ההליך לניתוח וסוג Streptomyces כדורים מתרבות שגדל נוזל שני ימים בת מיוצג באופן סכמטי באיור 1. פרטים על השיטה הם כדלקמן. 1. צמיחה (כולל הכנת מדיה וBuffers) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של 10x בופר פוספט (PBS; 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, 2.4 גרם KH 2 PO 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים מותאם pH 7.4). בזמן שימוש להוסיף של 10x PBS 100 מיליליטר ל900 מיליליטר של מים מזוקקים כדי לקבל 1 ליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיום YEME (3 תמצית גרם Difco שמרים, 5 peptone גרם Bacto, 3 גרם תמצית מאלט Oxoid, 10 גרם גלוקוז, סוכרוז 340 גרם, מים מזוקקים עד 1 ליטר) ושל 2.5 M MgCl 2 100 מיליליטר. לעקר את שני הפתרונות על ידי מעוקר. שים לב שניתן להשתמש בם תקשורת Streptomyces גם אחרת 4,14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 בינוני מיליליטר YEME ו0.2 מיליליטר 2.5 M MgCl 2 עדבקבוק מיליליטר Erlenmeyer סטרילי 250 מצויד במעיינות מפותלות מתכת. הכן את צלוחיות רבות כמו דגימות חיידקים ללמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן כל בקבוק עם 10 8 נבגים של Streptomyces להשיג ריכוז נבג של 10 6 מיליליטר / נבגים. לגדל את החיידקים במשך 2 ימים ב30 ° C תוך רועד ב180 סל&quot;ד. </li></ol> 2. דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מדגם 5 מיליליטר מכל תרבות ותרבות לצינור פלקון 15 מיליליטר באמצעות פיפטה מיליליטר סטרילי 5. נער בעדינות את התרבות בעת נטילת המדגם כדי להבטיח כי המדגם מייצג לתרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר דגימות מנותחות מייד עם Copas אין שלבי הכנת מדגם נחוצים. שמור את המדגם על קרח והמשך לשלב 3.1 של פרוטוקול זה. כאשר דגימות מנותחות בנקודת זמן מאוחרת יותר, לתקן את כדורים כפי שמתואר בצעדים 2.3-2.5 של פרוטוקול זה. שים לב כי קיבעון גם מונע צמיחה של החיידקים במערכת צינורות, כאשר לא ניקה כראוי אחרי analyses. להבטיח קיבוע שעם פורמלדהיד אינו פוגע ניתוחים במורד הזרם. לדוגמא, RNA לא יכול להיות מבודד מפטרייתי כדורים לאחר קיבוע עם פורמלדהיד. לעומת זאת, RNA היה מבודד בהצלחה לאחר קיבוע עם אתנול 70% 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μl של פורמלדהיד 37% עד 5 מיליליטר של מדגם ומערבבים על ידי היפוך 3x הצינור. תקן את הדגימות על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות ב2,500 XG ברוטור קבוע על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מוציא בזהירות את supernatant ולשטוף את כדורים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 כך שהכדורים נשטפים עם PBS 2x. ניתן לאחסן הדגימות בPBS על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. </li></ol> 3. Copas ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא Copas בנוסף, המשאבה, המחשב וליזר ארגון 488 ננומטר מופעלים ולהפעיל את תוכנת Biosort. למרות שמופעל, הלייזר עדיין יהיה במודוס המתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אם בקבוק נדן נוזל מלא ובקבוק פסולת הוא ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;התחל&quot; ולאחר מכן &quot;לרוץ&quot; כדי לעבור לייזר ארגון 488 ננומטר ממצב המתנה ב. לאחר כ 60 שניות, כאשר הלייזר פועל, לחץ על &#39;סיום&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מודד לחץ. הלחצים ל&#39;נדן &#39;,&#39; דוגמא &#39;,&#39; סדרן &#39;ו&#39; נקי &#39;צריכים לקרוא סביב 4.0, 0.5, 2.7, ו10.9 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבת הסימון שליד &#39;אישור לחץ &quot;. לאחר מכן, המערכת מספרים ראשונית תא הזרימה ומוכנה לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות סטנדרטיות הם הניחו עם &#39;רוחב&#39; 7 &#39;עיכוב&#39; ב11 ו. ספים נקבעים ב50 עבור &#39;איתותים&#39; ו40 עבור &#39;TOF מינימום&#39;, עם TOF המייצג את הטיסה בזמן של. (לשלמות: כל &#39;הרווחים&#39; נקבעים בבית 1, על ההדק מוגדר בEXT (הכחדה) ובכרטיסייה &#39;ההגדרה&#39; תחת &#39;בחר קצב סריקה&#39; 2.50 MHz נבחר צירוף מקרים מוגדר &#39;משופר&#39;.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שאריות מים מהכוס מדגםד להוסיף 0.1 מיליליטר של מדגם Streptomyces משלב 2.2 או 2.5 בכוס יחד עם PBS (סביב 50 מיליליטר). ודא כוס המדגם סגורה כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;רוכש את&#39; להתחיל לאסוף נתונים. לנהל את זרימת המהירות כדי להשיג בין 30-50 אירועים בשניה. אם הזרימה היא גבוהה מדי, להוסיף PBS לכוס המדגם. אם מהירות הזרימה נמוכה מדי, להוסיף עוד דוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר לפחות 2,500 אירועים נאספים &#39;עצור&#39; קליק. כדי להציל את &quot;החנות&quot; כל קליק נתונים ולשמור את הקובץ שלך לניתוח סטטיסטי שלאחר מכן. תוכנת Biosort תהיה לשמור את הנתונים בארבעת קבצים, מתוכם רק קובץ txt. ישמש לניתוח שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגביע לדוגמא על ידי הסרת את המדגם עם מזרק 50 מיליליטר וכביסה עם 2x מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7-3.10 עד שכל הדגימות מנותחות. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ txt. וזורקים נתונים עם EXT נמוך מ25 (באמצעות למשל MS Excel). זהמתאים לפסולת ושברי hyphal רופפות (לאספרגילוס ניז&#39;ר ​​כל הנתונים עם EXT נמוך 150 מאשר מבוטלים) 4,12. לאחר מכן, שמור את כל TOFs בעמודה אחת במישור קובץ (לנתונים רבים קבצים זה יכול להיות אוטומטי בR שפת תכנות, זמין: &quot;txt.&quot; <a href="http://www.r-project.org">Http://www.r-project.org).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא Scilab (גרסת 5.3.2 או חדש יותר מhttp://www.scilab.org/) מותקנת יחד עם הספרייה &#39;fittools&#39;, שהוא זמין, יחד עם המדריך, מ: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל Scilab ולהפעיל את הפונקציות הכרחיות של ספריית fittools למודל נתונים. בקיצור: התקן את ספריית fittools כפי שמוצג במדריך (נדרש רק פעם אחת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ספריית fittools. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוא את הנתונים (קובץ &#39;. Txt &quot;) לScilab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">התחבר להמיר את הנתונים (יומן טבעי הוא פונקצית יומן ברירת המחדל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המודל של 2 אוכלוסיות לנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשרטט גרף עם היסטוגרמה והמודל (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bootstrap נתונים (1,000 עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המודל למערכי נתוני bootstrapped. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את ביטחון מקטעי זמן הערכות של 5 הפרמטרים. זה יספק מידע על שבריר ההשתתפות (p) של האוכלוסיות, 2 האמצעים שלהם (μ 1 ו μ 2) וסטיות תקן הנלוות (α 1 ו α 2). יתר על כן, את מרווחי ביטחון של 95% נקבעים על ידי תיקון ובשיפוץ עם המודל לאחר bootstrapping (1,000 עותקים) 12,13,15. כאשר מרווחי הביטחון של האמצעים אינם חופפים ומרווח הביטחון של p הוא בין 0.025-0.975 בסיס הנתונים ניתן להסביר כשילוב של שתי אוכלוסיות של התפלגות נורמלית. (שים לב הבשבריר ההשתתפות של כדורים הקטנים הוא p, ואילו ההשתתפות של כדורים הגדולים היא 1 -. עמ &#39;) מערכת היחסים בין TOF והקוטר של גלולה Streptomyces שווה 0.57 × TOF + 159 מיקרומטר 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שתי אוכלוסיות נמצאות שימוש TOFs הממוצע מיון פרמטרים בCopas כעליון וגבול תחתון כדי למיין את כדורים הקטנים וגדולים לאחר מכן. שים לב שגם ניתן לבחור פרמטרים מיון אחרים בהתאם לדרישות של המשתמש. </li></ol> 5. גלולה מיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם Streptomyces שצריך להיות מסודרים כמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדרה &#39;מיון גבולות&#39; ולספק פרטים על המינימלי (Lo) והמקסימאלי (Hi) ערכי TOF. לחלופין, להגדיר אזור על ידי &#39;אזורים&#39; ולאחר מכן &#39;הגדירו שער אזור&#39; כדי לבחור את כדורים עם מידות או תכונות הרצויות בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור 50 מ&quot;ללאסוף כדורים רבים העונים על הפרמטרים מיון. לחלופין, צלחת מייקר כייל ניתן להשתמש כדי למיין כדורים בודדים. כדורים מרובים (10 4 -10 5) יש צורך לדנ&quot;א ומיצוי חלבון. גלולה אחת מספיקה לניתוח qPCR של ביטוי גנים, אבל כדורים מרובים יש צורך ברצף RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט ולקבוע את מספר כדורים שצריכים להיות מסודרים ולחץ על &quot;מיין באופן ידני&quot; כדי למיין לפי הפרמטרים שנבחרו. כאשר מגיע לסכום הקבוע של כדורים, המיון מסתיים באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נשארו מדגם עם מזרק 50 מיליליטר מהכוס המדגם ולשטוף את הכוס עם 2x מים. חזור על שלבים 5.1-5.5 אם דוגמאות אחרות צריכים להיות מסודרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כיבוי Copas לשטוף את כוס המדגם עם מים כדי להסיר את כדורים שנותרו ולנקות את הכוס המדגם עם EtOH 70% ו / או היפוכלוריט 2% במים. הפעל מדגם של מים עם כלור לניקוי המערכת כולה ולחזור על זה עם מים. לא ריקהוא הצפת מיכל ונקי או להחליף את המסנן שנמצא במכל הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשתסיים, לחץ על &#39;עצור&#39; כדי לשחרר את הלחץ מהמערכת. כאשר מפסיק מנוע לסגור את התכנית ולחץ על &quot;כיבוי ללא טיהור &#39;. ואז לכבות את המחשב, Copas, לייזר, ומשאבה. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Cytometry זרימה אפשרה הניתוח המהיר של כמויות גדולות של תאים בודדים, אשר תרם להבנה של ההטרוגניות שלנו באוכלוסיות משובטים 6. cytometry זרימה הסדיר הוא לא ריאלי עבור ניתוח של כדורי mycelial תאיים של streptomycetes ופטריות. העבודה שלנו הוכיחה כי ניתוח תפוקה גבוהה של כדורי Streptomyces אפשרי באמצעות Copas. ההליך המתואר כאן הוא פשוט, מהיר, ושחזור מאוד. הפרמטר הקריטי שכדאי לזכור בעת הפעולה של המכשיר הוא מהירות הזרימה, שלא תעלה על 100 אירועים / שניות (שלב 3.8 של פרוטוקול זה). אם ריכוז גלולה, ולכן גם את מהירות הזרימה, הופך להיות גבוהים מדי, ערכי TOF יהיו שגו משום שהמכשיר לא מצליח לזהות את כדורים בודדים. מספיק דילול המדגם על ידי התוספת של PBS מתגבר על הבעיה הזו. מגבלות שימוש Copas פלוס<html> ד כאן יש קוטר נחיר של 1 מ&quot;מ, אשר מתאים למדידת חלקיקים בגודל שנע 30-700 מיקרומטר. נחיר זה ולכן מאפשר מדידת כדורים שהוקמו על ידי streptomycetes. במקרה של פטריות פילמנטיות מייקר המושבות עשויות להיות גדולות יותר, המגבילה את התחולה הכללית של פלוס Copas. Copas XL יכול למדוד חלקיקים עד 1,500 מיקרומטר בגודל אבל את הרגישות שלו בטווח התחתון של קוטר היא פחות בהשוואה לזה של פלוס Copas. שני פלוס Copas וXL Copas לא יכולים לנתח את החלקיקים קטנים יותר מאשר 30 מיקרומטר. משמעות הדבר הוא כי לא ניתן לנתח נבגים של חיידקים או תאים בודדים. בנוסף, Copas אולי לא במדויק לנתח מצרפים קטנים של נבגים ותאים או מייקר המושבות קטנות מאוד. לשם כך, יש להשתמש בנתחים סלולריים רגילים. מגבלה זו היא להתגבר על ידי Biosorter של איחוד Biometrica, שיכול לנתח את החלקיקים בטווח של 1-1,500 מיקרומטר. הפרס רכישת אולם הוא גבוה יותר. t &quot;&gt; פתרון בעיות Copas הוא מכשיר חזק כי הוא קל לתפעול. עם זאת, לפעמים כדורים לא מזוהים לאחר טעינת מדגם לתוך כוס המדגם והחל המדידה. הסיבה היא בדרך כלל צינור הזנה סתום, אשר בקלות יכולה להיפתר על ידי לחיצה על הפקודה &quot;נקייה&quot;. זה יאלץ את כדורים בחזרה ממערכת צינורות לתוך כוס המדגם. סיבה אלטרנטיבית יכולה להיות שהמכסה אינה ממוקמת כראוי על כוס המדגם. זה מוביל לירידה בלחץ והכישלון במקביל לאיתור כדורים. משמעותו וכיוונים עתידיים אנחנו כאן התמקדנו בניתוח של גודל גלולה אבל התקנת Copas היא גם מסוגלת לנתח וסוג המבוסס על הקרינה וצפיפות. גילוי הקרינה מאפשר לנו לנתח את ביטוי גנים המבוסס על כתבים כגון ה-GFP. יתר על כן, בהרכב של תאים יכול להיות מוערך. אפילו חזק יותר היא האפשרות להפריד בין כדורים לפי parame אלהters. כדורים מסודר יכולים לשמש לניתוחים במורד הזרם, ובכלל זה מחקרים כל omics. ואכן, אנחנו מסודרים בעבר 60,000 כדורים 200,000 קטנים וגדולים, והוכיחו כי proteome הייתה שונה באופן משמעותי בין כדורים קטנים והגדולים 4. טכנולוגיה זו ולכן מספקת מוביל חדש כדי לשפר את streptomycetes כמפעלי תא. היתרון העיקרי של טכנולוגית Copas הוא זמן. מחקרים קודמים על כדורי תא בוצעו באמצעות מיקרוסקופ, וזה מגביל את מספר כדורים שניתן לנתח עד כמה מאות 16. מחקרים מיקרוסקופית כבר הציעו את קיומם של שתי אוכלוסיות של כדורים בתרבויות Streptomyces-גדל נוזל 16. ואכן, שתי אוכלוסיות של כדורים התגלו ללא קשר לתנאי תרבות במספר גדול של streptomycetes שונה 4. ההטרוגניות גודל זה אינה מוגבל לstreptomycetes פילמנטיות, אך נצפתה גם בפטריות פילמנטיות 12 &lt;/ Sup&gt;. בכל המקרים, את המנגנון הבסיסי של הטרוגניות עדיין לא ידוע. האפשרות למיין כדורים לפי גודל וקרינה מאפשרת לנו לפענח מנגנונים כאלה.

Streptomycetes הם חיידקי פילמנטיות אדמה שידועים היטב למיומנות שלהם כדי להפוך את האנטיביוטיקה, כמו גם תרכובות שיכולים לשמש כשמה כן היא, או כדי להילחם בזיהומים פטרייתיים או 1,2 הסרטן. בנוסף, אורגניזמים אלה מייצרים אנזימים שיש בם עניין למגוון רחב של יישומים תעשייתיים 3. רוב התרכובות מעניינות מסחרי אלה מיוצרים בbioreactors. צמיחה של streptomycetes בbioreactors מאופיינת על ידי היווצרות של מבנים מורכבים של העובש ביניהם, הידועים כגושים או כדורים. מבנים רב תאיים אלה הם הטרוגנית מאוד ביחס לגודל 4 ויכולים להגיע לגדלים שהם יותר ממיליון פעמים גדולות יותר מאשר חיידק חד תאי כגון Escherichia coli או Bacillus subtilis. למרות ההטרוגניות נחשבת כתכונה מועילה במערכות ביולוגיות טבעיות 5, זה נחשב מכשול ייצור בתעשייה. ביוcultivations כור צריך להיות לשעתקו ושליטה כדי להשיג התשואות הגבוהות ביותר אפשריות. הבנה מפורטת של תפקידו של כל אחד מהסוגים גלולה בbioreactor לכן חיונית כדי לשפר streptomycetes כמפעל תא. Cytometry זרימה משמשת בדרך כלל כדי לנתח תאים בודדים באוכלוסייה 6. cytometers הזרימה יכול לרכוש מידע multiparametric זמנית על ידי מדידת מאפיינים של התאים (כגון גודל, צפיפות, וקרינה ססגוני). בדרך זו, יכולים להיות מתואם מאפייני תא ובכך תורמים להבנה שלנו של ההטרוגניות בתוך תרבות ואת קיומם של אוכלוסיות שונות של תאים 6. מכשירים יותר מיוחדים הפכו אותו ניתן למיין תאים על פי פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. לדוגמא, יכולות להיות מוקרנת מוטציות. בעקבות מיון, יכולים להיות מתורבתים תאים שעברו מוטציה כזו לאפיון נוסף. זה כבר הוכיח את עצמו שימושי, בין השאר,כדי לשפר את הפרודוקטיביות של זני 7,8. חרירי זרימת cytometers בדרך כלל לאפשר המעבר של תאים בקוטר מרבי של כ 10 מיקרומטר. לכן, גלולות של streptomycetes לא יכולות להיות מנותחות עם הזרימה cytometers הרגיל. הם, לעומת זאת, יכולים להיות מנותחים עם האובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). כמו הזרימה cytometers הרגיל, Copas יכול לרכוש נתונים multiparametric של חלקיקים באופן תפוקה גבוה. בהתאם לסוג של Copas ניתן לנתח 10-1,500 מיקרומטר בגודל חלקיקים. בנוסף, היא מאפשרת למיון של חלקיקים בודדים שיכול לשמש לטיפוח או ניתוחים במורד הזרם, כגון הבידוד של DNA, RNA, או חלבונים. Copas תוכנן בתחילה לניתוח ומיון של אורגניזמים רב תאיים קטנים, כגון elegans נמטודות Caenorhabditis 9, ועוברי דרוזופילה וזחלי 10. המכשירים יש גם שימשו ל11 דג הזברהnd ל12,13 פטריות פילמנטיות. גם אורגניזמים האחרונים יוצרים כדורי mycelial שהם אפילו גדולים יותר מאלה שנוצרו על ידי חיידקי פילמנטיות. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי השימוש בCopas הוא גם ריאלי עבור streptomycetes 4. אנחנו כאן מתארים את ההליך הניסיוני לשימוש בCopas כדי להעריך את ההטרוגניות גלולה בcoelicolor Streptomyces, כולל פרטים על המתודולוגיה למיין כדורים לפי גודל. שים לב, עם זאת, כי בשיטה זו יכולה לשמש גם לניתוח streptomycetes יוצרי גלולה האחר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes הם חיידקי אדמת פילמנטיות המשמשים בתעשייה לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה. כאשר גדלו בbioreactors, אורגניזמים אלה יוצרים רשתות של העובש ביניהם, המכונה כדורים, שהם הטרוגניים בגודל. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח ולכדורים מסוג mycelial באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). מקבלות הוראות מפורטות לשימוש במכשיר ואת הניתוח הסטטיסטי הבסיסי של הנתונים. יתר על כן אנו מתארים כיצד ניתן למיין כדורים בהתאם להגדרות משתמש מוגדר, המאפשר עיבוד במורד הזרם, כגון הניתוח של RNA או תכולת חלבון. שימוש במתודולוגיה זו ניתן לטפל הצמיחה הטרוגנית הבסיסית המנגנון. זה יהיה סייע לשיפור streptomycetes כמפעל תא, בהתחשב בעובדה שהפריון בקורלציה עם גודל גלולה.

מדידות Copas של כדורי Streptomyces Streptomycetes יוצר כדורי mycelial בתרבויות נוזליים שיש להם מגוון רחב של גדלים. כדי לנתח את התפלגות גודל גלולה, נוזל 2 יום ישן תרבות coelicolor Streptomyces גדלה היה נתון לזרימת חלקיקים גדולה cytometry באמצעות Copas פלוס Profiler מצויד בזרבובית של 1 מ&quot;מ. פלט Copas טיפוסי הוא עלילת פיזור כגון דמיינו באיור 2 א. ציר x מייצג את (TOF) בזמן של הטיסה, אשר עולה בקנה עם גודל גלולה (כלומר זה לוקח יותר זמן לכדורים גדולים יותר כדי להעביר את קרן הלייזר). ציר ה-Y מציגה את ההכחדה, המייצגת את הצפיפות האופטית של האובייקט. כל נקודה בעלילת הפיזור מתאימה לאירוע בודד, כלומר גלולה אחת שעוברת את קרן הלייזר. חשוב לציין, כאשר המדגם מרוכז מדי (כלומר, כאשר הלייזר מזהה יותר מ -100 אירועים / sec), Copas לעתים קרובות לא מצליח לזהות את p פרטellets. זה מוביל לערכי TOF שווא, כי הם גבוהים מדי. דילול המדגם מפחית את ערכי TOF ממוצע, עד לנקודה שבה מדלל נוסף עושה אין השפעה ארוכה יותר TOF. הוא הגיע לנקודה זו, כאשר כ 100 כדורים / sec נותחו. שרטוט נקודות נתונים להיסטוגרמה מצביע על כך שהגדלים אינם מתפלגים נורמלי (איור 2). החלוקה נראית להיות מוטה לצד ימין. התחבר הפיכת ערכת הנתונים גם לא הוביל להתפלגות נורמלית (איור 2 ג). כדי להעריך אם התפלגות הגודל יכולה להיות מוסברת על ידי הנחה בתערובת של שתי התפלגויות נורמליות נתונים היה במתכונת 12,15 מתמטית. דוגמנות אכן ציינה כי התפלגות הגודל יכולה להיות מוסברת על ידי הנחת שקיומם של שתי אוכלוסיות שונות של כדורים. האוכלוסייה של כדורים קטנים כללה 92% מהכדורים בגודל ממוצע של 248 מיקרומטר, ואילו האוכלוסייה של פל הגדולמאפשר לי (8% מכל כדורים) היו בגודל ממוצע של 319 מיקרומטר (שים לב ששתי אוכלוסיות הם הניחו להתקיים כאשר חלק קטן ההשתתפות הוא בין 2.5-97.5%). מיון של כדורי Streptomyces לפי גודל מיקרו-מושבות מהאוכלוסיות של כדורים קטנים וגדולים מוינו. לשם כך, גדלי גלולה הממוצע של שתי האוכלוסיות שימשו כדי להגדיר את הגבולות למיון. פלטות קטנות יותר מאשר 248 מיקרומטר נחשבו מאוכלוסיית גלולה הקטנה, ואילו כדורים גדולים יותר מאשר 319 מיקרומטר נחשבו מאוכלוסיית הכדור הגדולה (איור 3), כדי להגביל את המיון של כדורים מהחלק החופף של הגודל שני הפצות. ניתוח מיקרוסקופי של כדורים ממוינים הראה הגדלים שונים שלהם (איור 3). כדורים שנאספו יכולים לשמש עוד לדנ&quot;א, רנ&quot;א, או בידודי חלבון. &lt;גובה img = &quot;איור 1&quot; עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; src איור 1. ייצוג סכמטי של הגדרת הניסוי כדי למדוד ולנתח את כדורי Streptomyces באמצעות Copas. לפרטים ראו בפרוצדורות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> איור 2. ההטרוגניות גודל גלולה בתרבויות Streptomyces-גדל נוזליים. ניתוח Copas של ס &#39;2 ימים בת תרבות YEME coelicolor () מצביעה על כך שגדלי גלולה (המסומנים כזמן של ערכי טיסה) הם בדרך כלל לא להפיץד (ב), ולא להיות כל כך כש- הפך יומן (C). במקום זאת, שתי אוכלוסיות של כדורים שונים בTOF (ובכך גודל) התגלו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> איור 3. חלוקה של כדורי Streptomyces לפי גודל. פלטות בגודל קטן יותר מ248 מיקרומטר (מסומנים בורוד) נחשבו לכדורים קטנים, ואילו כדורים בגודל גדול יותר מ319 מיקרומטר (מסומן בכחול) נחשבו לכדורים גדולים. ניתוח מיקרוסקופי אישר את ההבדל בגודל. שים לב שגדלים אלה חושבו מהנתונים הפכו יומן באמצעות היחסים המתוארים בין TOF ודiameter של גלולה Streptomyces, אשר שווה 0.57 × TOF + 159 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

תרבויות Streptomyces-גדל נוזל מאופיינים בכדורי mycelial כי הם הטרוגנית בגודל. אנחנו כאן מתארים שיטה לניתוח וסוג כזה כדורים באופן תפוקה גבוהה. כדורים אלה יכולים לשמש לניתוחים נוספים, אשר יספק מוביל להבין ולשלוט ההטרוגניות צמיחה.

מיון של<em&gt; Streptomyces</em&gt; פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K Views.  Leiden University.  תרבויות Streptomyces-גדל נוזל מאופיינים בכדורי mycelial כי הם הטרוגנית בגודל. אנחנו כאן מתארים שיטה לניתוח וסוג כזה כדורים באופן תפוקה גבוהה. כדורים אלה יכולים לשמש לניתוחים נוספים, אשר יספק מוביל להבין ולשלוט ההטרוגניות צמיחה. 

Video: Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...