وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة على جائزة / NHGRI الجينوم الباحث العلمي / كلية الانتقالية (K22 HG002908) لAMD وشراكة استراتيجية بين معهد بيولوجيا الأنظمة وجامعة لوكسمبورغ. طلبات سلالات أو البلازميدات ينبغي أن توجه إلى ايمي دادلي (aimee.dudley @ gmail.com).

1. سلالة البناء وتوصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء سلالة مضاعفا متخالف لاستخدامها في الصليب من قبل التزاوج واختيار سلالات فرداني diploids 2 أو باستخدام سلالة متخالف التي تحدث بشكل طبيعي. ينبغي أن لا تأوي سلالات GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن سلالة غير قادر على تنمو على YPD 2 + 200 ميكروغرام / مل G418. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن سلالة قادرة على sporulate. أفضل متوافق مع انخفاض تبوغ الصلبان الكفاءة، ولكن زيادة التردد المنخفض تبوغ FACS الوقت الفرز المطلوبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء ثقافة O / N من سلالة في 5 مل YPD وتنمو مع الإثارة في 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 0.5 مل من ثقافة O / N ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا غسلها، وإزالة طاف، و resuspend في 2 مل تبوغ متوسطة 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم الخلايا في RT وتحقق يوميا لتشكيل الرباعيات باستخدام المجهر المرحلة على ضوء تباين مع الهدف 40X. </li> &lt;/ رأ&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير الجدوى بوغ الصليب عن طريق تشريح التقليدية 2،3 من عدد صغير (~ 20) من tetrads. بقاء بوغ في الصلبان بين الخلفيات سلالة مختلفة تختلف على نطاق واسع وغير متوقع. ومع ذلك، فإن التوقعات بداهة الجدوى بوغ يمكن استخدامها لتقييم كفاءة أفضل تجربة قبل خطوات العمل ومكثفة من حيث التكلفة لتوفير والتنميط الجيني في السلالات. لذلك، ينصح بشدة هذه الخطوة. </li></ol> 2. تحول Diploids مع مكتبة Barcoded البلازميدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج البلازميد barcoded pCL2_BC في سلالة مضاعفا متخالف باستخدام بروتوكول التحول هو موضح في GIETZ وودز 8 مع التعديلات التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم تحضين الخلايا التي تحتوي على خليط التحول عند 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، إضافة DMSO إلى 8٪ من حجم المزيج التحول. وقد وجد إضافة DMSO لتحسين كفاءة التحول طن بعض الخلفيات سلالة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة الصدمة الحرارية، بيليه الخلايا مع الطرد المركزي وجيزة، صب الخليط التحول، وغسل الخلايا برفق في YPD. ثم، resuspend الخلايا في 1 مل YPD والسماح لهم باسترداد على RT لمدة 3 ساعة دون الانفعالات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد transformants بواسطة الطلاء على YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) لوحات أجار. لضمان بركة معقدة من الرموز الشريطية البلازميد، حصاد عدد كبير من المستعمرات، على سبيل المثال 5 لوحات مع ~ 2،500 المستعمرات في لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة المستعمرات مرئية (2-3 أيام للنمو عند 30 درجة مئوية)، تجميع transformants عن طريق كشط لهم بعناية قبالة لوحة في السائل YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) + 15٪ الجلسرين. دوامة هذا التعليق الخلية، ونقل إلى قارورة الحفظ بالتبريد، وتجميد في -80 درجة مئوية. جعل الأسهم المجمدة منفصلة لكل لوحة. هذه الأرصدة المجمدة بمثابة البداية لسلالات الخطوة 3.1، ويمكن أيضا أن تستخدم لتوليد المزيد من tetrads في وقت لاحق، إذا رغبت في ذلك. </لى&gt; </ol> 3. Sporulating مكتبة الخلايا تحولت إلى الحصول Barcoded Tetrads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إحياء الخلايا من الأسهم المجمدة التي تم إنشاؤها في 2.3 بواسطة O / N النمو في 5 مل YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) عند 30 درجة مئوية مع الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا من O / N الثقافات 3x أخرى في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثم resuspend الخلايا في تبوغ متوسطة 7 بالإضافة إلى 200 ميكروغرام / مل G418. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم الثقافات تبوغ في RT ورصد التقدم المحرز تبوغ يوميا حتى توقفت tetrads جديدة تشكيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ثقافة يحتوي tetrads منسق بشكل جيد وعدد قليل نسبيا من dyads، إزالة الثقافات من الانفعالات وترك في RT لمدة 7 أيام على الأقل. في حين أن بعض الصلبان قد تكون قابلة للهضم وعلى لوحة اضطراب في أقرب وقت شكلت tetrads (المقررة كما هو موضح في 7.3)، والحضانة إضافية (7-10 أيام في تجاربنا) أمر ضروري لالصلبان الأخرى. لذلك، ينصح بشدة هذه الخطوة. </li></ol> 4. إنشاءغيتس نظام مراقبة الأصول الميدانية لالرباعيات الفرز أعرب meiotically SPS2-GFP الانصهار على البلازميد pCL2_BC يسمح tetrads في الثقافة تبوغ ليتم الكشف عن ومعزولة عن الثقافة عن طريق مضان. وقد تم تطوير بروتوكول التالية لFACSAria الثاني. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> يستخدم الرقم 2. نظام مراقبة الأصول الميدانية البوابات. سلسلة من أربع بوابات متسلسلة لعزل tetrads. بوابات هو مبين في (أ) و (ب) يساعد على التقليل من عدد من كتل. ويتم اختيار الأحداث الفلورسنت مع البوابة في (C). الرسم البياني في (D) واثنين من القمم. الأحداث في ذروة اليسار هي في المقام الأول tetrads (يسار الصورة أقحم)، والأحداث في ذروة الحق عموما tetrads مع برعم المرفقة (صورة أقحم اليمين). بوابة النهائيتطبق على هذا الرسم البياني لتحديد الأحداث التي هي في معظمها tetrads (الحانات الحمراء). تم تعديل هذا الرقم من دلو، وآخرون 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الثقافة sporulated من الصعود إلى فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية وإنشاء شركتين الأمام مبعثر مبعثر الجانب وبوابات لاستبعاد الحطام، وخلايا تجمعت، وخلايا متعددة لكل قطرة (أرقام 2A و 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يكون هناك عدد من الخلايا الفلورسنت، والتي عندما باستخدام مراسل بناء SPS2-GFP تشمل dyads وtetrads 10. بوابة GFP مقابل FSC لتشمل هذه الأحداث الفلورسنت (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على خلفية التوتر قد يكون من الضروري لتشمل بوابة إضافية لإزالة كتل التي تشمل tetrads والخلايا الأخرى. إذا كان ذلك ضروريا، وفحص على الرسم البياني FSC الأحداث الفلورسنت وتحديد البوابة التي تشمل الأحداث مع انخفاض FSC (الشكل 2D، الأحداث بوابات باللون الأحمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق كفاءة ر<html> انه النابضة النظام عن طريق الفرز ~ 1،500 tetrads على شريحة المجهر والفرز نسبة tetrads لغير tetrads باستخدام المجهر النقيض من المرحلة في 400X التكبير. في المئة من tetrads يمكن تقديرها بدقة عن طريق عد فقط ~ 200 الأحداث فرزها، ولكن الفرز ~ 1،500 يقلل من مقدار الوقت الذي يقضيه في البحث عن الخلايا على شريحة المجهر. بدلا من ذلك، فإن نسبة tetrads لغير tetrads ويمكن تقييمها خلال الخطوة 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوري تأكد من أن يتم الإبلاغ فارز بدقة عدد من الأحداث عن طريق فرز 25 tetrads على شريحة المجهر ودراسة الخلايا الموجودة في قطيرة باستخدام المجهر النقيض من المرحلة في 400X التكبير. ينبغي أن يكون هناك 25 tetrads في الحبرية. تكرار 3-4X لتقييم التباين الصك نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li></ol> 5. Tetrads الفرز على صفيحة آجار p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الرقم 3. تنسيب لوحة آغار على فارز FACS. لفرز tetrads في قطرة صغيرة من الحل zymolyase وضعت في منتصف معيار (التعميم) لوحة أجار، وهو معيار (100 ملم مستطيلة) لوحة 96 جيدا هو أول وضعت على المسرح من فارز الخلية ويتم برمجة فارز لإيداع tetrads في بئر محددة (في هذه الحالة D5). ثم، يتم وضع لوحة آغار التعميم على الجزء العلوي من لوحة 96 جيدا والانحياز بحيث يتم توسيط قطرة من zymolyase على مدى المحددة جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة العدد المطلوب من YPD G418 + (200 ميكروغرام / مل) لوحات للا يقل عن 1.5 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية وضعه بالقرب من فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن السمات الرئيسية لبروتوكول الفرز هو القدرة على استهداف بدقة FACS فرز tetrads إلى موقع معين على صفيحة أجار التي تحتوي على مجموعة من الحل zymolyase. للقيام بذلك، ضع &quot;معلما&quot; لوحة 96 جيدا على رانه الآلي وحدة ترسب الخلايا (مبدع) من فارز. إعداد تخطيط النوع الذي سيصنف 25 tetrads في بئر واحدة لشكل 96 جيدا. اختيار جيد بالقرب من وسط لوحة، ويظهر على سبيل المثال كذلك D5. الشكل 3 طبق بتري و96 لوحة جيدا تحميلها على فارز الخلية. فرز 25 tetrads في لوحة غلة المستعمرات مفصولة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب كومة من 10 لوحات أجار من الحاضنة 37 درجة مئوية إلى فارز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ واحدة لوحة وماصة أجار 25 ميكرولتر من الحل zymolyase (1 ملغ / مل في 0.7 M السوربيتول) على أجار بالقرب من مركز اللوحة. ثم، وضع لوحة على معالم لوحة 96 جيدا والتوفيق بين الحبرية zymolyase على الهدف بشكل جيد من الخطوة 5.2، على سبيل المثال كذلك D5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء فرز وإيداع 25 tetrads في وسط الحبرية zymolyase على لوحة أجار. ثم، وإزالة وتغطية لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.4 و 5.5 تم فرزها حتى 25 tetrads إلى قطرات zymolyase على كل لوحة في المكدس. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة كومة من لوحات تحتوي على الرباعيات إلى الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من خلال 5.3 5.7 حتى يكون جميع لوحات tetrads. </li></ol> 6. فصل الجراثيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل كومة من الرباعيات التي تحتوي على لوحات أجار عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة، إضافة 15-25 حبات العقيمة 3 مم الزجاج في لوحة، ويهز لوحات كما كومة (أو عن اثنين من أكوام من 5 لوحات) لمدة 3-5 دقيقة. ويتحقق أفضل فصل بوغ عن طريق تحريك لوحات بشكل صارم من جانب إلى آخر أو الأمام إلى الخلف. لا تتحرك لوحات من هذا القبيل أن حبات &quot;دوامة&quot; حول حافة خارج اللوحة. مغادرة الخرز على لوحات عند الانتهاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كومة من لوحات مع حبات مواجهة في حاضنة 30 درجة مئوية. استرداد لوحات كومة المقبل من الحاضنة 37 درجة مئوية، وكرر الخطوة 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات O / N عند 30 درجة مئوية. </li></ol> 7. حصاد المستعمرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعدوالحضانة O / N عند 30 درجة مئوية، مستعمرات صغيرة ينبغي أن يكون شكلت على لوحات. إزالة بعناية لوحات من الحاضنة دون إزعاج الخرز الزجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخرز الزجاجي كتبها بعناية وبسرعة عكس لوحات أكثر من وعاء عميق. يجب أن تكون الحاوية عميقة بما فيه الكفاية للقبض على حبات دون السماح لهم ترتد صعودا وضرب لوحة آغار. يمكن التنصت على الجزء السفلي من لوحة حين هو مقلوب أن يساعد طرد الخرز التي تمسك اللوحة. هذه الخرز يمكن إعادة استخدامها عن طريق الغسيل بالماء والصابون شامل، الشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات وتعقيم بواسطة التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد المستعمرات في كل لوحة واستخدام عدد من المستعمرات لتقدير كفاءة الفصل بوغ والانتعاش. على سبيل المثال، يمكن لكل لوحة 25 tetrads للصليب قرب مع بقاء 100٪ العائد ما مجموعه 100 مستعمرات لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من لوحات مع أعداد كافية من المستعمرات (&gt; 65 لالصلبان عالية الجدوى)، وخلايا نقل كل من كولونيويورك في بئر منفصلة من لوحة 96 جيدا تحتوي على YPD السائل + G418. أيضا، وجعل علما الآبار التي تحتوي على المستعمرات من نفس لوحة أجار؛ وسوف تستخدم هذه المعلومات للمساعدة في برامج الاحالة الرباعيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 96 جيدا لوحات السائل إلى البذور الثقافات لالتنميط الجيني لإنقاذ وسلالات من أسهم الجلسرين المجمدة. التفاصيل حول RAD علامة تسلسل وتحليل تسلسل يمكن العثور عليها في دلو وآخرون 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

مناطق كثيرة من أبحاث الوراثة، بدءا من تعيين سمة معقدة 11 لدراسة الآليات الكامنة وراء إعادة التركيب DNA 12، تتطلب أعداد كبيرة للغاية من ذرية وكميات كبيرة من تسلسل الحمض النووي. التقنيات التي تتزوج قوة الأساليب التقليدية مع قدرة إنتاجية عالية تسلسل الحمض النووي لديها القدرة على تمكين الدراسات التي كانت مستعصية سابقا. على الرغم من أن العديد من الإنتاجية العالية الوراثة الخميرة أساليب تم تطبيقها على نحو فعال لمشاكل محددة، لكل منها القيود التي تقصر من تطبيق واسعة للتحليل الرباعيات التقليدية. أفضل عناوين هذه التحديات من خلال توظيف نهج الإنتاجية العالية الجمع بين تشريح الرباعيات والتنميط الجيني ذرية من الصلبان الخميرة. بالتزامن مع المضاعفة RAD علامة التسلسل، وأفضل يوفر وسيلة غير مكلفة لاستخلاص المعلومات الوراثي لكل سلالة ذرية مع الحفاظ على علاقات الرباعيات عن طريق الباركود الرباعيات فريدة من نوعها.0؛ من استخدام كافة أساليب إنتاجية عالية في الوقت الراهن، وأفضل يلخص أوثق المعلومات التي تقدمها عبر الخميرة تشريح يدويا. أفضل اثنين من السمات الرئيسية. الأول هو استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بسرعة tetrads بعيدا عن خلايا unsporulated في الثقافة (بروتوكول الخطوات 5-6). القدرة على عزل الآلاف من الأحداث الفلورسنت (tetrads) يعطي أفضل أكبر مكاسبه في الإنتاجية. يوفر هذا أتمتة ميزة أكبر دليل على تشريح لالصلبان مع انخفاض كفاءة تبوغ، ويرجع ذلك إلى زيادة الوقت اللازم لتحديد بصريا الأحداث النادرة. ميزة المفتاح الثاني هو استخدام الباركود الجزيئية المعقدة للغاية (البروتوكول الخطوة 2) التي تبث إلى كل بوغ أخت من الرباعيات. لأن هذه الرموز الشريطية يمكن استخدامها لإعادة بناء العلاقات حسابيا الرباعيات بين الجراثيم التي تم توزيعها عشوائيا عبر لوحة آغار، والحاجة إلى يدويا الخلايا مجموعة في الشبكة أمر يتم إنزال. أخيرا،لأن الباركود الجزيئية والجينات مراسل GFP تبوغ محددة ترتبط جسديا (على نفس البلازميد)، ويتم اختيار tetrads الوحيدة التي احتفظت الباركود الجزيئية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز. هناك نوعان من الاعتبارات التي تحكم طول الفترة الزمنية التي ينبغي الثقافات المحتضنة في المتوسط ​​تبوغ. أولا، لأن ما يعبر عنه مراسل محددة تبوغ (SPS2-GFP) في الانقسام الاختزالي في وقت مبكر، GFP وحده لا يميز كاملة tetrads 4 بوغ من الخلايا التي لم تكتمل الانقسام الاختزالي (أي dyads). في حين تبوب FACS إضافية قد يقلل من عدد من الفلورسنت، tetrads غير مكتملة، وأسهل طريقة لخفض هذه الأحداث غير المرغوب فيها وببساطة رصد الثقافة تبوغ (الخطوة 3.3) والشروع توقفت مرة واحدة tetrads جديدة تشكيل. في تجاربنا، وتواتر dyads فرز أقل من 1٪. الثانية، بالنسبة لبعض الصلبان وقتا إضافيا قضى في تبوغ المتوسطة في RT دون التحريض (الخطوة 3.4) سيجيحسن nificantly فصل tetrads من الخرز الزجاجي أثناء الطلاء ((بروتوكول الخطوة 6)، وفي الواقع، هذه الخطوة ضرورية للغاية لتعطيل بعض الصلبان. مثل كل أساليب إنتاجية عالية، وأفضل هو &quot;ضجيج&quot; من النهج التقليدي المقابلة. تخفيض متواضع في كفاءة أفضل مقارنة الرباعيات تشريح التقليدية يمكن أن تنجم عن مزيج من عدة عوامل. أحد العوامل هو فقدان متزايد من الجراثيم قابلة للحياة على خلاف ذلك، والتي يمكن أن تنجم عن الانضمام إلى حبات الزجاج خلال نشر أو زيادة بوغ الموت بسبب الضغوط الميكانيكية لهذه العملية. وهناك عامل ثان يمكن أن يكون فقدان البلازميد بسيطة أثناء الانقسام الاختزالي. هناك عامل ثالث يمكن أن يكون انخفاض فعالية في المستعمرات صالحة للاستعمال الناتجة عن المستعمرات مع الأنماط الوراثية المختلطة، ما يقدر ب ~ 5٪ من المستعمرات في الطيار لدينا الصلبان 1. فمن المرجح أن هذه المستعمرات تمثل إخفاقات شقيقة بوغ الانفصال. لأن فلوري السريعescence الفرز والفصل بوغ تسمح جمع أعداد هائلة من tetrads، وقد تم تجهيز أفضل بشكل جيد للتغلب على النقص في الكفاءة على هذا النطاق. في حين التكرار مستقبل أفضل يمكن زيادة الكفاءة تقترب من تشريح دليل، فإنه ربما يكون من المرجح أن مسار الأسي الحالي من الحمض النووي القدرة التسلسل سوف تعوض سريعا لهذا المستوى من فقدان سلالة صالحة للاستعمال. بغض النظر، فإن القدرة على إجراء تحليل الرباعيات على نطاق والتي أفضل يمكن تطبيقها تمكين الدراسات التي هي غير مجدية بواسطة الطرق اليدوية حاليا.

رسم خرائط الجينات الانتصافي، والمعروف باسم تحليل الرباعيات، أمر أساسي لعلم الوراثة الخميرة. لفترة وجيزة، وتزاوج سلالتين فرداني، تحتوي كل منها على نسخة واحدة من كل كروموسوم، لتشكيل سلالة مضاعفا متخالف مع نسختين من كل كروموسوم، واحد من كل من الوالدين. تجويع الخلايا مضاعفا للنيتروجين يؤدي الانقسام الاختزالي (تبوغ) التي الكروموسومات مكررة، الخضوع لإعادة ترتيب، وتقسيمها إلى أربع خلايا فرداني (جراثيم أو segregants) مع مجموعات جديدة من الأليلات من كل من الوالدين. الجراثيم أربعة الناتجة عن الانقسام الاختزالي واحدة يمكن أن تكون معزولة عن طريق عملية يدوية دعا تشريح الرباعيات. التقليدية الرباعيات تشريح 2،3 التي قد تغير قليلا نسبيا منذ نشر الأصلي في عام 1937 4، لديه ثلاثة أهداف. الأولى، والخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي (tetrads) يجب أن تكون معزولة بعيدا عن خلفية من الخلايا النباتية. في التحليل التقليدي، ويتم ذلك من قبل الباحث الذي، وذلك باستخدامالمجهر، ويحدد بصريا tetrads على صفيحة أجار ويعمل جهاز مياداة مجهرية تحديد بصريا tetrads على صفيحة أجار وباستخدام مياداة مجهرية لنقل الرباعيات إلى منطقة خالية من الخلايا من لوحة. المقبل، وجراثيم أربعة في الرباعيات يجب فصل جسديا لمنع interspore التزاوج. وتعقد جراثيم داخل الرباعيات معا عن طريق كل من زق، وبقايا جدار الخلية للخلية مضاعفا الأصلي، ومجموعة من الجسور interspore 5. في تحليل الرباعيات التقليدية تتم إزالة زق بواسطة الهضم الأنزيمي، ويستخدم الباحث مياداة مجهرية لكسر الجسور interspore وندف بصرف النظر الجراثيم. أخيرا، يتم المحتشدة الجراثيم الفردية في نمط الشبكية التي تحافظ على العلاقة بين الجراثيم، أي جميع ذرية في صف واحد من الأربعة هي جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات الأصلي. باحث الخميرة شهدت يمكن إكمال عملية تشريح 10 tetrads (عدد الحد الأدنى المقبولة عمومافي الصليب) في حوالي 15 دقيقة. قمنا بتطوير الإنتاجية العالية طريقة الرباعيات التنميط الجيني الجديد الذي نسميه ب arcode E nabled S T equencing من etrads (بست) 1. أفضل يوسع عليه الأساليب الحالية في مجال علم الوراثة عالية الإنتاجية من خلال تمكين الجيل والتنميط الجيني لأعداد كبيرة من ذرية التي هي معزولة، مرمزة بالجينات، والحفاظ على كأفراد بطريقة تسمح للعلاقات بوغ الشقيقة من جميع المنتجات الانتصافي أربعة لاستردادها. ويتم إنجاز ذلك باستخدام ثلاث استراتيجيات رئيسية (الشكل 1). الأول هو إدخال بناء المراسل أن التسميات الخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي مع GFP، ويسمح لها أن تكون معزولة من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS). هي ثاني إدراج رمز شريطي الحمض النووي معقدة للغاية (سلسلة من 15 النيوكليوتيدات عشوائي) في شكل يمكن أن ينتقل إلى جميع الجراثيم أربعة من الرباعيات ويمكن قراءتها من قبل تسلسل الحمض النووي المؤتلف من PROGENذ وبالتالي يحدد جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات. هي ثالث خطوة التنميط الجيني، وأفضل متوافق مع العديد من المنصات التي التنميط الجيني التقاط كل من مجموعة من علامات الجيني وكذلك الباركود الرباعيات محددة. نحن توظيف تقييد الحمض النووي المرتبط موقع العلامة التسلسل (RAD وما يليها) 6 الأسلوب الذي يوجه تسلسل الجينوم إلى مواقع محددة تقييد 1، وبالتالي التقاط متسقة 2-3٪ من الجينوم من سلالات ذرية وكذلك الباركود المنقولة البلازميد . انتعاش العلاقات الرباعيات جنبا إلى جنب مع البيانات المستمدة تجريبيا التنميط الجيني عن الصليب يسمح الاستدلال الدقيق للمعلومات في عداد المفقودين، بما في ذلك وضع علامات منخفضة مع تغطية تسلسل وراثى كاملة من الأفراد inviable (وبالتالي غير قابل للاسترداد). هنا، نحن تصف تطبيق الأسلوب في الكائنات الحية الدقيقة الأكثر استخداما لرسم الخرائط الانتصافي، الخميرة S. الخباز. ومع ذلك، مع استبدال طفيفة من الجرمية كائن محددةأيها السادة، مثل البروتينات تبوغ محددة مختلفة تنصهر إلى GFP، ينبغي أن تكون طريقة للتحويل بسهولة إلى الكائنات الدقيقة الأخرى، بما في ذلك الكائنات التي رسم الخرائط الانتصافي هو أكثر بكثير كثيفة العمالة أو مستعصية على الحل في الوقت الراهن. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> الشكل 1. أفضل طريقة. (A) البلازميد pCL2_BC هو البلازميد 2 ميكرون مع GFP الانصهار تبوغ محددة، ومقاومة للG418، والباركود عشوائي 15 مير. يوصف بناء مكتبة البلازميد في دلو وآخرون 1. (ب) يتم تحويل بركة من البلازميدات barcoded في سلالة مضاعفا من كرة عرضية. ثم تزرع (C) Transformants على الاختيار ويتم تجميع ~ 10،000 المستعمرات تحولت وsporulated من. أثناء الانقسام الاختزالي كل بوغ من الرباعيات يرث المشتركPY من البلازميد barcoded. يتم فصل (D) Tetrads من خلايا unsporulated بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والتي تم جمعها على لوحات أجار، حيث يتم هضمها والتي عطلت إتاحة الفرصة أمام كل بوغ لتشكيل مستعمرة. ثم يتم اختيار (E) المستعمرات في لوحات 96 جيدا، phenotyped، ومرمزة بالجينات. خلال التنميط الجيني تتم قراءة الباركود البلازميد وتستخدم لتحديد أربعة أعضاء من كل الرباعيات. تم تعديل هذا الرقم من دلو وآخرون 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

تحليل الرباعيات هو أداة قيمة لعلم الوراثة الخميرة، ولكن طبيعة دليل شاقة عملية أعاق تطبيقها على المقاييس الكبيرة. الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) 1 يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads بحكم بروتين GFP الانصهار تبوغ محددة تسمح مضان تنشيط الخلايا الفرز من tetrads مباشرة على لوحات أجار، حيث يتم هضم إنزيمي زق وتتعطل الجراثيم وبشكل عشوائي من قبل المحتشدة الزجاج والطلاء حبة. ثم يتم تعيين المستعمرات فرداني العلاقات بوغ أخت، أي معلومات حول أي جراثيم نشأت من نفس الرباعيات، وذلك باستخدام الباركود الجزيئية قراءة خلال التنميط الجيني. عن طريق إزالة عنق الزجاجة للتشريح دليل، أو حتى مئات الآلاف من tetrads يمكن أن تكون معزولة في غضون دقائق. نحن هنا تقديم وصف تفصيلي للإجراءات التجريبية المطلوبة لأداء أفضل في الخميرةخميرة الخباز، بدءا من سلالة مضاعفا متخالف من خلال عزل المستعمرات المستمدة من ذرية الانتصافي فرداني.

<html> أفضل يمكن أن تحسن كثيرا من السرعة التي جراثيم من tetrads يمكن أن تكون معزولة. كمثال على الإنتاجية هذا الأسلوب يمكن أن يحقق، ينجز أحد الباحثين في نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز والفصل بوغ (خطوات 5.1 خلال 6.3) مع 149 لوحات أجار في 3 ساعة 1. أن عائد يعادل (حوالي 3،725 tetrads) تتطلب أكثر من 90 ساعة من تشريح اليدوي. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من وسائل إنتاجية عالية، والتكرار الحالي للطريقة ديه بعض فقدان الكفاءة مقارنة تشريح دليل. هذه الخسارة كما يظهر تعافى انخفاض عدد المستعمرات مقارنة مع توقعات محسوبة على أساس الجدوى بوغ الصليب، والتي تحددها تشريح دليل (الخطوة 1.4). على افتراض أن أسباب فقدان بوغ (مناقشة) تؤثر الجراثيم على نحو عشوائي، ويمكن إجراء تقديرات عن عدد المستعمرات استردادها سيكون أعضاء tetrads التي تم استردادها 1، 2، 3، 4 أو جراثيم (الشكل 4). الصفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig4highres.jpg" width="500" /> قد يكون الرقم 4. محاكاة كفاءة الأسلوب على مستوى الرباعيات. الفشل في استعادة بنجاح جراثيم (كما المستعمرات) بسبب inviability بوغ، بوغ التصاق إلى الخرز والزجاج، وعدم الفصل بين الجراثيم عن بعضها البعض، وما كان يستخدم توزيع ذي الحدين لحساب جزء من المتوقع tetrads (مع واحد على الأقل بوغ تعافى بنجاح) إنتاج 4، 3، 2 أو 1 المستعمرات على أساس نسبة كل الجراثيم استردادها بنجاح. هذا الرسم البياني يمكن أن تكون بمثابة دليل الخام إلى عدد من السلالات التي سوف يتم تجميعها في نهاية المطاف إلى 3 - أو 4 - tetrads بوغ. حيث بلغ عدد المستعمرات في الزيادات لوحة، لذلك لا عدد tetrads كاملة استردادها. في وصف التجربة أعلاه، tetrads 25 من كرة عرضية مع بوغ بقاء ما يقرب من 100٪ (كما ديتermined عن طريق تشريح دليل) كانت مطلية 1 على 149 لوحات أجار. في هذه التجربة، وكان الحد الأقصى لعدد المستعمرات لوحظ في لوحة 80، مشيرا إلى أن 20 جراثيم فشلت في شكل مستعمرات منفصلة. وكان متوسط ​​عدد المستعمرات في لوحة 62. المستعمرات من لوحات تحتوي على 61 65 المستعمرات أو أكثر تم حصادها ومتسلسلا. من السلالات التي مرت 3،700 مراقبة الجودة التسلسل، 72٪ يمكن أن تسند حسابيا إلى 3 - أو 4 - tetrads بوغ.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز على لوحات أجار، يفصل الجراثيم عن طريق التحريض مع الخرز الزجاجي، ويحدد التي تستمد المستعمرات المحتشدة عشوائيا من نفس الرباعيات الأصلي باستخدام الباركود الجزيئية.

أفضل: الباركود تمكين تسلسل Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

best-barcode-enabled-sequencing-of-tetrads

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز على لوحات أجار، يفصل الجراثيم عن طريق التحريض مع الخرز الزجاجي، ويحدد التي تستمد المستعمرات المحتشدة عشوائيا من ?...

Video: BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

الكشف عن المتغيرات الجينية النادرة من تسلسل المجمعة عن طريق سبلينتر

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3 ' نهاية تسلسل إعداد مكتبة مع A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

تقييم الآثار الايضيه من Isocaloric 2:1 الصيام المتقطع في الفئران

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...