이틀 된 액체 성장 문화 종류의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 알약을 분석하는 절차를 개략적으로 그림 1에 표시됩니다. 방법에 대한 세부 정보는 다음과 같습니다. 1. (미디어 및 버퍼의 준비 포함) 성장 <ol><li> 배 인산염 완충 생리 식염수 1 L 준비 (PBS를, 80g의 NaCl, 2g의 KCl, 14.4 g 2 HPO 4, pH를 7.4로 조정 증류수 1 L에 2.4 g의 KH 2 PO 4 나). 사용시 PBS의 1 L를 얻기 위해 증류수 900 ml로 10 배 PBS 100 ㎖를 추가합니다. </li><li> YEME 매체의 1 L를 준비 (3g 디프 효모 추출물, 5g 박토 펩톤, 3g Oxoid 맥아 추출물, 10g 포도당, 340g의 자당, 1 L에 증류수까지) 및 2.5 M MgCl2를 100 ㎖. 고압 증기 멸균하여 두 솔루션을 소독. 다른 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 미디어 4,14를 사용할 수 있습니다. </li><li> 100 ㎖의 YEME 매체 및 0.2 ml의 2.5 M MgCl2를 추가멸균 된 250 ㎖의 삼각 플라스크 금속 코일 스프링을 탑재. 공부하는 세균 샘플만큼 플라스크를 준비합니다. </li><li> 106 포자 / ㎖의 포자 농도를 구하는 스트렙토 10 8 포자 각 플라스크에 접종한다. 180 rpm으로 흔들어 동안 30 ° C에서 2 일 동안 박테리아를 성장. </li></ol> 2. 샘플링 <ol><li> 멸균 5 ML 피펫을 사용하여 15 ML 팔콘 튜브에 각 문화에서 5 ㎖ 샘플을 전송합니다. 샘플은 전체 문화를 대표하도록 샘플을 복용하는 동안 부드럽게 진탕 배양. </li><li> 샘플 COPAS 즉시 분석하는 경우에는 샘플 준비 단계를 수행 할 필요가 없습니다. 얼음에 샘플을 유지하고이 프로토콜의 3.1 단계로 진행합니다. 샘플은 이후 시점에서 분석 할 때, 단계 2.3-2.5이 프로토콜에 설명 된 펠릿을 고정한다. 제대로 분석가 후 청소하지 않을 경우 고정도 튜브 시스템에서 박테리아의 성장을 방지합니다에스. 포름 알데히드는 다운 스트림 분석을 방해하지 않습니다와 그 고정을 확인합니다. 예를 들어, RNA는 포름 알데히드로 고정 후 곰팡이 알약에서 분리 할 수​​ 없습니다. 대조적으로, RNA 성공적 70 % 에탄올 (12)와 고정 후 단리 하였다. </li><li> 샘플 5 ㎖에 37 %의 포름 알데히드 600 μl를 추가하고 튜브 배를 반전 섞는다. 30 분 동안 얼음에 샘플을 고정합니다. </li><li> 원심 분리기 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 회 전자에 2,500 XG에 샘플. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 PBS의 5 ㎖로 알약을 씻으십시오. </li><li> 펠렛은 PBS 2 배로 세척 그래서 2.4 단계를 반복합니다. 샘플은 몇 주 동안 4 ° C에서 PBS에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. COPAS 분석 <ol><li> COPAS 플러스, 펌프, 컴퓨터와 488 nm의 아르곤 레이저가 켜져 있고 Biosort 소프트웨어를 시작하고 있는지 확인하십시오. 켜져 있지만, 레이저는 여전히 대기 잠정 될 것이다. </li><li> 칼집 유체 병이 가득하고 있는지 확인폐기물 병이 비어 있습니다. </li><li> 에에 대기 모드에서 488 nm의 아르곤 레이저를 전환 한 후 &#39;START&#39;와 &#39;RUN&#39;을 클릭합니다. 레이저가 켜져있을 때 후 약 60 초, &#39;완료&#39;를 클릭합니다. </li><li> 압력 게이지를 확인합니다. &#39;칼집&#39;에 대한 압력은, &#39;샘플&#39;, &#39;분류기&#39;와 &#39;청소&#39;으로 각각 4.0, 0.5, 2.7, 10.9을 읽어야합니다. </li><li> 다음으로 &#39;압력 OK&#39;에 확인란을 클릭합니다. 시스템은 유동 세포를 소수가 사용 준비가 된 것입니다. </li><li> 기본 설정은 11에서 &#39;지연&#39;과 &#39;폭&#39;7 간주됩니다. 임계 값은 시간의 비행을 대표하는 TOF와 함께, &#39;TOF 최소&#39;에 대한 &#39;신호&#39;에 대한 50, 40로 설정되어 있습니다. (완전성에 대한 모든 &#39;이익&#39;이 1로 설정되고, 트리거는 2.50 ㎒의 선택 &#39;스캔 속도를 선택합니다&#39;EXT (소멸)에 그리고 아래의 &#39;설정&#39;탭에서 설정 우연의 일치가 &#39;강화&#39;로 설정되어 있습니다.). </li><li> 샘플 컵에서 남은 물을 제거D 함께 (50 ㎖ 정도) PBS와 단계 2.2 컵 2.5에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 샘플의 0.1 ML를 추가합니다. 확인 샘플 컵이 제대로 닫혀 있습니다. </li><li> 데이터 수집을 시작하려면 &#39;획득&#39;을 클릭합니다. 초당 30 ~ 50 이벤트 사이에서 얻을 흐름 속도를 관리 할 수​​ 있습니다. 흐름이 너무 높으면, 시료 컵에 PBS를 추가한다. 유속이 너무 낮 으면, 더 많은 샘플을 추가한다. </li><li> 적어도 2,500 이벤트는 클릭 &#39;STOP&#39;을 수집합니다. 모든 데이터를 클릭 &#39;스토어&#39;를 저장하고 이후의 통계 분석을 위해 파일을 저장합니다. Biosort 소프트웨어에만. txt 파일은 후속 분석을 위해 사용되는 그중, 네 개의 파일에 데이터를 저장할 것이다. </li><li> 50 ML의 주사기와 물 2 배 세척과 샘플을 제거하여 샘플 컵을 청소합니다. </li><li> 모든 샘플이 분석 될 때까지 반복 3.7-3.10 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> . txt 파일을 열고 (예 : MS Excel 용 사용) (25)보다 낮은 EXT 데이터를 폐기합니다. 이4,12 (아스 페르 길 루스에 니제르 (150)보다 낮은 EXT 모든 데이터가 삭제됩니다) 파편과 느슨한 균사 조각에 해당한다. &#39;. TXT&#39;다음 (: 많은 데이터 파일이에서 사용할 수있는 프로그래밍 언어 R에 자동화 할 수있는 일반에 하나의 컬럼에 파일을 모든 TOFs을 저장 <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> 확인 SciLab은 (버전 5.3.2 이상 버전 http://www.scilab.org/부터)에서 함께 설명서에 사용할 수있는 &#39;fittools&#39;도서관,,,와 함께 설치되어 있는지 확인합니다 : http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual % 20fittools.pdf </li><li> SciLab를 시작하고 데이터를 모델링하는 fittools 라이브러리의 필요한 기능을 실행합니다. 즉 : (한 번만 필요) 사용 설명서에 표시된 fittools 라이브러리를 설치합니다. <ol><li> fittools 라이브러리를로드합니다. </li><li> SciLab로 데이터 ( &#39;. TXT&#39;파일)을 참조하십시오. </li><li>(자연 로그 기본 로그 함수 인) 데이터를 변환 로그. </li><li> 데이터에 2 인구의 모델을 장착한다. </li><li> 히스토그램 및 모델 (옵션)와 함께 그래프를 그린다. </li><li> 데이터 (1000 회 반복)를 부트 스트랩. </li><li> 부트 스트랩 데이터 세트에 모델을 장착한다. </li><li> 신뢰는 5 매개 변수의 추정 구간들 받으세요. 이는 인구, 그들의 2 수단 (μ 1, μ 2) 및 첨부 표준 편차 (α 1, 2 α)의 참여 비율 (P)에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 95 %의 신뢰 구간은 12,13,15를 (1,000 회 반복)를 부트 스트랩 한 후 모델을 재 장비에 의해 결정됩니다. 수단의 신뢰 구간이 중복되지 않고 (P)의 신뢰 구간이 0.025-0.975 사이에서있을 때 데이터 집합은 정규 분포의 두 개체군의 조합으로서 설명 될 수있다. (일을 참고큰 알약의 참여가 1 인 반면 작은 펠릿의 참여 부분에서 p는 것입니다 -. P) TOF 및 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 직경 사이의 관계는 0.57 × TOF + 159 μm의 4 같습니다. </li></ol></li><li> 경우 두 집단은 상부로 COPAS의 매개 변수를 정렬로 사용하는 평균 TOFs을 발견하고 이후 크고 작은 알약을 정렬 하한. 또한 다른 정렬 파라미터는 사용자의 요구에 따라 선택 될 수 있음을주의한다. </li></ol> 5. 펠렛 정렬 <ol><li> 단계 3.7에 설명 된대로 정렬 할 필요가 스트렙토 샘플을로드합니다. </li><li> &#39;제한을 정렬&#39;으로 설정하고 최소 (LO) 및 최대 (HI) TOF 값에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 또한, &#39;지역&#39;다음 원하는 크기 나 특성을 가진 펠릿을 선택하는 &#39;게이트 영역을 정의&#39;를 선택하여 영역을 설정합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 배치정렬 매개 변수를 충족 여러 개의 알약을 수집합니다. 다르게는, 마이크로 타이 터 플레이트는 개별 펠렛을 정렬하는데 사용될 수있다. 여러 펠렛 (10 4 -10 5) DNA 및 단백질 추출을 위해 필요합니다. 단일 펠릿은 유전자 발현의 qPCR 분석을 위해 충분하지만, 체류 펠릿 RNA 시퀀싱을 위해 필요하다. </li><li> 결정하고 정렬 할 필요가 알약의 수를 설정하고 선택한 매개 변수에 대한 정렬 정렬 수동 &#39;을 클릭합니다. 펠릿의 설정 량에 도달하면, 자동 정렬이 종료된다. </li><li> 샘플 컵에서 50 ML의 주사기와 샘플을 통해 왼쪽을 제거하고 물 2 배와 컵을 세척한다. 다른 샘플을 정렬 할 필요가있는 경우를 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. </li><li> 종료하기 전에 COPAS 남은 알약을 제거하고 70 % EtOH로 및 / 또는 물에 2 % 차아 염소산 샘플 컵을 청소하기 위해 물을 샘플 컵을 씻어. 전체 시스템을 청소하고, 물이 반복 염소화 물 샘플을 실행. 빈 t그는 용기 청소를 오버플로 또는이 컨테이너에있는 필터를 교체합니다. </li><li> 완료되면, 시스템에서 압력을 해제하는 &#39;STOP&#39;을 클릭합니다. 모터 정지 프로그램을 닫고 &#39;정화하지 않고 종료&#39;를 클릭합니다. 그런 다음 컴퓨터, COPAS, 레이저 및 펌프를 끕니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. 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J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. 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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

클론 인구 6 이질성에 대한 우리의 이해에 기여 단일 세포의 많은 수의 고속 분석을 가능하게했습니다 유동 세포 계측법. 일반 유동 세포 계측법은 streptomycetes 및 곰팡이의 균사 다세포 펠릿의 분석에 적합하지 않습니다. 우리의 작업은 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 높은 처리량 분석 COPAS를 사용 가능한 것을 보여 주었다. 여기에 설명하는 절차는 간단하고, 빠르고, 높은 재현성이다. 기기의 동작시주의해야 할 중요한 매개 변수 (스텝이 프로토콜 3.8) 100 이벤트 / 초를 초과하지 않아야 흐름 속도입니다. 펠릿 농도, 따라서 또한 유속이 너무 높게되면 기기가 개별 펠렛을 감지하지 못하기 때문에, TOF 값이 잘못 계산 될 것이다. 충분히 PBS를 첨가하여 시료를 희석하면이 문제를 극복한다. 제한 COPAS 플러스 사용<html> D 여기에 30-700 μm의에 이르기까지 크기로 입자를 측정하기에 적합하다 1mm의 노즐의 직경을 갖는다. 이 노즐은 따라서 streptomycetes에 의해 형성된 펠릿을 측​​정 할 수 있습니다. 사상균의 경우 마이크로 콜로니 COPAS 플러스의 일반적인 적용 가능성을 제한하는, 더 클 수있다. COPAS XL 크기는 1,500 μm의 최대 입자를 측정 할 수 있지만 직경의 낮은 범위의 감도는 COPAS 플러스에 비해 적습니다. COPAS 플러스 및 COPAS XL 모두 30 μm의보다 작은 입자를 분석 할 수 없습니다. 이것은 개별 미생물 포자 또는 세포를 분석 할 수 없다는 것을 의미한다. 또한, COPAS 정확하게 포자 세포 또는 아주 작은 마이크로 식민지의 작은 집계를 분석 할 수 있습니다. 이 경우, 정규 셀 분석기가 사용되어야한다. 이 제한은 1-1,500 μm의 범위에서 입자를 분석 할 수있는 연합 Biometrica의 Biosorter에 의해 극복된다. 구매 상품 그러나 높다. T &quot;&gt; 문제 해결 COPAS는 조작하기 쉬운 강력한 도구이다. 그러나, 때로는 펠렛 샘플 컵에 샘플을로드하고 측정을 시작하면 검색되지 않습니다. 원인은 일반적으로 쉽게 &#39;깨끗한&#39;명령을 가압에 의해 해결 될 수있는 항목이 막힌 관이다. 이것은 샘플 컵에 다시 튜브 시스템에서 펠릿을 강제 할 것이다. 다른 이유는 뚜껑이 제대로 샘플 컵에 배치되지 않도록 할 수 있습니다. 이것은 압력 손실 및 펠렛을 검출 수반 장애에 이르게한다. 의의 및 향후 방향 우리는 여기에서 펠릿 크기의 분석에 초점을 맞추고 있지만, COPAS 설정도 분석 할 수와 종류의 형광 및 밀도에 기반하고 있습니다. 형광 검출은 GFP로 기자를 기반으로 유전자 발현을 분석하는 가능하게한다. 또한, 세포의 조성물을 평가할 수있다. 더욱 강력한 이러한 매개에 따라 알약을 분리하는 옵션입니다TERS. 정렬 펠릿은 모든 오 믹스 연구 등의 다운 스트림 분석, 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 이전에 60,000 대와 20 만 작은 알약을 정렬하고 프로테옴 크고 작은 펠릿 4 사이에 유의 한 차이 것을 보여 주었다. 이 기술은 따라서 세포 공장으로 streptomycetes을 개선하기 위해 새로운 단서를 제공한다. COPAS 기술의 주요 장점은 시간입니다. 세포 펠렛에 대한 이전의 연구는 현미경을 사용하여 수행하고, 이것은 수백 16 개까지 분석 할 수있는 펠릿의 수를 제한 하였다. 현미경 연구는 이미 액체 성장 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 문화 (16)의 펠릿의 두 집단의 존재를 제안했다. 실제로, 펠렛이 집단은 상이한 streptomycetes 4의 다수에 관계없이 배양 조건의 검출 하였다. 이 크기 이질성은 사상균 streptomycetes에 한정되지 않고, 또한 사상균 12에서 관찰되었다 &lt;/ SUP&gt;. 모든 경우에, 이성의 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 알약을 정렬 할 가능성이 크기와 형광에 따라 이러한 메커니즘을 해명하는 가능하게한다.

Streptomycetes는 사상 토양 아니라 항생제를 만들기 위해 자신의 능력에 대해 알려진 박테리아뿐만 아니라 면역 억제제 나 곰팡이 감염이나 암 1,2을 방지하는 데 사용할 수있는 화합물이다. 또한, 이러한 유기체는 산업 애플리케이션 (3)의 넓은 범위에 대해 관심있는 효소를 생산한다. 이러한 상업적으로 흥미로운 화합물의 대부분은 생물 반응기에서 생산됩니다. 생물 반응기에서 streptomycetes의 성장은 대단히 짧은 시간 또는 펠렛으로 알려진 상호 균사의 복잡한 구조의 형성이 특징입니다. 이러한 다세포 구조는 사이즈 4에 대한 매우 이질적인 및 대장균 또는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 등의 단세포 박테리아보다보다 백만 배 더 큰 크기에 도달 할 수 있습니다. 이성이 자연적인 생물학적 시스템 5에 유리한 특성으로 간주되지만, 그것은 산업의 생산 함정으로 간주됩니다. 바이오원자로 cultivati​​ons가 가장 높은 수율을 얻을 재현하고 제어해야합니다. 생물 반응기에서 펠렛 형태의 각각의 역할의 상세한 이해는 세포 공장 등 streptomycetes을 향상시키는 것이 중요하다. 유동 세포 계측법은 일반적 인구 6에서 개별 세포를 분석하는데 사용된다. 유동 세포 계측기를 동시에 (같은 크기, 밀도 및 다색 형광 등) 세포의 특성을 측정함으로써 multiparametric 정보를 취득 할 수있다. 이러한 방법으로, 세포의 특성을함으로써 우리의 문화 내에서 이질성의 이해와 셀 6의 독특한 집단의 존재에 기여 상관 관계 될 수있다. 보다 전문적인 장비는 사용자 정의 매개 변수에 따라 가능한 세포를 정렬 할 수 만들었습니다. 예를 들어, 돌연변이 검사를 할 수 있습니다. 정렬 후, 이러한 돌연변이 세포가 더 특성화 재배 할 수 있습니다. 이것은 이미 다른 사람의 사이에, 유용한 것으로 입증되었습니다,변종 7,8의 생산성을 향상시킬 수 있습니다. 유동 세포 계측기의 노즐은 일반적으로 약 10 ㎛의 최대 직경이 세포의 통과를 위해 수 있습니다. 따라서 streptomycetes의 펠릿을 일정한 유동 세포 계측기로 분석 될 수 없다. 그러나 이들은 복합 오브젝트 파라미터 분석기 및 분류기 (COPAS)으로 분석 할 수있다. 일정한 흐름 세포 계측기와 마찬가지로 COPAS는 높은 처리량 방식으로 입자의 multiparametric 데이터를 수집 할 수 있습니다. COPAS의 유형에 따라 10-1,500 μm의 입자 크기를 분석 할 수있다. 또, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질의 분리 등의 재배 또는 하류 분석에 사용될 수있는 개별 입자의 선별을 허용한다. COPAS은 초기에 선충 예쁜 꼬마 선충 (9), Drosophila의 배아 및 유충 (10) 작은 다세포 생물의 분석 및 정렬을 위해 설계되었습니다. 악기는 제브라 피쉬 (11)에 사용 된차 사상균 (12, 13)에 대한. 후자의 생물은 사상 박테리아에 의해 형성된 그보다 더 큰 균사체 펠렛을 형성한다. 우리는 최근에 COPAS의 사용도 streptomycetes 4 가능한 것을 증명하고있다. 우리는 여기에 크기에 따라 알약을 정렬하는 방법에 대한 세부 사항을 포함하여, 스트렙토 coelicolor의 펠릿 이질성을 평가하기 위해 COPAS를 사용하기위한 실험 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 펠릿 형성 streptomycetes의 분석에 이용 될 수 있다는 점에 유의하시기 바랍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes 효소 및 항생 물질의 생산을위한 산업에서 사용되는 필라멘트 토양 박테리아이다. 생물 반응기에서 재배 할 경우,이 생명체의 크기는 이질적인 펠릿으로 알려진 상호 균사의 네트워크를 형성한다. 여기에 우리가 분석하는 방법을 설명하고 종류 균사체 펠렛은 복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기 (COPAS)를 사용하여. 자세한 설명은 기기와 데이터의 통계적 분석의 기본적인 사용을 나타낸다. 우리는 또한 이러한 RNA 또는 단백질 함량의 분석과 같은 다운 스트림 처리를 가능하게하는 사용자 정의 설정에 따라 펠릿을 정렬 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여 기계 장치 기본 이종 성장에 태클을 할 수 있습니다. 이것은 생산성 펠릿의 크기와 관련이 있다는 사실을 고려하여, 세포 공장으로 streptomycetes 향상을위한 수단이 될 것입니다.

스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛 COPAS 측정 Streptomycetes 사이즈의 넓은 범위가 액체 문화 균사체 펠렛을 형성한다. 펠릿의 크기 분포를 분석하기 위해 2 일된 액체 성장 스트렙토 coelicolor 배양은 1mm의 노즐을 탑재 COPAS 플러스 프로파일 러를 사용 계측법 큰 입자 흐름을 행 하였다. 일반적인 COPAS 출력은 그림 2A 시각화 등의 산점도이다. x-축은 펠릿 크기 (즉,이 레이저 빔을 통과하는 더 큰 펠릿 오래 걸린다)와 상관되는, 비행 시간 형 (TOF)을 나타낸다. y 축은 객체의 광학 밀도를 나타내는 소멸을 보여준다. 산점도에서 각 점은 레이저 광을 통과 한 펠릿 즉, 개별 이벤트에 대응한다. 샘플이 너무 집중되는 때 (레이저는 100 개 이상의 이벤트 / 초를 감지 할 때 예) 중요한 것은, COPAS 자주 개인 (P)을 감지하는 데 실패ellets. 이것은 너무 높은 거짓 TOF 값에 이르게한다. 샘플을 희석하는 것은 더 희석이 더 이상 영향 TOF하지 않습니다 시점까지의 평균 TOF 값을 줄일 수 있습니다. 약 100 펠릿 / 초 분석 때이 점에 도달한다. 히스토그램에 데이터 포인트를 플롯하면 크기는 일반적으로 (그림 2B)를 배포하지 않는 것을 나타냅니다. 분포는 오른쪽으로 기울어 진 것으로 보인다. 데이터 세트를 변환 로그도 정규 분포 (그림 2C)로 연결되지 않았다. 크기 분포는 데이터가 수학적으로 12,15 모델링, 두 정규 분포의 혼합물을 가정하여 설명 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해. 모델링은 참 크기 분포는 펠릿의 두 개의 별개 집단의 존재를 전제로하여 설명 될 수 있다는 것을 나타냈다. 작은 펠릿의 인구는 248 μm의 평균 크기를 가진 모든 펠릿의 92 %로 구성되어있는 동안 큰 화소의 인구(모든 펠릿의 8 %)가 319 μm의 평균 크기를 가지고 (두 집단이 참가 비율은 2.5-97.5 % 사이에있을 때 존재하는 것으로 간주됩니다 참고) 할 수 있습니다. 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 정렬 크고 작은 펠릿의 인구에서 마이크로 콜로니를 분류했다. 이를 위해, 두 집단의 평균 크기는 펠렛 정렬하는 경계를 정의하는 데 사용 하였다. 319 μm의보다 큰 알갱이가 큰 펠릿 인구 (그림 3)에서 간주 된 반면, 두 가지 크기의 중첩 부분에서 펠릿의 정렬 제한 할 수 있도록 248 μm의보다 작은 펠렛은, 작은 펠릿 모집단으로 간주되었다 분포. 정렬 된 펠릿의 현미경 분석은 별개의 크기 (그림 3)을 보여 주었다. 수집 된 펠릿을 추가 DNA, RNA, 또는 단백질 아이솔레이션을 위해 사용될 수있다. &lt;IMG의 고도 = &quot;그림 1&quot;FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot;/&gt; : 콘텐츠 폭 FO = &quot;5 인치&quot; 그림 1. COPAS를 사용하여 스트렙토 펠릿을 측정하고 분석 할 수있는 실험 장치의 도식 표현. 자세한 내용은 실험 절차를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> 액체 성장 스트렙토 문화 그림 2. 펠렛의 크기 이질성. 2 일 된 S.의 COPAS 분석 coelicolor의 YEME 문화 (A)는 (비행 값을 시간으로 표시) 펠렛의 크기는 일반적으로 배포되지 않음을 나타냅니다D (B) 및도 지도록 때 로그 변환 (C). 대신, TOF에 차이 (따라서 크기) 펠릿의 두 집단이 검출 된 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 그림 3. (파란색으로 표시) 319 μm의보다 큰 크기의 알갱이가 큰 알약으로 간주 된 반면, 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 분류. 펠렛 크기 (분홍색으로 표시)보다 작은 248 μm의는, 작은 알갱이로 간주되었다. 현미경 분석은 사이즈의 차이를 확인 하였다. 이 크기는 TOF와 D 사이의 관계를 설명하여 로그 변환 된 데이터를 통해 계산 한 참고0.57 × TOF + 159 μm의에 해당 스트렙토 펠릿의 iameter은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

액체 성장 스트렙토 배양 크기 이질적인 균사체 펠렛을 특징으로한다. 우리는 여기에서 분석하는 방법을 서술하고 높은 처리량의 방식으로 정렬 펠릿. 이러한 펠릿을 성장 이질성을 이해하고 제어하는​​ 단서를 제공 할 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다.

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K 조회수.  Leiden University.  액체 성장 스트렙토 배양 크기 이질적인 균사체 펠렛을 특징으로한다. 우리는 여기에서 분석하는 방법을 서술하고 높은 처리량의 방식으로 정렬 펠릿. 이러한 펠릿을 성장 이질성을 이해하고 제어하는​​ 단서를 제공 할 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다. 

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A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

연구

생물학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...