وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة منحة (CIHR MOP-115195) وFRQ-S لتكنولوجيا المعلومات، وهو أيضا المستفيد من CIHR جائزة الباحث الشاب؛ ومجلس الأبحاث السويدي وجمعية السرطان السويدية لOL

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

يصف هذا المقال بروتوكول polysome تجزئة راسخة تليها طريقة التحليل في المنزل وضعت لالتقاط التغيرات النوعية والكمية في النشاط متعدية على نطاق الجينوم واسعة في خلايا الثدييات. لوينبغي إيلاء الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول اهتمام خاص ل1) الخلية confluency (حيث أن أسعار انتشار وتوافر المواد الغذائية ترتبط مع نشاط الترجمة مرنا ويمكن أن تؤثر على تكوين translatome، ينبغي أن تكون الخلية confluency متناسقة عبر مكررات والظروف التجريبية)، 2) تحلل الخلايا السريع (على الرغم من وجود سيكلوهيكسيميد ومثبطات ريبونوكلياز في مخازن، وينبغي أن يكون تحلل سريع، وينبغي مضافين مقتطفات الخلوية على التدرجات السكروز مباشرة بعد تحلل الحمض النووي الريبي لمنع تدهور وتفكك polysomes)، 3) إعداد التدرج (لضمان عالية استنساخ البيانات، ينبغي إعداد التدرجات السكروز باستخدام صانع التدرج وجمعية مهندسي البترولينبغي توخي الحذر عند التعامل معها االجتماعية). بالإضافة إلى دراسة التغيرات في النشاط متعدية، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم وإقامة وظائفها الفسيولوجية. تحقيقا لهذه الغاية، يمكن تحديد مستويات وحالة الفسفرة من مختلف البروتينات المرتبطة الريبوسوم بواسطة TCA هطول، تليها النشاف الغربية، في حين أن البروتين المجمعات المرتبطة الريبوسوم ويمكن immunoprecipitated من الكسور التدرج وتحليلها بواسطة النشاف الغربية أو مطياف الكتلة. والقصور من هذه التقنية هو أن التدرج البطيء طريقة الكسر يمكن أن يؤدي إلى تفكك البروتينات حتى بإحكام التي هي في السريع النقابية / تفارق حركية ملزمة. العوامل المرتبطة البروتينية حديثا توليفها أمثلة نموذجية. البروتينية حديثا توليفها الناشئة تشكل ريبوسوم يمكن أن يجمد على مجمعات البروتين المرتبطة باستخدام ريبوسوم عبر linkers الكيميائية مثل 3، 3&#39;-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. وكشف هذا النهج أن مستقبلات لC المنشط كيناز 1 (RACK1) / ج يونيو كيناز N-محطة (JNK) / ترجمة حقيقية النواة عامل استطالة 1A2 (eEF1A2) معقدة ينظم تدهور البروتينية حديثا توليفها ردا على التأكيد 27. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام منهجية مماثلة في الدراسات التي تبين أن بروتين كيناز C BII (PKCbII) يتم تجنيدهم للريبوسوم بواسطة RACK1 32 وأن تفعيل mTOR معقدة 2 (mTORC2) يحدث على ريبوسوم حيث phosphorylates البروتينية AKT توليفها حديثا وينظم لهم الاستقرار 33،34. القيود الرئيسية للأسلوب polysome تجزئة تليها تحليل انوتا هي: 1) شرط وجود عدد كبير نسبيا من الخلايا (~ 15 × 10 6 خلايا)، 2) عدم وجود معلومات بشأن الموضعية توطين الريبوسوم على جزيء الرنا معين، و 3 ) القضايا المتعلقة مغاير الخلوية والجزيئيةgeneity من الأنسجة الطبيعية والورم. القضايا المتعلقة عدد الخلايا المطلوبة يمكن حلها عن طريق مواءمة قمم أطياف الامتصاصية الموافق monosomes (80S) من الخلايا التي تحد مع تلك التي تم الحصول عليها من خلايا عالية فرة (مثل خلايا هيلا) 35 المبالغ. تقنية التنميط الريبوسوم (انظر أدناه) يمكن استخدامها لتحديد الموضع الدقيق من الريبوسوم على جزيء الرنا معين، في حين تتم مناقشة القضايا المتعلقة آثار الخلط من التجانس الأنسجة على تفسير التغيرات في التعبير الجيني تم الحصول عليها من الأنظمة المعقدة مثل الأنسجة البشرية بالتفصيل في منشور من قبل الكراث وستوري 36. مؤخرا، تم تطوير تقنية التنميط الريبوسوم الرواية، حيث يتم إنشاء الريبوسوم المحمية شظايا (الإقليمي للأمن الغذائي) عن طريق العلاج ريبونوكلياز أنا وتحليلها بواسطة أعماق تسلسل 22. هذه التقنية تسمح بتحديد موقف الريبوسوم في قرار النوكليوتيدات واحد، وبالتالي توفير unpr حتى الآنرؤى ecedented في البيولوجيا الريبوسوم. على سبيل المثال، التنميط الريبوسوم يمكن أن تستخدم لتحديد الكثافة الريبوسوم على جزيء الرنا معين أو تحديد العناصر التي معدلات الترجمة النفوذ بدء مثل مواقع بديلة البدء، البدء في الكودونات غير AUG-والعناصر التنظيمية مثل uORFs. ومع ذلك، هناك العديد من القيود المنهجية التي تحد من قدرة التنميط الريبوسوم إلى تقدير دقيق كفاءة ترجمة مرنا. وتشمل هذه التحيزات مستقلة عرضته تجزئة عشوائية وأنا ريبونوكلياز الهضم، والتحيزات التي أدخلها مثبطات الترجمة (مثل مثبطات استطالة مثل إيميتين وسيكلوهيكسيميد من المرجح أن تحفز تراكم الريبوسوم في مواقع بدء الترجمة)، وعدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة المرتبطة مع عشرات TE فضلا عن عدم دقة في التنبؤ يقرأ التي تنشأ من البروتين الترميز mRNAs و37. ربما الأهم من ذلك، في حين أنالتنميط الريبوسوم يسمح التعرف المباشر على موقف الريبوسوم جزيء الرنا معين، ويقدر عدد ريبوسوم الذي يرتبط مع مرنا تعطى بشكل غير مباشر عن طريق تطبيع الترددات من يقرأ في الإقليمي للأمن الغذائي (المرتبطة الريبوسوم مرنا) أكثر من تلك التي لوحظت في mRNAs ومجزأة بشكل عشوائي (مجموع مرنا). على سبيل المثال، سوف في إعداد بسيطة حيث احتلت أربعة &quot;B&quot; جزيئات مرنا (با، ب ب، قبل الميلاد ودينار بحريني) من قبل أربعة ريبوسوم في المواقف 1 و 2 و 3 و 4، والقصور الكامنة في أسلوب التنميط الريبوسوم لا تسمح التمييز بين سيناريو حيث ربط جميع ريبوسوم 4 فقط مع با مرنا في المواقف 1، 2، 3، و 4 وسيناريو حيث با، ب ب، قبل الميلاد و BD مرنا والمحتلة من قبل كل واحد الريبوسوم في الموضع 1، 2 ، 3، و 4، على التوالي. في المقابل، خلال polysome تجزئة، هو الحفاظ على سلامة polysome، مما يسمح عزل برك من mRNAs ويرتبط مع عدد محدد من ريبوسوم (الشكل 1). هذا الاستيرادالتمييز بين النمل تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم يوحي بأن في حين أن الأسلوب السابق يمكن استخدامها لمقارنة مباشرة في mRNAs وmRNP، وعلى ضوء polysome الثقيلة الكسور، ومن المرجح أن تفشل الأسلوب الأخير لالتقاط التغيرات في translatome التي تنتج عن mRNAs والتي تمر بمرحلة انتقالية من ضوء لpolysomes الثقيلة، في حين تبالغ في تقدير مساهمة تلك التي تنتقل من جزء mRNP لpolysomes الثقيلة. وشدد على الأهمية البيولوجية لهذه التناقضات بين الطرق المذكورة أعلاه من قبل مجموعة كبيرة من البيانات التي تبين أن تفعيل متعدية من مجموعة فرعية من mRNAs ومثل تلك التي هي حساسة للeIF4E، والانتقال من الضوء إلى polysomes الثقيلة، في حين أن آخرين، مثل تلك التي تؤوي عناصر 5&#39;TOP، يتم تجنيدهم للpolysomes الثقيلة مباشرة من أحواض خالية من الريبوسوم مرنا 6. ومن المثير للاهتمام، وقد تبين مسار mTOR لتعديل متزامنة ترجمة &quot;تراعي eIF4E&quot; و5&#39;TOP mRNAs و11. لذلك، والاختلافات المنهجية التي تمت مناقشتها أعلاه قد يفسر التعارض الواضح إبرام بين الدراسات باستخدام التنميط الريبوسوم 38،39 وpolysome تجزئة 24 إلى تقييم آثار mTOR تثبيط على translatome. في الختام، تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم طرق التكميلية التي تقدم في المقام الأول المعلومات فيما يتعلق بعدد من الريبوسومات المرتبطة مرنا وموقف الريبوسوم على مرنا، على التوالي. الأهم من ذلك، على الرغم من أوجه القصور ومزايا هذه الأساليب، يبقى من الضروري أن البيانات على نطاق الجينوم التي حصل عليها كل من الإجراءات ويتم تحليل كاف والتحقق من صحتها وظيفيا وكيميائيا.

الشبكات التنظيمية التي تتحكم في التعبير الجيني تم دراستها على نطاق واسع في العقدين الماضيين. الغالبية العظمى من هذه الجهود البحثية التي تركز على تنظيم النسخي، حيث كانت تستخدم التغييرات في مستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم واسعة لتحديد ما يسمى محات &quot;التعبير الجيني&quot;. تكشف الدراسات التي أجريت مؤخرا أن مستويات مرنا الحالة المستقرة تتوافق فضفاضة فقط إلى تكوين بروتيوم 1،2، مما يشير إلى أن آليات ما بعد النسخي، بما في ذلك الترجمة مرنا، ولعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني 3،4. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن ~ يتم تحديد 50٪ من مستويات البروتين على مستوى الترجمة مرنا في الخلايا الليفية الماوس مخلد 5. ترجمة مرنا هو عملية منظمة للغاية حيث يتم ترجمتها إلى بروتينات mRNAs وعبر إجراءات مدبرة من ريبوسوم، الرنا نقل (tRNAs) وعوامل التبعية المشتركيشار إلى mmonly كعوامل الترجمة (تي إف إس) 6. تخليق البروتين هو الأكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات 7 وبالتالي يتم تعديل معدلات ترجمة مرنا العالمية لاستيعاب توافر المواد الغذائية ومعدلات تكاثر الخلايا 8. بالإضافة إلى تغيرات في المعدلات العالمية ترجمة مرنا، ومختلف المحفزات خارج الخلية (مثل الهرمونات وعوامل النمو)، العظة داخل الخلايا (على سبيل المثال مستويات الأحماض الأمينية) وأنواع مختلفة من الإجهاد (مثل ER-الإجهاد) تحدث تغييرات انتقائية في برك من mRNAs والتي هي يتم ترجمتها (translatome) 6. اعتمادا على نوع من التحفيز، النشاط ترجمة بعض، ولكن لا تتأثر جميع mRNAs وبشكل كبير، مما يؤدي إلى تغييرات في بروتيوم المطلوبة لجبل استجابة الخلوية السريع 6. ويعتقد أن هذه التغييرات النوعية والكمية في translatome أن بوساطة التفاعل بين العوامل العابرة المفعول (على سبيل المثال </م&gt; مكونات الآلات متعدية، والعوامل المساعدة أو miRNAs) ورابطة الدول المستقلة العناصر (عناصر الحمض النووي الريبي أو ميزات) موجودة في مجموعات فرعية مختارة من mRNAs و6،9. على سبيل المثال، والتغيرات في مستويات و / أو نشاط منظم معدل الترجمة الشروع العوامل eIF4E وeIF2 تعدل بشكل انتقائي ترجمة النصوص استنادا إلى الميزات 5&#39;UTR محددة 6. ويلزم eIF4E وeIF2 لتوظيف مرنا والبادئ الحمض الريبي النووي النقال إلى الريبوسوم، على التوالي 6. زيادة في النشاط eIF4E يعزز بشكل انتقائي ترجمة mRNAs وإيواء 5&#39;UTRs طويلة ومنظم للغاية بما في ذلك انتشار وبقاء ترميز البروتينات بما في ذلك تحفيز الحلقيات، ج MYC وبي سي إل XL 10. في المقابل، من تعطيل eIF2 يؤدي إلى تخليق البروتين العالمية الغلق، في حين يصل انتقائي تنظيم ترجمة mRNAs وتحتوي قصيرة المثبطة المنبع إطارات القراءة المفتوحة (uORFs) في 5&#39;UTRs الخاصة بهم، مثل تلك ترميز سيد رranscriptional المنظمين للاستجابة البروتين تكشفت (على سبيل المثال ATF4). في استجابة للمؤثرات المختلفة بما في ذلك المواد الغذائية، وعوامل النمو والهرمونات، والهدف الآلي / الثدييات rapamycin (mTOR) مسار يحفز النشاط eIF4E بواسطة تعطيل البروتين 4E ملزم (4E-BP) عائلة من المكثفات الترجمة، في حين أن مسار MAPK phosphorylates مباشرة eIF4E 6،11. بدوره، تحركات eIF2α (أي PERK، PKR، HRI وGCN2) تمنع eIF2 بواسطة phosphorylating الوحيدات التنظيمية eIF2α في الاستجابة للحرمان المغذيات، ER-الإجهاد وعدوى فيروس 6،12. تغييرات في النشاط و / أو التعبير عن TFS، وقد لوحظ مكونات أخرى من الآلات متعدية والعوامل التنظيمية بما في ذلك miRNAs في مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، متلازمات الأيض، والاضطرابات العصبية والنفسية، وأمراض الكلى والقلب والأوعية الدموية 13-19. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن متعدية ليchanisms تلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية والتي إبطالهما يلعب دورا محوريا في المسببات لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. هنا، يوصف بروتوكول للتجزئة من قبل polysomes السكروز كثافة الطرد المركزي التدرج في خلايا الثدييات، والذي يستخدم لفصل polysomes من monosomes، مفارز الريباسي وجزيئات بروتين نووي ريبوزي رسول (mRNPs). وهذا يتيح التمييز بين تترجم بكفاءة (المرتبطة polysomes الثقيلة) من سوء ترجمة (المرتبطة polysomes ضوء) mRNAs و. في هذا الاختبار، وثبتوا على ريبوسوم مرنا باستخدام مثبطات ترجمة استطالة مثل سيكلوهيكسيميد 20 ويتم فصل مقتطفات عصاري خلوي على 5-50٪ سكروز الخطية التدرجات كثافة من قبل تنبيذ فائق. تجزئة اللاحقة من التدرجات السكروز يسمح عزلة mRNAs وفقا لعدد من الريبوسومات التي ربط. يمكن الحمض النووي الريبي المستخرج من كل جزء ثم استخدامها لتحديدتغييرات في توزيع mRNAs وعبر التدرج بين ظروف مختلفة، حيث يزيد كفاءة متعدية من أعلى إلى أسفل التدرج. وتستخدم شمال التنشيف أو الكمي عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) لتحديد مستويات mRNAs وفي كل جزء. بدلا من ذلك، يتم تجميع الكسور التي تحتوي على polysomes الثقيلة (عادة أكثر من 3 ريبوسوم) ويتم تحديد مستويات مرنا المرتبطة polysome على نطاق الجينوم باستخدام ميكروأري أو العميقة التسلسل. فإنه من الأهمية بمكان التأكيد على أن مستويات mRNAs والمرتبطة polysome هي، بالإضافة إلى الترجمة، تتأثر آليات النسخي وبعد النسخي التي تؤثر على مستويات mRNAs وعصاري خلوي 21. لذلك، لتحديد الاختلافات في الترجمة باستخدام بيانات الجينوم على نطاق من المصاحب polysome مرنا فمن الضروري لتصحيح آثار من الخطوات في هذا الجين التعبير المسار التي هي المنبع من transla21 نشوئها. للسماح مثل هذا التصحيح، ويتم إعداد الحمض النووي الريبي عصاري خلوي بالتوازي مع الحمض النووي الريبي المرتبطة polysome من كل عينة ومستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم ويتم تحديد 21. حاليا، ما يسمى ب &quot;الترجمة الكفاءة&quot; (TE) عشرات (أي بين نسبة سجل بين البيانات مرنا المرتبطة polysome والبيانات مرنا عصاري خلوي) غالبا ما تستخدم لتصحيح آثار التغيرات في مستويات مرنا عصاري خلوي على كفاءة ترجمة ل نظرا مرنا 22. ومع ذلك، باستخدام عشرات TE لتحديد الفرق الترجمة يرتبط مع أعداد كبيرة من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة بسبب خاصية رياضية من عشرات TE يشار إلى علاقة زائفة إلى 27. في الواقع أشارت دراسة استقصائية لمجموعات البيانات من مختبرات متعددة أن مثل هذه الارتباطات الزائفة ويبدو أن لا مفر منه عند تحليل التغيرات في translatomes 23. دفع هذا التطور من &quot;تحليل الفرق آر<html> anslation &quot;(انوتا) الخوارزمية، والتي لا تعاني من أوجه القصور المذكورة أعلاه 23. انوتا خلال التحليل تم استخدام نموذج الانحدار لاستخلاص التدابير النشاط متعدية مستقلة عن مستويات الحمض النووي الريبي عصاري خلوي. هذه التدابير ثم مقارنة بين الظروف ويحسب الإحصاءات. المستخدم لديه خيار تطبيق طريقة انكماش التباين، مما يحسن القدرة الإحصائية، ويقلل من حدوث نتائج إيجابية كاذبة في الدراسات القليلة مع مكررات 24. بشكل ملحوظ، وقد تجلى ذلك مؤخرا ان الاضطرابات في translatome استولت عليها انوتا، ولكن ليس عشرات TE، ترتبط التغييرات في بروتيوم 25. لذلك، ينصح بشدة لتطبيق التحليل انوتا لتحديد التغييرات في الترجمة على نطاق الجينوم واسعة. في حين تمت مناقشة الأسس النظرية من الخوارزمية انوتا بالتفصيل سابقا 21،23،26، وهنا يتم التركيز على كيفية تطبيقه في الواقع العملي. ve_content &quot;&gt; وبالإضافة إلى دراسة التغيرات في نشاط الترجمة مرنا في الخلية، وهذا البروتوكول تجزئة الريبوسوم يمكن استخدامها لعزل وكيميائيا ووظيفيا تميز الريبوسوم والمرتبطة polysome المجمعات البروتين. تمت بنجاح تم نشر هذا النهج في الماضي لتحديد المجمعات التي تنظم استقرار البروتينية حديثا توليفها 27 و / أو تشارك في الفسفرة من مكونات الآلات متعدية. كما سيتم مناقشة هذا تطبيق طريقة polysome تجزئة لفترة وجيزة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

ترجمة مرنا يلعب دورا محوريا في تنظيم التعبير الجيني ويمثل أكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات. وفقا لذلك، وتعتبر التقلبات الترجمة مرنا للعب دور رئيسي في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما فيها السرطان. ريبوسوم أيضا استضافة المحرمين، والتي تسهل للطي من البروتينية الوليدة، وبالتالي تحوير وظيفة واستقرار البروتينية توليفها حديثا. بالإضافة إلى ذلك، تشير إلى أن البيانات الناشئة ريبوسوم بمثابة منصة لذخيرة من إشارات الجزيئات، التي تورطت في مجموعة متنوعة من التعديلات بعد متعدية من البروتينية حديثا توليفها لأنها تخرج من الريبوسوم، و / أو مكونات الآلات متعدية. هنا، يتم وصف طريقة راسخة من تجزئة الريبوسوم باستخدام كثافة السكروز التدرج الطرد المركزي. بالتزامن مع تطوير خوارزمية &quot;انوتا&quot; لفي المنزل يسمح هذا الأسلوب تقرير مباشر من diffeترجمة رينتيال من mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول تنوعا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات البيوكيميائية التي تهدف إلى تشريح وظيفة من المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم، بما في ذلك تلك التي تلعب دورا محوريا في للطي وتدهور البروتينية توليفها حديثا.

mTOR هو العقدة الرئيسية في الشبكة الخلوية التي تنسق معدلات تخليق البروتين العالمية مع توافر المواد الغذائية 19. وينظم الترجمة مرنا بشكل رئيسي في بدء خطوة الحد من معدل 6. نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يرتبط بشكل إيجابي مع معدلات ترجمة الشروع 28. ويقدم مثالا على تطبيق طريقة polysome تجزئة للتحقيق في دور mTOR الإشارات في التوسط آثار الانسولين على ترجمة مرنا. تحقيقا لهذه الغاية، تم الحفاظ MCF7 خلايا سرطان الثدي البشرية في البلدان المنخفضة المصل ومن ثم حفز مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع موقع نشط mTOR المانع Torin1. حفز الخلايا غير التي تم الاحتفاظ بها باستمرار في انخفاض مصل، وكان بمثابة السيطرة. تم فصل mRNPs، صبغي جنسي أحادي (80S) والكسور polysome باستخدام طريقة polysome تجزئة. نسبة إلى الخلايا السيطرة، بفعل الأنسولين زيادة في الامتصاصية في الكسور التدرج المقابلةلpolysomes، يقابله انخفاض مصاحبة في الامتصاصية في جزء صبغي جنسي أحادي (الشكل 1). تظهر هذه النتائج أن نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يتم زيادة الأنسولين في علاجها بالمقارنة مع الخلايا السيطرة، وبالتالي تشير إلى أن، كما هو متوقع، والانسولين يحفز معدلات ترجمة الشروع العالمية. عكس Torin1 آثار الانسولين على ملامح الامتصاصية (الشكل 1)، وبالتالي مؤيدة النتائج أن mTOR الإشارات يلعب دورا رئيسيا في التوسط آثار الانسولين على آلية ترجمة 19. استنادا إلى مبدأ أن عدم الاتساق في إعداد التدرج لا يمكن تجنبها، وقد أثيرت تساؤلات بشأن استنساخ البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التجزئة polysome 22. تجريبيا لاختبار هذه المسألة يحتمل أن تكون ضارة، عصاري خلوي والثقيلة المرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (مرنا يرتبط مع 4 وأكثر ريبوسوم) كانت معزولة<html> من خلايا MCF7 تعامل مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع الأنسولين Torin1 من 4 مكررات البيولوجية المستقلة (الشكل 2). تم تحديد آثار الانسولين وTorin1 عن تكوين عصاري خلوي والثقيلة مرنا المرتبطة polysome في كل تكرار على نطاق الجينوم واسعة باستخدام نهج ميكروأري. لتحديد استنساخ الأسلوب polysome تجزئة تم تطبيق تحليل المكون الرئيسي (PCA). وأظهر هذا التحليل أن العينات تنتمي إلى كل حالة ووضع بإحكام داخل اثنين من المكونات الأولى في حين أن ظروف مختلفة تم فصل جيدا (الشكل 2). تظهر هذه النتائج أن طريقة polysome تجزئة كما هو موضح هنا هو تكرار للغاية، وبالتالي مناسبة لدراسة التغيرات الكمية والنوعية في الترجمة على مستوى الجينوم على نطاق. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. محات Polysomal تظهر آثار المجاعة في الدم، والانسولين وmTOR يشير على الترجمة العالمية في الخلايا MCF7. حرمت الخلايا MCF7 من المواد الغذائية (0.1٪ في المحافظة FBS) لمدة 16 ساعة وتعامل مع 5 نانومتر الأنسولين (شهيق) وحدها أو في تركيبة مع 250 نيوتن متر Torin1 (شهيق + Torin1) لمدة 4 ساعات. واستخدمت الخلايا غير المعالجة والتي حرمت باستمرار من المواد الغذائية (0.1٪ FBS) كمجموعة تحكم. تم الرسوبية مقتطفات عصاري خلوي المقابلة بواسطة الطرد المركزي على 5-50٪ التدرجات السكروز. يشار إلى مفارز الريباسي الحرة (40S 60S و)، monosomes (80S) وعدد من الريبوسومات في الكسور polysome. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> الشكل 2. بيانات الجينوم على نطاق الحصول عليها باستخدام عolysome التنميط هو تكرار للغاية، وعولجوا خلايا MCF7 كما في الشكل 1 تم استخراج. عصاري خلوي والمرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (&gt; 3 ريبوسوم) من 4 مكررات البيولوجية مستقلة ومستوياتها مرنا على نطاق الجينوم كانوا مصممين باستخدام صفائف GeneTitan ([أفمتريإكس]). وقد استخدم PCA لتقييم استنساخ البيانات الناتجة. المعروضة هي أول عنصرين PCA لجميع العلاجات (T1 = 1 في Torin؛ السيطرة = السيطرة؛ شهيق = الأنسولين)، والأصل من الحمض النووي الريبي (C = عصاري خلوي؛ P = المرتبطة polysome) ويعيد. يتم وضع عينات من نفس حالة والأصل RNA عن كثب مشيرا إلى استنساخ عالية.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

ريبوسوم تلعب دورا محوريا في تخليق البروتين. Polyribosome (polysome) تجزئة من قبل السكروز التدرج الكثافة الطرد المركزي يسمح تقرير مباشر من الكفاءة ترجمة mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية من والريبوسوم عوامل المرتبطة polysome مثل المحرمين وجزيئات الإشارة.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K Views.  McGill University.  ريبوسوم تلعب دورا محوريا في تخليق البروتين. Polyribosome (polysome) تجزئة من قبل السكروز التدرج الكثافة الطرد المركزي يسمح تقرير مباشر من الكفاءة ترجمة mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها لتحليل الكيميا?...

Video: Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

مقياس الهاتفي للثقافة خلايا الثدييات باستخدام قارورة جديد متعدد الطبقات

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

رواية النظرية الافتراضية تغيير نقطة حسابي لتحليل الجينوم-اسعة من أنواع البيانات المتنوعة ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...