Das Verfahren aus einem Zwei-Tage-alten Flüssigkultur gezüchtet analysieren und sortieren Streptomyces Pellets ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Details für das Verfahren sind nachstehend angegeben. 1. Growth (einschließlich der Erstellung von Medien und Puffer) <ol><li> Herstellung von 1 l 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser auf pH 7,4 eingestellt). Zum Zeitpunkt der Verwendung werden 100 ml 10-fach PBS und 900 ml destilliertem Wasser auf 1 Liter PBS erhalten. </li><li> Herstellung von 1 l YEME-Medium (3 g Difco-Hefeextrakt, 5 g Bacto-Pepton, Oxoid 3 g Malzextrakt, 10 g Glucose, 340 g Saccharose destilliertes Wasser bis zu 1 l) und 100 ml 2,5 M MgCl 2. Sterilisieren beide Lösungen durch Autoklavieren. Beachten Sie, dass auch andere Medien verwendet Streptomyces 4,14 werden. </li><li> 100 ml YEME Medium und 0,2 ml 2,5 M MgCl 2 einsterile 250 ml Erlenmeyerkolben mit Metallspiralfedern ausgestattet. Bereiten Sie so viele Flaschen wie Bakterienproben zu studieren. </li><li> Der Kolben Impfen mit 10 8 Sporen von Streptomyces, um eine Sporenkonzentration von 10 6 Sporen / ml zu erhalten. Wachsen die Bakterien, die für 2 Tage bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 UpM. </li></ol> 2. Sampling <ol><li> Übertragen einer 5 ml-Probe von jeder Kultur in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen unter Verwendung einer sterilen 5 ml Pipette. Schütteln Sie die Kultur, während die Probe, um sicherzustellen, dass die Stichprobe repräsentativ für die ganze Kultur. </li><li> Wenn Proben werden sofort mit COPAS analysiert keine Probenvorbereitung notwendig. Halten Sie die Probe auf Eis und gehen Sie zu Schritt 3.1 dieses Protokolls. Wenn Proben werden zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, fixieren die Pellets in Schritten von 2,3 bis 2,5 des Protokolls beschrieben. Beachten Sie, dass Fixierung verhindert auch das Wachstum der Bakterien im Leitungssystem, wenn nicht richtig gereinigt nach analysEs. Stellen Sie sicher, dass die Fixierung mit Formaldehyd Downstream-Analysen nicht behindern. Zum Beispiel RNA nicht von Pilzpellets nach Fixierung mit Formaldehyd, isoliert werden. Im Gegensatz dazu wurde RNA erfolgreich nach der Fixierung mit 70% Ethanol 12 isoliert. </li><li> Add 600 ul 37% Formaldehyd zu 5 ml Probe zugeben und durch Invertieren 3x. Befestigen Sie die Proben auf Eis für 30 min. </li><li> Zentrifuge werden die Proben bei 2500 · g in einem Fest Rotor bei 4 ° C für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Pellets mit 5 ml PBS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,4, so dass die Pellets mit PBS 2x gewaschen. Die Proben in PBS bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. </li></ol> 3. COPAS Analyse <ol><li> Stellen Sie sicher, dass der COPAS Plus, der Pumpe, der Computer und die 488-nm-Argon-Laser eingeschaltet und starten Sie die Biosort Software. Obwohl eingeschaltet, wird der Laser im Bereitschaftsmodus ist. </li><li> Prüfen Sie, ob die Hülle Flüssigkeitsflasche ist voll und derAbfallflasche ist leer. </li><li> Klicken Sie auf &quot;START&quot; und dann &quot;RUN&quot;, um die 488-nm-Argon-Laser aus dem Standby, um einzuschalten. Nach ca. 60 Sekunden, wenn der Laser eingeschaltet ist, klicken Sie auf &#39;Fertig&#39;. </li><li> Überprüfen Sie die Druckmessgeräte. Der Druck für &#39;Mantel&#39;, &#39;Sample &quot;,&quot; Sorter &quot;und&quot; Clean&#39; rund 4,0, 0,5, 2,7 und 10,9 bzw. lesen sollte. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben &quot;Druck OK &#39;. Das System Primzahlen dann die Durchflusszelle und ist einsatzbereit. </li><li> Standardeinstellungen sind mit &quot;Verzögerung&quot; bei 11 und &#39;Breite&#39; 7 angenommen. Schwellenwerte werden bei 50 für &#39;Signal&#39; und 40 für &#39;TOF Mindest&#39; setzen, mit TOF, die die Time-of-flight. (Zur Vollständigkeit: Alle &#39;Gewinne&#39; auf 1 gesetzt, der Trigger auf EXT (Extinction) und in der Registerkarte &quot;Konfiguration&quot; unter Set &#39;Wählen Sie Scan-Rate &quot;2,50 MHz gewählt Zufall zu&quot; Verbesserte &quot;gesetzt ist.). </li><li> Entfernen übrig gebliebenen Wasser aus der Probe eine Tassed 0,1 ml von Streptomyces Probe aus Schritt 2.2 oder 2.5 in der Tasse zusammen mit PBS (ca. 50 ml). Stellen Sie sicher, dass die Probenschale richtig geschlossen ist. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot; Datenerfassung zu starten. Verwalten die Strömungsgeschwindigkeit zwischen 30-50 Ereignissen pro Sekunde erhalten. Wenn die Strömung zu hoch ist, fügen PBS auf der Probenschale. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit zu niedrig ist, fügen Sie weitere Probe. </li><li> Wenn mindestens 2.500 Veranstaltungen werden gesammelt klicken Sie auf &#39;STOP&#39;. Um alle Daten klicken Sie auf &#39;Store&#39; speichern und speichern Sie Ihre Datei für die anschließende statistische Analyse. Die Biosort Software die Daten in vier Dateien zu speichern, von denen nur die. Txt-Datei wird für die nachfolgende Analyse verwendet werden. </li><li> Reinigen Sie die Probenschale, indem die Probe mit einer 50-ml-Spritze und Waschen mit Wasser 2x. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,10, bis alle Proben analysiert. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die. Txt-Datei und entsorgen Sie Daten mit einem EXT unter 25 (unter Verwendung von zum Beispiel MS Excel). Diesentspricht Schmutz und lose Hyphenfragmente (für Aspergillus niger alle Daten mit einem EXT weniger als 150 werden verworfen) 4,12. Dann speichern Sie alle TOFs in einer Spalte in einer einfachen Datei (für viele Datendateien kann dies in der Programmiersprache R, erhältlich von automatisiert werden: &quot;txt&quot;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Stellen Sie sicher, SciLab (Version 5.3.2 oder neuer von http://www.scilab.org/) wird zusammen mit dem &quot;fittools &#39;Bibliothek, die verfügbar ist, zusammen mit der Anleitung aus installiert: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Starten SciLab und führen die notwendigen Funktionen des fittools Bibliothek, um die Daten zu modellieren. Kurz: Installieren Sie die fittools Bibliothek, wie im Handbuch (nur einmal erforderlich) gezeigt. <ol><li> Laden Sie die fittools Bibliothek. </li><li> Lesen Sie die Daten (Datei &#39;. Txt&#39;) in SciLab. </li><li>Melden Sie transformieren die Daten (natürliche Logarithmus ist die Standardprotokollfunktion). </li><li> Setzen Sie das Modell der zwei Populationen zu den Daten. </li><li> Eine Grafik mit dem Histogramm und Modell (optional). </li><li> Bootstrap die Daten (1000 Wiederholungen). </li><li> Setzen Sie das Modell auf die Bootstrap-Datensätze. </li><li> Holen Sie sich das Konfidenzintervall Schätzungen der 5-Parameter. Damit werden die Informationen über die Beteiligung Fraktion (p) der Bevölkerung, ihre zwei Mittel (μ 1 und μ 2) und die zugehörigen Standardabweichungen (α 1 und α 2) zu liefern. Darüber hinaus sind die 95%-Konfidenzintervalle durch die Umrüstung mit dem Modell nach Bootstrapping (1000 Wiederholungen) 12,13,15 bestimmt. Wenn die Vertrauensintervalle der Einrichtung nicht überlappen und das Vertrauensintervall von p zwischen 0,025-0,975 die Datenmenge als eine Kombination von zwei Populationen von Normalverteilungen erklärt. (Beachten Sie, thbei der Teilnahme Fraktion von kleinen Pellets p, während der Beteiligung großer Pellets 1 -. p) Die Beziehung zwischen TOF und der Durchmesser eines Streptomyces Pellet gleich 0,57 × TOF + 159 &amp;mgr; m 4. </li></ol></li><li> Bei beiden Populationen sind die durchschnittlichen Nutzung TOFs als Sortierparameter in der COPAS als obere und untere gefunden verpflichtet, die kleinen und großen Pellets anschließend sortieren. Man beachte, dass auch andere Sortierparameter in Abhängigkeit von den Anforderungen des Anwenders ausgewählt werden. </li></ol> 5. Pellet Sortierung <ol><li> Laden Sie die Streptomyces Probe, die wie in Schritt 3.7 beschrieben sortiert werden muss. </li><li> Set &#39;Sortierung Limits&#39; und Angaben über die minimal (Lo) und maximal (Hallo) TOF-Werte. Alternativ können Sie einen Bereich, indem Sie &quot;Regionen&quot; und dann &quot;Definieren Tor Region &#39;, um die Pellets mit den gewünschten Abmessungen oder Eigenschaften auswählen. </li><li> Legen Sie eine 50-ml-Tube zusammeln mehrere Pellets, die die Sortierparameter erfüllen. Alternativ kann eine Mikrotiterplatte verwendet werden, um einzelne Pellets zu sortieren. Mehrere Pellets (10 4 -10 5) für die DNA-und Proteinextraktion benötigt wird. Eine einzelne Tablette ist ausreichend für qPCR-Analyse von Genexpression, sondern mehrere Pellets für RNA-Sequenzierung erforderlich. </li><li> Entscheiden Sie und stellen Sie die Anzahl der Pellets, die sortiert werden müssen, und klicken Sie auf &quot;Manuelle Sortierung&quot;, um für die ausgewählten Parameter zu sortieren. Wenn die festgelegten Betrag von Pellets erreicht ist, endet die Sortierung automatisch. </li><li> Entfernen übrig Probe mit einer 50 ml Spritze aus dem Probenbecher und waschen Sie die Tasse mit Wasser 2x. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, wenn andere Proben müssen sortiert werden. </li><li> Vor dem Herunterfahren des COPAS spülen Sie den Probenbecher mit Wasser, um die restlichen Pellets zu entfernen und reinigen Sie den Probenbecher mit 70% EtOH und / oder 2% Hypochlorit in Wasser. Führen Sie eine Probe von Chlorwasser, das gesamte System zu reinigen, und wiederholen Sie diese mit Wasser. Leere ter Behälter und sauber überlaufen oder den Filter, der in diesem Container befindet, zu ersetzen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf &quot;STOP&quot;, um den Druck aus dem System zu lösen. Wenn der Motor stoppt schließen Sie das Programm und klicken Sie auf &quot;Herunterfahren ohne Spülung. Dann schalten Sie den Computer aus, die COPAS, die Laser und die Pumpe. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Durchflusszytometrie hat den Hochgeschwindigkeits-Analyse einer großen Anzahl von Einzelzellen, die zum Verständnis der Heterogenität in klonalen Populationen 6 beigetragen aktiviert. Regelmäßige Durchflusszytometrie nicht möglich ist für die Analyse der vielzelligen Myzelpellets von Streptomyceten und Pilze. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Hochdurchsatzanalyse von Streptomyces Pellets ist machbar mit COPAS. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach, schnell und sehr gut reproduzierbar. Der kritische Parameter zu beachten, während des Betriebs des Gerätes, ist die Strömungsgeschwindigkeit, die 100 Veranstaltungen / sec (Schritt 3.8 dieses Protokolls) nicht überschreiten sollte. Wenn der Pellet-Konzentration und damit auch die Strömungsgeschwindigkeit zu hoch wird, werden die TOF-Werte falsch berechnet werden, da das Gerät nicht zu einzelnen Pellets zu erkennen. Ausreichend Verdünnen der Probe durch Zugabe von PBS überwindet dieses Problem. Begrenztheit Die COPAS Plus-Einsatz<html> d hat hier einen Düsendurchmesser von 1 mm, das zum Messen Teilchen mit einer Größe im Bereich von 30 bis 700 &amp;mgr; m ist. Diese Düse ermöglicht daher die Messung Pellets durch Streptomyceten gebildet. Im Fall von filamentösen Pilzen können die Mikrokolonien größer sein, welche die allgemeine Anwendbarkeit des COPAS plus begrenzt. Die COPAS XL können Partikel bis zu 1.500 um Größe zu messen, sondern die Empfindlichkeit im unteren Bereich mit einem Durchmesser von weniger im Vergleich zu dem des Plus-COPAS. Sowohl die Plus-und die COPAS COPAS XL nicht analysieren Teilchen kleiner als 30 um. Dies bedeutet, dass die einzelnen mikrobiellen Sporen oder Zellen können nicht analysiert werden. Darüber hinaus kann die COPAS nicht genau analysieren kleine Aggregate von Zellen oder Sporen und den sehr kleinen Mikrokolonien. Dazu sollten regelmäßige Zellanalysatoren verwendet werden. Diese Einschränkung wird durch die Biosorter der Union Biometrica, die Partikel im Bereich von 1-1,500 um analysieren zu überwinden. Der Kaufpreis ist aber höher. t &quot;&gt; Fehlerbehebung Die COPAS ist ein robustes Gerät, das einfach zu bedienen ist. Aber manchmal Pellets nicht nach dem Laden einer Probe in die Probenschale und Starten der Messung erfasst. Die Ursache ist in der Regel ein Rohr verstopft Eintrag, die leicht durch Drücken der &quot;sauberen&quot; Befehl gelöst werden können. Dadurch werden die Pellets von dem Rohrsystem zurück in den Probenbecher zu zwingen. Ein alternativer Grund könnte sein, dass der Deckel nicht richtig auf dem Probenbecher gelegt. Dies führt zu Druckverlust und die damit einhergehende fehlende Pellets zu erkennen. Bedeutung und zukünftige Richtungen Wir hier konzentrierte sich auf die Analyse der Pellet-Größe, aber die COPAS Setup ist auch in der Lage zu analysieren und auf Fluoreszenz Art und Dichte berechnet. Fluoreszenzdetektion ermöglicht es uns, die Genexpression basierend auf Reporter wie GFP analysieren. Weiterhin kann die Zusammensetzung der Zellen evaluiert werden. Noch leistungsfähiger ist die Möglichkeit, Pellets nach diesen Parameter zu trennenter. Sortiert Pellets können für Downstream-Analysen, einschließlich alle omics-Studien verwendet werden. In der Tat, wir vorher sortiert 60.000 große und 200.000 kleine Pellets, und gezeigt, dass das Proteom war signifikant unterschiedlich zwischen großen und kleinen Pellets 4. Diese Technologie bietet daher neue Leads zu Streptomyceten als Zellfabriken zu verbessern. Der entscheidende Vorteil des COPAS Technologie ist die Zeit. Frühere Studien an Zellpellets wurden unter Verwendung von Mikroskopie und dadurch die Anzahl von Pellets, die bis zu mehreren hundert 16 analysiert werden können, begrenzt. Mikroskopie Studien, die bereits die Existenz von zwei Populationen von Pellets in flüssigem Streptomyces-Kulturen angebaut 16 vorgeschlagen. In der Tat wurden zwei Populationen von Pellets unabhängig von den Kulturbedingungen in einer großen Anzahl von verschiedenen Streptomyceten 4 erfasst. Diese Größe ist nicht auf Heterogenität Faden Streptomyceten beschränkt, sondern wurde auch in Fadenpilze 12 beobachtet &lt;/ Sup&gt;. In allen Fällen werden die zugrunde liegenden Mechanismen der Heterogenität noch nicht bekannt. Die Möglichkeit, Pellets sortieren nach Größe und Fluoreszenz ermöglicht es uns, solche Mechanismen zu entschlüsseln.

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die für ihre Kenntnisse bekannten Antibiotika bilden, wie auch Verbindungen, die als Immunsuppressiva oder zur Bekämpfung von Pilzinfektionen oder Krebs 1,2 verwendet werden können. Darüber hinaus sind diese Organismen produzieren Enzyme, die für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen 3 von Interesse sind. Die meisten kommerziell interessante Verbindungen sind in Bioreaktoren hergestellt. Wachstum von Streptomyceten in Bioreaktoren ist durch die Bildung von komplexen Strukturen von miteinander verbundenen Hyphen, wie Klumpen oder Pellets bekannt ist. Diese multizellulären Strukturen sind sehr heterogen in Bezug auf Größe 4 und Größen, die mehr als eine Million Mal größer als ein einzellige Bakterium wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis sind zu erreichen. Obwohl Heterogenität wird als vorteilhaft Merkmal in natürlichen biologischen Systemen 5 betrachtet, wird es als ein Fallstrick Produktion in der Industrie. BioReaktor Kulturen haben reproduzierbar und kontrollierbar, die eine möglichst hohe Rendite zu erzielen sein. Ein detailliertes Verständnis der Rolle von jedem der Pellet-Typen in einem Bioreaktor ist daher von entscheidender Bedeutung für Streptomyceten als Zellfabrik zu verbessern. Durchflusszytometrie wird üblicherweise verwendet, um einzelne Zellen untersucht in einer Population 6. Durchflusszytometer kann multiInformationen durch gleichzeitiges Messen von Eigenschaften der Zellen (z. B. Größe, Dichte und multicolor Fluoreszenz) zu erwerben. Auf diese Weise können Zelleigenschaften korreliert werden, um dadurch das Verständnis der Heterogenität in einer Kultur und das Vorhandensein von verschiedenen Populationen von Zellen 6 beiträgt. Spezialisiertere Instrumente entsprechend benutzerdefinierten Parametern machte es möglich, Zellen zu sortieren. Zum Beispiel können Mutanten gescreent werden. Nach der Sortierung können solche mutierten Zellen für die weitere Charakterisierung kultiviert werden. Dies wurde bereits als nützlich erwiesen, unter anderem,zur Verbesserung der Produktivität der Stämme 7,8. Die Düsen Durchflusszytometer typischerweise ermöglichen die Passage von Zellen mit einem maximalen Durchmesser von etwa 10 &amp;mgr; m. Daher können Pellets von Streptomyceten nicht mit regelmäßigen Durchflusszytometer analysiert werden. Sie können jedoch mit der komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS) analysiert werden. Wie regelmäßige Durchflusszytometer kann COPAS multi Daten von Teilchen in einem Hochdurchsatz-Art und Weise zu erwerben. Abhängig von der Art der COPAS 10-1,500 &amp;mgr; m große Partikel analysiert werden. Darüber hinaus ermöglicht es für das Sortieren der einzelnen Partikel, die für den Anbau oder Downstream-Analysen verwendet werden können, wie die Isolierung von DNA, RNA oder Proteinen. COPAS wurde zunächst für die Analyse und Sortierung von kleinen mehrzelligen Organismen wie Nematoden Caenorhabditis elegans 9 und Drosophila-Embryonen und Larven 10 ausgebildet. Die Geräte sind auch für Zebrafisch 11 a eingesetztnd für Fadenpilze 12,13. Letztere Organismen bilden auch Myzelpellets, die sogar größer als diejenigen von Fadenbakterien gebildet sind. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Verwendung von COPAS ist auch denkbar Streptomyceten 4. Wir beschreiben hier die experimentelle Verfahren für die Verwendung der COPAS zu Pellet Heterogenität in Streptomyces coelicolor beurteilen, einschließlich Einzelheiten über die Methodik, um Pellets nach Größe zu sortieren. Beachten Sie jedoch, daß dieses Verfahren auch für die Analyse anderer Pellet bildenden Streptomyceten verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
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	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die in der Industrie zur Herstellung von Enzymen und Antibiotika verwendet werden. Wenn in Bioreaktoren gezüchtet, diese Organismen bilden Netzwerke von miteinander verbundenen Hyphen, als Pellets, die in der Größe heterogen sind bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu analysieren und sortieren Myzelpellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS). Ausführliche Anweisungen für die Verwendung des Instruments und der Grund statistische Analyse der Daten. Wir beschreiben außerdem, wie Pellets können sortiert werden nach benutzerdefinierten Einstellungen, die Weiterverarbeitung ermöglicht, wie die Analyse der RNA-oder Proteingehalt. Mit dieser Methode kann der Mechanismus zugrunde liegende heterogene Wachstum angegangen werden. Dies wird entscheidend für die Verbesserung der Streptomyceten als Zellfabrik, in Anbetracht der Tatsache, dass die Produktivität korreliert mit Pelletgröße sein.

COPAS Messungen von Streptomyces Pellets Streptomyceten bilden Myzelpellets in Flüssigkulturen, die eine breite Palette von Größen haben. Um zu analysieren, Pelletgrößenverteilung, eine 2-Tage alten Flüssigkeit gewachsen Streptomyces coelicolor Kultur wurde in großen Partikel Durchflusszytometrie unter Verwendung eines COPAS Plus-Profiler mit einem 1-mm-Düse ausgerüstet unterzogen. Eine typische COPAS Ausgang ist ein Streudiagramm, wie in Abbildung 2A visualisiert. Die x-Achse stellt die Time-of-flight (TOF), die mit Pelletgröße (dh es länger dauert größeren Pellets, um den Laserstrahl passieren) korreliert. Die y-Achse zeigt die Extinktion, die die optische Dichte des Objekts darstellt. Jeder Punkt im Streudiagramm entspricht einem einzelnen Ereignis, dh einem einzigen Pellet Passieren des Laserstrahls. Wichtig ist, dass, wenn die Probe zu konzentriert ist (dh, wenn der Laser detektiert, mehr als 100 Ereignisse / sec), die COPAS häufig nicht zu erkennen einzelnen pellets. Dies führt zu falschen TOF-Werte, die zu hoch sind. Verdünnen der Probe reduziert die durchschnittliche TOF-Werte, bis zu einem Punkt, wo weitere Verdünnungs tut keinen Einfluss mehr TOF. Dieser Punkt ist erreicht, wenn etwa 100 Pellets / sec wurden analysiert. Die graphische Darstellung der Datenpunkte in ein Histogramm zeigt an, dass die Größen nicht normalverteilt sind (Abbildung 2B). Die Verteilung wird nach rechts verschoben sein. Melden Sie sich die Umwandlung der Datenmenge auch nicht zu einer Normalverteilung (Abbildung 2C) führen. Zu beurteilen, ob die Größenverteilung kann durch die Annahme einer Mischung von zwei Normalverteilungen die Daten mathematisch modelliert 12,15 erläutert. Modellierung der Tat gezeigt, dass die Größenverteilung kann durch die Annahme der Existenz von zwei verschiedenen Populationen von Pellets beschrieben. Die Bevölkerung von kleinen Pellets bestand aus 92% aller Pellets mit einer durchschnittlichen Größe von 248 um, während die Bevölkerung der großen pelkönnen (8% aller Pellets) hatte eine durchschnittliche Größe von 319 um (beachten Sie, dass zwei Populationen auszugehen, wenn der Teilnahmeanteil zwischen 2,5 bis 97,5%). Sortieren von Streptomyces Pellets nach Größe Mikrokolonien aus den Populationen von großen und kleinen Pellets wurden sortiert. Zu diesem Zweck wurden die durchschnittliche Pelletgrößen der zwei Populationen verwendet werden, um die Grenzen für die Sortierung definieren. Pellets kleiner als 248 &amp;mgr; m wurden als von dem kleinen Pellet Bevölkerung, während Pellets größer als 319 &amp;mgr; m, wurden als von der großen Pellet Population (Abbildung 3), um so zu begrenzen Sortieren von Pellets aus dem überlappenden Abschnitt der zwei Größen Distributionen. Die mikroskopische Analyse von sortierten Pellets zeigten ihre unterschiedlichen Größen (Abbildung 3). Die gesammelten Pellets können weitere DNA-, RNA-oder Protein-Trennungen verwendet werden. &lt;img alt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus zur Messung und Analyse Streptomyces Pellets mit COPAS. Einzelheiten siehe experimentellen Verfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Abbildung 2. Pelletgröße Heterogenität in flüssiger wachsenen Streptomyces Kulturen. COPAS Analyse einer 2 Tage alten S. coelicolor YEME-Kultur (A) zeigt an, dass Pelletgrößen (als Flugzeit-Werte angegeben) sind in der Regel nicht zu verteilend (B), und auch wenn sich so log-transformiert (C). Stattdessen wurden zwei Populationen von Pellets, die in TOF unterscheiden (und damit Größe) nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 3. Fraktionierung von Streptomyces Pellets je nach Größe. Pellets mit einer Größe kleiner als 248 um (in rosa gekennzeichnet) wurden als kleine Pellets sein, während Pellets mit einer Größe von mehr als 319 um (in blau dargestellt) wurden als große Pellets. Mikroskopische Analyse bestätigt den Unterschied in der Größe. Beachten Sie, dass bei diesen Größen wurden aus den log-transformierten Daten unter Verwendung der beschriebenen Beziehung zwischen TOF und d berechnetiameter eines Streptomyces-Pellet, die 0,57 × TOF + 159 um beträgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Flüssig-grown Streptomyces-Kulturen werden durch Myzelpellets, die in der Größe heterogen sind gekennzeichnet. Wir beschreiben hier eine Methode, um zu analysieren und zu sortieren, wie Pellets in einem Hochdurchsatz-Weise. Diese Pellets können für weitere Analysen, die Leitungen zur Verfügung stellt, zu verstehen und zu steuern Wachstum Heterogenität verwendet werden.

Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K Aufrufe.  Leiden University.  Flüssig-grown Streptomyces-Kulturen werden durch Myzelpellets, die in der Größe heterogen sind gekennzeichnet. Wir beschreiben hier eine Methode, um zu analysieren und zu sortieren, wie Pellets in einem Hochdurchsatz-Weise. Diese Pellets können für weitere Analysen, die Leitungen zur Verfügung stellt, zu verstehen und zu steuern Wachstum Heterogenität verwendet werden. 

Serie: Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Sortierung der

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