39;، &#39;نموذج&#39;، &#39;فارز&#39; و &#39;نظيف&#39; يجب قراءة حول 4.0، 0.5، 2.7، و 10.9 على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على مربع الاختيار بجوار &quot;موافق الضغط &#39;. النظام ثم يعبي الخلية التدفق وجاهز للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويفترض الإعدادات القياسية مع &#39;تأخير&#39; في 11 و &#39;العرض&#39; 7. يتم تعيين عتبات في 50 ل &#39;الإشارة&#39; و 40 ل &#39;TOF الحد الأدنى &quot;، مع TOF تمثل الرحلة من الوقت. (للاكتمال: يتم تعيين كافة &quot;الأرباح&quot; في 1، يتم تعيين على الزناد في EXT (الانقراض)، وفي علامة التبويب &quot;تكوين&quot; ضمن &quot;حدد معدل المسح&quot; يتم اختيار 2.50 ميغاهيرتز تم تعيين الصدفة إلى &#39;تعزيز&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه المتبقية من عينة الكأسد إضافة 0.1 مل من عينة المتسلسلة من الخطوة 2.2 أو 2.5 في الكأس معا مع برنامج تلفزيوني (حوالي 50 مل). تأكد من إغلاق كوب العينة بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;اكتساب&quot; إلى البدء في جمع البيانات. إدارة سرعة تدفق للحصول على ما بين 30-50 الأحداث في الثانية الواحدة. إذا كان تدفق عالية جدا، إضافة إلى برنامج تلفزيوني كأس العينة. إذا كانت سرعة تدفق منخفض جدا، إضافة المزيد من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم جمع ما لا يقل عن 2،500 الأحداث النقر على &quot;إيقاف&quot;. لحفظ كافة البيانات انقر &#39;مخزن&#39; وحفظ الملف للتحليل الإحصائي لاحقة. يقوم البرنامج Biosort حفظ البيانات في الملفات الأربعة، والتي سيتم استخدامها فقط على ملف txt. لتحليلها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف كوب عينة عن طريق إزالة عينة مع حقنة 50 مل وغسل 2X مع الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 3،7-3،10 حتى يتم تحليل جميع العينات. </li></ol> 4. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف TXT. وتجاهل البيانات مع EXT أقل من 25 (على سبيل المثال باستخدام إكسل). هذايتوافق مع الحطام وشظايا خوطي فضفاضة (على النيجر الرشاشيات يتم تجاهل كافة البيانات مع EXT أقل من 150) 4،12. ثم، وتوفير جميع TOFs في عمود واحد في سهل ملف (للعديد من ملفات البيانات هذه يمكن أن يكون آليا في لغة البرمجة R، التي تتوفر من: &#39;النص&#39;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد SciLab (الإصدار 5.3.2 أو أحدث من http://www.scilab.org/) يتم تثبيت جنبا إلى جنب مع مكتبة &quot;fittools &#39;، والذي يتوفر، جنبا إلى جنب مع الدليل، من: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual٪ 20fittools.pdf </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل SciLab والوظائف اللازمة للمكتبة fittools لنمذجة البيانات. باختصار: تثبيت مكتبة fittools كما هو موضح في دليل (يحتاج فقط مرة واحدة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مكتبة fittools. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة البيانات (. النص &#39;ملف) في SciLab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تسجيل تحويل البيانات (سجل الطبيعية هي وظيفة السجل الافتراضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب نموذج 2 السكان إلى البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بياني مع الرسم البياني ونموذج (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألبس الحذاء البيانات (1،000 مكررات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب نموذج لقواعد البيانات ألبس الحذاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ثقة فترات تقديرات المعلمات 5. هذا وسوف توفر معلومات عن الكسر المشاركة (ع) من السكان، وبها 2 يعني (μ μ 1 و 2) والانحرافات المعيارية المرفقة (α α 1 و 2). وعلاوة على ذلك، يتم تحديد فترات الثقة 95٪ من تجديدها مع النموذج بعد إلباس الحذاء (1،000 مكررات) 12،13،15. عندما فترات الثقة من وسائل لا تتداخل وفترة الثقة ع ما بين 0،025-0،975 مجموعة البيانات يمكن تفسيره على أنه مزيج من اثنين من السكان من التوزيع الطبيعي. (لاحظ الفي جزء مشاركة الكريات الصغيرة هو ع، في حين أن مشاركة الكريات الكبيرة هي 1 - ص) العلاقة بين TOF وقطر بيليه المتسلسلة يساوي 0.57 × 159 ميكرون TOF + 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة تم العثور على اثنين من السكان استخدام متوسط ​​TOFs كما الفرز المعلمات في COPAS كما العلوي والسفلي ملزمة لفرز الكريات الصغيرة والكبيرة في وقت لاحق. لاحظ أنه يمكن أيضا أن يتم اختيار المعلمات الفرز الأخرى تبعا لمتطلبات المستخدم. </li></ol> 5. بيليه الفرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينة المتسلسلة التي يتعين تسويتها كما هو موضح في الخطوة 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين &#39;الفرز حدود&#39; وتقديم تفاصيل عن الحد الأدنى (لو) والحد الأقصى (مرحبا) القيم TOF. بدلا من ذلك، وضع منطقة عن طريق تحديد &quot;المناطق&quot; ثم &quot;تحديد بوابة منطقة &#39;لتحديد الكريات مع الأبعاد المطلوب أو الخصائص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 50 مل لجمع الكريات المتعددة التي تلبي معايير الفرز. بدلا من ذلك، لوحة عيار الصغيرة يمكن استخدامها لفرز الكريات الفردية. وهناك حاجة إلى الكريات متعددة (10 -10 4 5) لاستخراج الحمض النووي والبروتينات. A بيليه واحدة كافية لتحليل QPCR في التعبير الجيني، ولكن هناك حاجة الكريات متعددة لRNA التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقرر وتعيين عدد من الكريات التي تحتاج إلى أن يتم فرز وانقر على &quot;ترتيب يدويا&quot; لفرز للمعلمات المحددة. عند الوصول إلى المبلغ المحدد من الكريات، وينتهي الفرز تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خلفها العينة مع حقنة 50 مل من عينة كوب وغسل الكأس مع 2X المياه. كرر الخطوات من 5،1-5،5 إذا كان بحاجة إلى عينات أخرى ليتم فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل اغلاق COPAS شطف كوب العينة مع الماء لإزالة الكريات المتبقية وتنظيف كوب عينة مع 70٪ ETOH و / أو 2٪ هيبوكلوريت في الماء. تشغيل عينة من المياه المعالجة بالكلور لتنظيف النظام بأكمله وكرر هذا مع الماء. ر فارغةوقال انه تجاوز الحاويات ونظيفة أو استبدال فلتر التي تتواجد في هذه الحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء، انقر فوق &quot;إيقاف&quot; للافراج عن الضغط من النظام. عندما يغلق توقف المحرك البرنامج وانقر فوق &quot;إيقاف دون تطهير &#39;. ثم إيقاف تشغيل الكمبيوتر، COPAS، ليزر، والمضخة. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

التدفق الخلوي وقد مكن تحليل عالية السرعة أعداد كبيرة من الخلايا واحد، الأمر الذي ساهم في فهمنا لعدم التجانس في السكان نسيلي 6. العادية التدفق الخلوي ليست مجدية لتحليل الكريات أفطوري متعددة الخلايا من streptomycetes والفطريات. وقد أظهرت عملنا أن تحليل الإنتاجية العالية من الكريات المتسلسلة هو ممكن باستخدام COPAS. الإجراء المذكورة هنا هي بسيطة وسريعة، وقابلة للتكرار للغاية. المعلمة الحرجة أن نأخذ في الاعتبار أثناء تشغيل الأداة هي سرعة تدفق، والتي يجب أن لا تتجاوز 100 الأحداث / ثانية (3.8 خطوة من هذا البروتوكول). إذا كان تركيز بيليه، وبالتالي أيضا سرعة التدفق، ويصبح عالية جدا، وسوف أخطأت القيم TOF بسبب فشل أداة للكشف عن الكريات الفردية. تمييع العينة بما فيه الكفاية من خلال إضافة برنامج تلفزيوني يتغلب على هذه المشكلة. القيود استخدام COPAS بلس<html> د هنا له فوهة قطرها من 1 ملم، الذي هو مناسبة لقياس الجسيمات مع حجم تتراوح 30-700 ميكرون. ولهذا يمكن قياس فوهة الكريات التي شكلتها streptomycetes. في حالة الفطريات الخيطية قد تكون المستعمرات الصغيرة أكبر، مما يحد من مدى انطباق العام للCOPAS زائد. وCOPAS XL يمكن قياس الجسيمات يصل إلى 1،500 ميكرومتر في الحجم ولكن حساسيتها في نطاق أقل من قطرها أقل مقارنة بما كان عليه من COPAS زائد. كل من COPAS زائد وCOPAS XL لا يمكن تحليل جسيمات أصغر من 30 ميكرومتر. هذا يعني أن الجراثيم الميكروبية أو الخلايا الفردية لا يمكن تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، قد لا COPAS تحليل بدقة المجاميع الصغيرة من الجراثيم والخلايا أو المستعمرات الصغيرة الصغيرة جدا. لهذا، يجب استخدام تحليل الخلايا العادية. يتم التغلب على هذا القيد من قبل Biosorter من الاتحاد Biometrica، والتي يمكن تحليل الجزيئات في مجموعة من 1-1،500 ميكرون. لكن الجائزة الشراء هو أعلى من ذلك. ر &quot;&gt; استكشاف الأخطاء وإصلاحها وCOPAS هو أداة قوية التي من السهل أن تعمل. ومع ذلك، وأحيانا لا يتم الكشف عن الكريات بعد تحميل عينة في الكأس العينة والبدء في القياس. السبب هو عادة أنبوب دخول انسداد، والتي يمكن بسهولة أن تحل عن طريق الضغط على القيادة &#39;نظيفة&#39;. وهذه القوة الكريات مرة أخرى من نظام أنابيب في الكأس العينة. قد يكون السبب البديلة التي لا غطاء وضعها بشكل صحيح على الكأس العينة. وهذا يؤدي إلى فقدان الضغط والفشل المصاحبة للكشف عن الكريات. أهمية والاتجاهات المستقبلية ركزنا هنا على تحليل حجم بيليه ولكن الإعداد COPAS هي أيضا قادرة على تحليل والفرز على أساس مضان والكثافة. الكشف عن مضان تمكننا من تحليل التعبير الجيني على أساس صحفيين مثل GFP. علاوة على ذلك، يمكن تقييم تكوين الخلايا. أكثر قوة هو الخيار لفصل الكريات وفقا لهذه parameالنسب. فرز الكريات يمكن استخدامها لتحليل المصب، بما في ذلك جميع OMICS-الدراسات. في الواقع، ونحن فرزها سابقا 60،000 الكريات الكبيرة والصغيرة 200،000، وأثبتت أن بروتيوم كانت مختلفة بشكل ملحوظ بين الكريات الكبيرة والصغيرة 4. وبالتالي توفر هذه التكنولوجيا خيوط جديدة لتحسين streptomycetes كمصانع الخلية. الميزة الأساسية لتكنولوجيا COPAS هو الوقت. أجريت الدراسات السابقة على الكريات الخلايا باستخدام المجهر، وهذا يحد من عدد الكريات التي يمكن تحليلها تصل إلى عدة مئات 16. اقترحت الدراسات المجهري بالفعل وجود اثنين من السكان من الكريات في نمت السائل المتسلسلة الثقافات 16. في الواقع، تم الكشف عن اثنين من سكان كريات بغض النظر عن الظروف والثقافة في عدد كبير من streptomycetes مختلفة 4. لا يقتصر هذا الحجم إلى عدم التجانس streptomycetes الخيطية، ولكن لوحظ أيضا في الفطريات الخيطية 12 &lt;/ سوب&gt;. في جميع الحالات، والآليات الكامنة وراء عدم التجانس ليست معروفة حتى الآن. إمكانية فرز الكريات وفقا لحجم ومضان تمكننا من كشف مثل هذه الآليات.

Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي هي معروفة جيدا لكفاءتهم لجعل المضادات الحيوية، وكذلك المركبات التي يمكن استخدامها بوصفها مناعة أو لمكافحة العدوى الفطرية أو 1،2 السرطان. بالإضافة إلى ذلك، هذه الكائنات تنتج الأنزيمات التي تهم لمجموعة واسعة من التطبيقات الصناعية 3. ويتم إنتاج معظم هذه المركبات للاهتمام تجاريا في المفاعلات الحيوية. ويتميز نمو streptomycetes في المفاعلات الحيوية عن طريق تشكيل هياكل معقدة من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم كتل أو حبيبات. هذه الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة للغاية فيما يتعلق بحجم 4 ويمكن أن تصل إلى الأحجام التي هي أكثر من مليون مرة أكبر من البكتيريا وحيدة الخلية مثل الإشريكية القولونية أو العصوية الرقيقة. على الرغم من أن يعتبر عدم التجانس كصفة مفيدة في النظم البيولوجية الطبيعية 5، فهو يعتبر شرك الإنتاج في الصناعة. الحيويالزراعات مفاعل يجب أن تكون قابلة للتكرار ويمكن السيطرة عليها للحصول على أعلى العوائد الممكنة. وبالتالي، فإن فهم مفصل لدور كل نوع من أنواع بيليه في مفاعل حيوي هو أمر حاسم لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية. التدفق الخلوي يستخدم عادة لتحليل الخلايا الفردية في عدد السكان 6. يمكن الحصول على معلومات أجهزة قياس التدفق الخلوي multiparametric عن طريق قياس الخصائص في وقت واحد من الخلايا (مثل الحجم، والكثافة، ومتعدد الألوان مضان). في هذه الطريقة، خصائص الخلية يمكن ربط مما يسهم في فهمنا لعدم التجانس داخل ثقافة ووجود السكان متميزة من الخلايا 6. جعلت أدوات أكثر تخصصا من الممكن لفرز الخلايا وفقا لمعايير المعرفة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، يمكن فحص المسوخ. بعد الفرز، مثل خلايا متحولة يمكن زراعتها لمزيد من التوصيف. وقد ثبت هذا بالفعل أن تكون مفيدة، من بين أمور أخرى،لتحسين إنتاجية سلالات 7،8. الفتحات من أجهزة قياس التدفق الخلوي تسمح عادة لمرور الخلايا التي يبلغ قطرها القصوى من ما يقرب من 10 ميكرون. وبالتالي، الكريات من streptomycetes لا يمكن تحليلها مع أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية. هم، ومع ذلك، يمكن تحليلها مع كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). مثل أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية، ويمكن الحصول على البيانات COPAS multiparametric الجسيمات بطريقة إنتاجية عالية. اعتمادا على نوع من COPAS يمكن تحليلها 10-1،500 ميكرون الحجم. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح للفرز من الجزيئات الفردية التي يمكن استخدامها للزراعة أو التحليلات المصب، مثل عزل DNA، RNA، أو البروتينات. وقد تم تصميم COPAS البداية لتحليل وفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة، مثل الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس 9، والأجنة واليرقات ذبابة الفاكهة 10. كما تم استخدام الصكوك لالزرد 11 لالثانية للفطريات خيطية 12،13. كما تشكل الكائنات الحية الأخير الكريات أفطوري التي هي أكبر من تلك التي شكلتها البكتيريا الخيطية. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن استخدام COPAS هي أيضا مجدية لstreptomycetes 4. نحن هنا وصف الإجراء التجريبي لاستخدام COPAS لتقييم بيليه عدم التجانس في المتسلسلة coelicolor، بما في ذلك تفاصيل عن منهجية لفرز وفقا لحجم الكريات. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل أخرى streptomycetes تشكيل بيليه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي تستخدم في الصناعة لانتاج الانزيمات والمضادات الحيوية. عندما نمت في المفاعلات الحيوية، وهذه الكائنات تشكل شبكات من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم الكريات، والتي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والكريات أفطوري الفرز باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). يتم إعطاء تعليمات مفصلة للاستعمال الصك والتحليل الإحصائي للبيانات الأساسية. وصفنا وعلاوة على ذلك كيف يمكن فرز الكريات وفقا للإعدادات المعرفة من قبل المستخدم، والتي تمكن معالجة المصب مثل تحليل الحمض النووي الريبي أو محتوى البروتين. باستخدام هذه المنهجية يمكن معالجتها آلية النمو غير متجانسة الأساسية. وسوف يكون هذا مفيدا لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية، نظرا لكون الإنتاجية يرتبط حجم بيليه.

قياسات COPAS الكريات المتسلسلة Streptomycetes تشكيل الكريات أفطوري في الثقافات السائلة التي لديها مجموعة واسعة من الأحجام. لتحليل توزيع حجم بيليه، السائل 2 يوما من العمر تعرضت نمت المتسلسلة الثقافة coelicolor لتدفق الجسيمات الكبيرة الخلوي باستخدام COPAS بالاضافة الى التعريف مجهزة 1 مم فوهة. وخرج COPAS نموذجي هو مؤامرة مبعثر مثل تصور في الشكل 2A. يمثل المحور س الوقت من الطيران (TOF)، الذي يرتبط مع حجم بيليه (أي يستغرق وقتا أطول لكريات أكبر لتمرير شعاع الليزر). ويبين المحور الصادي انقراض، الذي يمثل الكثافة البصرية للكائن. كل نقطة في المؤامرة مبعثر يتوافق مع حدث واحد، أي بيليه واحد يمر شعاع الليزر. الأهم من ذلك، عندما يتركز العينة أيضا (أي عندما يكتشف الليزر أكثر من 100 الأحداث / ثانية)، يفشل COPAS في كثير من الأحيان للكشف ع الفرديةellets. وهذا يؤدي إلى القيم TOF كاذبة التي هي عالية جدا. تمييع العينة يقلل من متوسط ​​قيم TOF، وتصل إلى نقطة حيث لا مزيد من تمييع لم يعد تأثير TOF. يتم التوصل إلى هذه النقطة عندما تم تحليل حوالي 100 الكريات / ثانية. التآمر نقاط البيانات في الرسم البياني يشير إلى أن أحجام ليست موزعة بشكل عادي (الشكل 2B). يظهر التوزيع أن تميل إلى اليمين. تسجيل تحويل مجموعة البيانات أيضا لم يؤدي إلى التوزيع الطبيعي (الشكل 2C). لتقييم ما إذا كان حجم التوزيع يمكن تفسيرها من خلال افتراض وجود مزيج من اثنين من التوزيع الطبيعي والبيانات غرار رياضيا 12،15. وأشار نمذجة الواقع أن حجم التوزيع يمكن تفسير ذلك على افتراض وجود اثنين من السكان متميزة من الكريات. يتألف سكان كريات صغيرة من 92٪ من جميع الكريات بمتوسط ​​حجم 248 ميكرون، في حين أن عدد سكان كبير ااايتيح زيارتها (8٪ من مجموع الكريات) بمتوسط ​​حجم 319 ميكرومتر (لاحظ أن يفترض اثنين من السكان في الوجود عندما الكسر المشاركة ما بين 2،5 حتي 97،5٪). فرز الكريات المتسلسلة وفقا لحجم تم فرز المستعمرات الصغيرة من سكان كريات الكبيرة والصغيرة. تحقيقا لهذه الغاية، تم استخدام متوسط ​​أحجام بيليه السكان اثنين لتحديد حدود للفرز. واعتبرت الكريات أصغر من 248 ميكرون أن يكون من السكان بيليه صغيرة، في حين اعتبرت الكريات أكبر من 319 ميكرون أن يكون من السكان بيليه كبيرة (الشكل 3)، وذلك للحد من الفرز الكريات من الجزء تداخل حجم اثنين التوزيعات. وأظهر التحليل المجهري لفرزها أحجام الكريات المتميزة (الشكل 3). ويمكن جمع المزيد من الكريات المستخدمة في الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، أو العزلة البروتين. &lt;IMG بديل = &quot;الشكل 1&quot; لل: محتوى العرض = &quot;5IN&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. تمثيل تخطيطي من الإعداد التجريبية لقياس وتحليل الكريات المتسلسلة باستخدام COPAS. لمزيد من التفاصيل، راجع الإجراءات التجريبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> الشكل 2. عدم التجانس في حجم بيليه نمت السائل الثقافات المتسلسلة. تحليل COPAS من S. القديمة 2 يوما ثقافة coelicolor YEME (A) يشير إلى أن أحجام بيليه (المشار إليها مع مرور الوقت من القيم الطيران) ليست عادة توزيعد (B)، وذلك عندما لا تصبح-حولت السجل (C). بدلا من ذلك، تم الكشف عن اثنين من السكان من الكريات التي تختلف في TOF (وبالتالي حجم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> الرقم 3. تجزئة الكريات المتسلسلة وفقا لحجم. الكريات مع حجم واعتبرت أصغر من 248 ميكرون (المشار إليها باللون الوردي) لتكون الكريات الصغيرة، في حين اعتبرت الكريات مع حجم أكبر من 319 ميكرون (المشار إليها باللون الأزرق) لتكون الكريات الكبيرة. وأكد التحليل المجهري الفرق في الحجم. لاحظ أنه تم حساب هذه الأحجام من البيانات تحولت سجل باستخدام العلاقة بين وصف TOF ودiameter من بيليه المتسلسلة، أي ما يعادل 0.57 × TOF + 159 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

وتتميز الثقافات المتسلسلة نابعة من السائل بواسطة الكريات أفطوري التي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والفرز مثل الكريات بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الكريات يمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات، التي ستوفر يؤدي إلى فهم والسيطرة على تجانس النمو.

فرز<em&gt; المتسلسلة</em&gt; الكريات الخلية باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K Views.  Leiden University.  وتتميز الثقافات المتسلسلة نابعة من السائل بواسطة الكريات أفطوري التي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والفرز مثل الكريات بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الكريات يمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات، التي ستوفر يؤدي...

Video: Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A Perifusion جزيرة متعدد حدودي النظام داخل جهاز ميكروفلويديك Perifusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

استخدام محلل التدفق الأيضي للخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة الطاقة الحيوية لمنطقة العظام

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من عينات الأنسجة غير المتجانسة المجمدة بدون فرز الخلايا

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...