نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. البذر من خلايا A549 للعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في حصاد الخلايا، خلية الاحماء مستنبت، برنامج تلفزيوني و0.05٪ التربسين EDTA-في بالحمام المائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS. إزالة برنامج تلفزيوني مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من التربسين EDTA-وتوزيعها على قدم المساواة في القارورة. نقل القارورة في حاضنة مع 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم فصل كل الخلايا، إضافة 7 مل من مستنبت الخلية، resuspend الخلايا، ونقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 10 مل الطازجة مستنبت الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا مع غرفة الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 × 10 6 خلايا في 5 مل من مستنبت الخلية في اثنين من قوارير T25 لكل منهما. احتضان لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. يخدم احد قارورة لمراقبة وهمية واحدة للعدوى الكلورين 13. </li></ol> 2. العدوى مع فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ 13 (الكلورين 13) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: CL 13 هو متحولة الفيروس الموهن في ألمانيا والتي يمكن التعامل معها في ظل الظروف BSL-2. يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية الوطنية ذات الصلة. سوف محرضات أخرى الإنترفيرون نموذجي يكون فيروس سينداي (سلالة Cantell) أو فيروس مرض نيوكاسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ PBS، خالية من مصل المتوسطة، ومستنبت الخلية تحتوي على 5٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.25 × 10 7 PFU / مل من الكلور 13 في المصل خالية المتوسطة لتصيب 2.5 × 10 6 خلايا A549 مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 5. إعداد المبلغ قليلا (حوالي 10٪) أكبر من الحاجة لحساب أخطاء ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح تحت 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من التخفيف الكلورين أو 13من المصل خالية المتوسطة (مراقبة غير مصاب، وهمية) إلى الخلايا، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. نقل قارورة بعناية كل 15 دقيقة لضمان التوزيع العادل للكلور 13 التخفيف وخالية من مصل المتوسطة، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة من العدوى، وإزالة قائح، إضافة 5 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة الخلية مع 5٪ FCS، واحتضان لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 3. إعداد الخلية لست] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد برنامج تلفزيوني / 0.5٪ تريتون X-100 على 4 درجات مئوية. لا تقم بإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني سيرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص الخلايا قبالة، ونقل تعليق الخلية في أنبوب الصقر، وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 30 ميكرولتر PBS / 0.5٪ تريتون X-100. نقل المحللة إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة واحتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 10.000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل المحللة خلية أوضح (طاف) في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين مقايسة برادفورد كما هو موضح في مكان آخر 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزينها في -20 درجة مئوية أو الشروع في عملية الهضم التربسين (4.1) أو PAGE الأصلي (5.1). </li></ol> 4. تحديد بتكوين جزئي التغييرات من التعرف على الأنماط مستقبلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج TPCK-التربسين من الخلية لست] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع L-1-tosylamido-2-الفنيل كيتون كلوروميثيل المعالجة (TPCK) التربسين في برنامج تلفزيوني إلى تركيز العمل النهائية من 2 ميكروغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط في اثنين من أنابيب جديدة لتركيز البروتين النهائي من 25 ميكروغرام لكل المحللة البروتين (وهمية أو كلور 13) في الحجم النهائي من 9 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. وبالتالي، ينبغي أن يكون أربعة أنابيب مع 25 ميكروغرام لكل المحللة، مرتين وهمية والكلورين مرتين العدوى 13. مجموعة واحدة كما مراقبة المدخلات (غير المعالجة) ومجموعة واحدة لتلقي العلاج مع TPCK-التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (غير المعالجة)أو 1 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / ميكرولتر TPCK-التربسين (تركيز النهائي: 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الخلية لست وتخلط ردود الفعل من قبل pipetting. لا تجمد وذوبان الجليد مأخوذة-TPCK التربسين، لأنها سوف تؤثر سلبا على كفاءة الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لست] عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة 5X تغيير طبيعة عينة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10٪ SDS، الجلسرين 50٪، 25٪ β-المركابتويثانول، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) والمغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. من المهم أن لا تمديد الوقت التربسين الحضانة. في حالة أي مقاومة للشظايا البروتيني قابلة للكشف، يجب تقصير وقت التربسين الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغليان، ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS بولي أكريلاميد جل الكهربائي (PAGE) والغربية التنشيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات على كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) هلام بولي أكريلاميد تحتوي على التراص 5٪ على مدى هلام حل 12٪. فصل البروتينات في 25 مللي أمبير في هلام حتىالأزرق برومفينول تنفد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في نقل العازلة (48 ملي تريس، 39 ملي glycin، 1.3 ملي SDS، 20٪ الميثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النشاف مع نظام النشاف شبه الجافة والسماح بنقل البروتينات في 10 V لمدة 1 ساعة. اتخاذ غشاء بها، شطفه بالماء لفترة وجيزة، واتركها لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط الغشاء عن طريق نقل قريبا في الميثانول. يغسل لمدة 5 دقائق مع TBS. منع 10٪ مع الحليب الخالي من الدسم في TBS لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N. غسل 3X الغشاء لمدة 5 دقائق مع كل TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة التخفيف على النحو الموصى به في الجدول 1 واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة إلى جانب الفجل البيروكسيداز في التخفيف 1:20،000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS. احتضان 45 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T، وسوقتا إضافيا مع شمال شرق TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن إشارة استخدام عدة chemiluminescense التجارية ونظام التصوير الرقمي هلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء SDS-PAGE كما هو موضح في 4.2.1. تحميل عينات على هلام بولي أكريلاميد SDS وتشغيل هلام في هلام 25 مللي أمبير في حين يدير برومفينول الأزرق خارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ في RT. تفعل كل حضانات تحت الهز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجل على حل التثبيت تحتوي على 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل المخزن المؤقت إلى حل destaining (25٪ من الإيثانول وحمض الخليك 8٪)، واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الجل مع 0.2٪ Coomassie برلنت الأزرق G-250 في 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون هلام مع الحل destaining وتبادل المخزن المؤقت بعد 10 دقيقة، 30 دقيقة، و 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين هلام في 25٪ من الإيثانول، حمض الخليك 8٪، و 4٪ الجلسرين في 4 درجات مئوية. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التصوير والتحليل كما هو موضح تحت 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. تحليل من oligomeric دول التعرف على الأنماط مستقبلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصفحة الأم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50 ميكروغرام من المحللة الخلية في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني وإضافة 5 × عازلة الأم العينة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 50٪ الجلسرين، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) إلى تركيز النهائي من 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينات فورا على هلام بولي أكريلاميد الأصلي مع 5٪ كما التراص و 8٪ كما حل هلام. فإن أي تأخير يؤدي إلى فقدان المجمعات الأصلي 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام في هلام 20 مللي أمبير في الساعة 4 درجة مئوية مع 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.0 هيدروكسيد الصوديوم، 384 ملي glycin مثل الأنود و 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.3، 384 ملي glycin، 1٪ deoxycholate الصوديوم كمادة عازلة الكاثود. بعد 1.5-2 ساعة (قد ترك برومفينول الفرقة الزرقاء جل ما يقرب من 45 دقيقة في وقت سابق) انتهاء الكهربائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنشيف الغربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط polyvinylidene الفلوريد (PVDF) الغشاء لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في Towbin العازلة (25 ملي تريس، 192 ملي glycin، 0.1٪ SDS، 20٪ الميثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع غرفة طخة الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وملء خزان مع العازلة توين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء النشاف مع 250 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من النشاف المضي قدما كما هو موضح من 4.2.3 جرا. </li></ol></li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع ال...

A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حالة المضيف المضادة للفيروسات. إذا RIG-I في حالة صامتة، أي في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي يجند محددة، يتفاعل البطاقة الثانية مع المجال helicase المركزية ويحتفظ RIG-I في السيارات المثبطة التشكل 7-11. RIG-I بربط قصيرة المزدوجحبلا (س) RNA تحمل 5&#39;-ثلاثي الفوسفات (5&#39;PPP)، طويلة الرنا المزدوج الجديلة، والجيش الملكي النيبالي polyU / UC-الغنية، والهياكل التوقيع الكلاسيكية التي هي موجودة على الجينوم من العديد من الفيروسات RNA 12-16. اثنين من الخصائص الرئيسية لتفعيل RIG-I هي التحول إلى التشكل مغلقة 6،17 وهومو oligomerization 6،18،19. مفتاح بتكوين يعزز الحمض النووي الريبي ملزمة، يعرض بطاقات للإشارات المصب، وreconstitutes موقع أتباز نشطة 8،9،11،20. تشكيل المجمعات RIG-I من oligomeric يؤدي إلى تعزيز توظيف المصب جزيئات محول الإشارات لتشكيل منبر للفيروسات نقل الإشارة 11. سلسلة إشارات RIG-I-تنظيم ينشط في نهاية المطاف عامل النسخ IRF-3 لمدة تصل التنظيم من الانترفيرون (IFN-alpha/beta) الجينات وبالتالي التعبير الجيني للفيروسات حفزت الجينات (ISGS) للاستجابة للفيروسات الكامل 21،22 . واحدة من أفضل ISGS تتميز البروتينات هو تنشيط الحمض النووي الريبين كيناز (PKR) 23. PKR ينتمي إلى عائلة حقيقية النواة ترجمة الشروع عامل ألفا 2 (eIF2α) تحركات ويتكون من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة المجال-N محطة وكيناز C نطاق المحطة. يشكل المجال كيناز واجهة dimerization حاسمة لتفعيل PKR وينفذ وظائف الحفاز للبروتين. ملزمة من PKR لالرنا المزدوج الجديلة الفيروسية يؤدي إلى تغيير موقفها والسماح بتكوين dimerization وصناعة السيارات في الفسفرة في الثريونين 446 بين المخلفات الأخرى. PKR ثم يتوسط الفسفرة من eIF2α، وبالتالي عرقلة ترجمة الفيروسية mRNAs و23-27. كلا RIG-I وPKR الخضوع لإعادة ترتيب هيكلية رئيسية، شكل مجمعات من oligomeric وتكون بعد translationally تعديلها من قبل الفسفرة / نزع الفسفات وubiquitination 10،11،19،23،24،26-29. من أجل فهم أفضل منها هياكل الحمض النووي الريبي الفيروسي يتم تفعيل RIG-I وPKR (وفي أي مرحلة مضادات فيروسية يمكن أن به التدخل)، من المهم أن تحدد بدقة حالة التنشيط. لكل من خنازير تم وصفها سابقا أن التنشيط يؤدي إلى ظهور مقاومة للشظايا البروتين التربسين 6،17،30 والعليا الأوليغومرات 6،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى ثروة من الأدب على هذه العوامل الرئيسية للاستجابة للفيروسات المضيف 1،2،24، وتطبيق أساليب مباشرة يبدو نادرة نسبيا. أملا في تحفيز استخدام أوسع، ونحن نقدم بروتوكولات مريحة وحساسة لتحليل بقوة الدول تفعيل RIG-I وPKR. إصابة الإنترفيرون المختصة خط الخلية البشرية A549 مع المنشط أنشئت من RIG-I وPKR، والموهن فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13) 31،32. بعد إجراء lysing بسيطة، يتم اختبار مقتطفات من الخلايا المصابة بواسطة محدودة التربسين الهضم / تحليل لطخة غربية لتقييم التحول متعلق بتكوين جزئي، والأزرق الأصلي هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) / analys طخة غربيةهو قياس تشكيل الأوليغومرات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة. هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية. محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي. أصيب الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.

تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  Philipps-University Marburg.  يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائ...

Video: Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

الاعتراف ناقلة الغلوتامين البشرة بواسطة الأجسام المضادة IgA و 2 ناقلة الغلوتامين الأنسجة في حالة نادرة من القرد الجلد

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...