يستخدم هذا البروتوكول تقنية مستخدمة على نطاق واسع إلى جانب الكواشف والأدوات التي يمكن الحصول عليها تجاريًا لتقييم تنشيط IRF5 الذاتي أثناء الأحداث المبكرة للتحفيز. ويمكن تطبيقه بسهولة على التحقيق IRF5 البيولوجيا في سياق الخلوية الأخرى. في حين أن PAGE الأصلية هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع، فإن الحصول على نتائج واضحة وقوية وقابلة للتفسير وقابلة للتكرار يمكن أن يكون صعبًا تقنيًا.
استخدام المخزن المؤقت التجاري ونظام الجل يساعد على تقليل التباين. والاهتمام بالتفاصيل أمر ضروري، والخبرة هي مفتاح النجاح في الحصول على نتائج جيدة. يتضمن هذا البروتوكول PAGE الأصلي المعدلة العديد من الخطوات مع تفاصيل خفية التي هي المفتاح للنجاح.
يمكن أن تظهر العرض التوضيحي المرئي هذه التفاصيل التي من شأنها أن تكون مفيدة للباحثين. الحفاظ على ثقافة الخلية CAL-1 في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، مع كامل 1640 1640 1640. عندما تكون جاهزة لتحفيز الخلايا، نقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 200 × ز لمدة خمس دقائق.
إزالة افرنح، وإعادة تعليق بيليه في الوسط للحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة. ثم حساب الخلايا مع قياس الهيموسيت، والبذور لهم في كثافة 1،000، 000 الخلايا في بئر في لوحة ستة جيدا مع أربعة ملليلتر من المتوسط قبل ساخنة في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 إلى 24 ساعة للسماح للالتقاء لتصل إلى 90 إلى 95٪ في اليوم التالي، وتحفيز الخلايا عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر R848 في البئر، مع التأكد من ترك السيطرة بشكل جيد مع الخلايا وليس العلاج R848.
صخرة بلطف لوحة من جانب إلى آخر لتفريق بالتساوي R848، ثم احتضان الخلايا لمدة 2 إلى 16 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة، نقل تعليق الخلية من لوحة إلى أنابيب الطرد المركزي 5 ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة خمس دقائق، ثم إزالة نابيرانت، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
نقل تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتدور عليه في 12، 000 س ز لمدة 30 إلى 60 ثانية في 4 درجات مئوية، ثم إزالة بعناية عظمى. إعداد العازلة تحلل وفقا لاتجاهات المخطوطة، والاحتفاظ بها على الجليد حتى جاهزة للاستخدام. إعادة تعليق بيليه الخلية في 30 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة التحلل، والماصات صعودا وهبوطا لخلط.
ثم احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة. توضيح lysate عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 x ز لمدة 15 إلى 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونقل سوبرنات إلى أنبوب 1.5 ملليلتر المبردة مسبقا، مع التأكد من الحفاظ على مقتطفات على الجليد في جميع الأوقات. ثم، قياس تركيز البروتين باستخدام برادفورد الكاشف.
إعداد العازلات الكهربائية العلوية والسفلى الغرفة وفقا لاتجاهات المخطوطة، وشطف 3-12٪ من هلام PAGE الأصلي بدقة بالماء، دون تشويه الآبار يجب اتخاذ مزيد من الحذر عند التعامل مع deoxycholate الصوديوم. معدات الوقاية الشخصية للحماية مثل معطف المختبر، نظارات السلامة، والقناع مطلوبة للتعامل مع هذه المادة الكيميائية. ثم، تعيين الجل في خزان هلام مصغرة، وإزالة المشط، إضافة مخازن الكهرباء الكهربائية العلوية والسفلى أعدت، وتشغيلها مسبقا في غرفة باردة 4 درجة مئوية أو على الجليد في 150 فولت لمدة 30 دقيقة.
وفي الوقت نفسه، وإعداد العينات للتحميل عن طريق خلط البروتينات الخلوية على الجليد مع 4X الأصلي عينة العازلة. وبمجرد الانتهاء من التشغيل المسبق، قم بتحميل 10 إلى 15 ميكروغرامًا من البروتين لكل بئر، وتشغيل الجل لمدة 30 دقيقة بسرعة 85 فولت، تليها ساعتان بسعر 150 فولت. ثم، نقع الجل في المخزن المؤقت تشغيل SDS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتفعيل غشاء ثنائي فلوروريد البوليفينيدين عن طريق نقعه في الميثانول لمدة خمس دقائق تقريبًا. جعل قطع على زاوية واحدة من الغشاء للإشارة إلى اتجاهها، وتجميع شطيرة نقل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضع كاسيت النقل في الخزان ونقله 20 فولت لمدة ساعة واحدة على الجليد.
ثم إزالة الغشاء من الكاسيت مع ملقط من البلاستيك ومنع الغشاء في منع العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة على شاكر هزاز. بعد ذلك، احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين وغسله مع 1XTBST الغسيل العازلة لمدة ثلاث دقائق أثناء هزاز. ثم احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية مرة أخرى باستخدام 1XTBST الغسيل العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة، وتكرار يغسل.
ثم مسح البقعة باستخدام نظام وثائق هلام المناسبة. باستخدام هذا البروتوكول، تم تحليل خلايا CAL-1 التي تم تحفيزها أو عدم تحفيزها باستخدام R848 باستخدام مناعي. في خلايا CAL-1 غير منبهة تم الكشف عن IRF5 كـ شريط واحد على الصفحة الأصلية المقابلة إلى نموذج أحادية الأحرف الخاصة به.
بالنسبة للخلايا المحفزة ، انخفض مستوى مونومر IRF5 ، في حين زاد مستوى الخافت. تم تنفيذ مناعي مع الأجسام المضادة IRF5 على IRF5 الإفراط في التعبير عن 293 الخلايا التائية المصابة مع مختلف الانشاءات. لم يتم الكشف عن IRF5 في التحكم غير المُصاب، مما يدل على خصوصية الأجسام المضادة لـ IRF5.
تم الكشف عن شريط واحد يقابل IRF5 أحادية اًميركية فقط في الخلايا T 293 over-التعبير IRF5. عندما بنيات ترميز IRF5 تفعيل البروتينات كانت مصابة المشتركة، شريط الهجرة ببطء المقابلة لشكل dimeric من IRF5 ظهرت. ومع ذلك ، NMDA5 ، وهو بروتين ذات صلة إلى RIG -I ، لم تحفز IRF5 ال ديميريون.
استخدام الهلام التدرج الـ Bis-Tris أمر بالغ الأهمية، على الأرجح بسبب مادة PH و التركيب الكيميائي لهذا النظام الكهربائي الهلامي الذي سمح بفصل الأشكال أحادية اللون والزاديمير من IRF5. أيضا، lysing والحفاظ على lysates الخلية في غير denaturing المخزن المؤقت عينة الأصلي يحتفظ هياكل البروتين الأصلي. هنا استخدمنا واحدة متاحة تجاريا التي تم تصميمها لأحماض PAGE الأصلي.
طريقة إضافية أن يكمل إلى حد كبير مع هذا هو ، هو الاستفادة من نظام الجري التدفق الجري من الصور ImageStream لتقييم IRF5 نقل النووية ، وهي المادة التي في IRF5 التنشيط بعد اضميم. عندما يقترن مع بروتوكول لدينا، فإنه بمثابة نوع آخر من الاختبار للتحقق من صحة الخطوات المتضمنة في تفعيل IRF5. كونه منظما رئيسيا للاستجابة الالتهابية، IRF5 يلعب دورا هاما في العدوى والمناعة، وأمراض المناعة الذاتية، والسرطان، والعديد من الأمراض الأخرى الهامة لصحة الإنسان.
وهناك أيضا جهود في تطوير العلاجات لاستهداف IRF5 وعوامل النسخ ذات الصلة. سيسمح هذا البروتوكول للباحثين في مختلف المجالات بفهم وسبر IRF5 البيولوجيا.
