Esta investigación fue financiada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención CIHR MOP-115195) y FRQ-S a la misma, que es también un receptor CIHR Premio Joven Investigador de; y el Consejo Sueco de Investigación y la Sociedad Sueca del Cáncer de OL

1. Preparación de sacarosa gradiente <ol><li> Preparar 100 ml de 60% ​​(w / v) de solución de sacarosa en ddH 2 O. Solución debe ser filtrada a través de un filtro de 0,22 micras para evitar la obstrucción de la tubería durante la etapa de fraccionamiento (paso 3.5). </li><li> Preparar 5 ml de 10x tampón de gradiente de sacarosa: 200 mM de HEPES (pH 7,6), 1 M de KCl, 50 mM de MgCl 2, 100 mg / ml de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de proteasa (sin EDTA), 100 unidades / ml de inhibidor de RNasa. </li><li> Uso de la solución de 60% preparada como se describe en el paso 1.1, hacer 40 ml de 5% y soluciones de sacarosa 50% en tampón 1x gradiente de sacarosa. </li><li> Utilice el bloque de Marker se suministra con el fabricante de gradiente para marcar el punto medio llena en cada tubo de ultracentrifugación polialómero para todas las ocasiones (6 tubos de ultracentrifugación en total). Utilizando el dispositivo de capas proporcionado con el fabricante de gradiente, añadir solución de sacarosa al 5% hasta que alcanza el punto medio completo. A continuación, añadir la solución de sacarosa al 50% desde el fondo hasta la interfas entre las dos soluciones alcanza el punto medio llena. Especial cuidado se debe tomar durante este paso para que los gradientes son tan similares como sea posible, ya que esto es esencial para obtener una alta reproducibilidad (véase más adelante). </li><li> Selle tubos con tapas zonales de tasas proporcionadas con el fabricante de la pendiente y la transferencia de los tubos sellados para el soporte del tubo de la máquina de gradiente. </li><li> Ejecutar el fabricante de gradiente para obtener un 5% a 50% de gradiente lineal. Se formarán 6 degradados lineales en pocos minutos por la rotación a alta ángulo de inclinación. Nota: los gradientes de sacarosa se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C durante 6 meses. </li></ol> 2. El aislamiento y la sedimentación de polisomas <ol><li> Dependiendo del tipo de célula, las células de semillas en 1-5 15-cm de platos de Petri (~ 15 x 10 6 células) por lo menos un día antes de la lisis. En el día de los experimentos las células deben ser ~ 80% de confluencia. <!-- Nota: confluencia óptima es crítica porque las tasas de traducción y de proliferación son directamenteproporcionales 8, y por lo tanto deben ser analizados polisomas en células en proliferación activa (es decir, las tarifas de traducción se reducirá significativamente en más células confluentes mientras que bajo la confluencia de las células puede no proporcionar suficiente material para su posterior análisis). Las excepciones de esta regla se pueden hacer si, por ejemplo, el experimentador está interesado en estudiar el efecto de la inhibición por contacto sobre la traducción. Sin embargo, las células no deben ser mantenidos bajo sobre condiciones confluyentes durante demasiado tiempo, ya que esto puede tener efectos involuntarios en la translatome. Si se requiere la transfección, la mayoría de los kits disponibles comercialmente no afectan a los niveles de polisomas. Debido a que en el día de la transfección las células debe ser de 80-90% de confluencia, se recomienda para propagar las células 24 horas después de la transfección y aislar polisomas 48 horas después de la transfección de células de ~ 80% de confluencia. </li><li> Se incuban las células con cicloheximida a una concentración final de 100 g / ml en medio de crecimiento durante 5 min a 37 ° C y 5% De CO 2; y lavar las células dos veces con 10 ml de helado 1x PBS que contenía 100 mg / ml de cicloheximida. La cicloheximida es un inhibidor de la elongación de la traducción que &quot;congela&quot; ribosomas en el ARNm, evitando de ese modo ribosoma escurra 20. </li><li> Raspar suavemente las células en 5 ml de helado de PBS 1x conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida y recogerlas en un tubo de 50 ml. Es importante que este paso se lleva a cabo razonablemente rápido como dejando a las células en hielo durante un período prolongado de tiempo disminuirá drásticamente la calidad de la preparación de polisomas. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Desechar las células sobrenadante y resuspender en 425 l de tampón hipotónico [(5 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM de MgCl 2, 1,5 mM de KCl y 1x cóctel inhibidor de proteasa (EDTA libre)], añadir 5 l de 10 mg / CHX ml, 1 l de DTT 1 M, 100 unidades de inhibidor de RNAsa y agitar durante 5 segundos seguido de la adición de 25 l de 10% Triton X-100 (concentración final 0,5%) y 25 l de 10% desoxicolato de sodio (concentración final 0,5%) y agitar durante 5 seg. Debido a la hinchazón de células, el tampón hipotónico interrumpirá la membrana plasmática, mientras que las condiciones detergente suave se utilizan para solubilizar citosólica y ribosomas del retículo endoplasmático asociada sin interrumpir la envoltura nuclear. </li><li> Lisados ​​centrifugar a 16.000 xg durante 7 min a 4 ° C y el sobrenadante de transferencia (~ 500 l) a un tubo nuevo previamente enfriado 1,5 ml. Medir la DO a 260 nm para cada muestra usando un espectrofotómetro y mantener el 10% del lisado como entrada que se utilizará para determinar los niveles de mRNA en estado estacionario citosólicas. Diluir la entrada a 750 l de ARNasa H 2 O gratis, añadir 750 l de Trizol y congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido. </li><li> Transferir los tubos de ultracentrífuga que contienen gradientes de sacarosa en cubos del rotor pre-enfriados. Eliminar 500 l desde la parte superior de gradientes de sacarosa. Ajuste lisados ​​de modo que contengan la misma OD (10-20 DO a 260 nm) en 500 l de tampón de lisis (descrito en el paso 2.5) y cargarlos en cada gradiente de sacarosa. Nota: Es importante cargar inmediatamente lisados ​​en los degradados, ya que esto mejorará críticamente la calidad de las preparaciones polisomas. </li><li> Pesar y equilibrar cada gradiente antes de la ultra-centrifugación. </li><li> Centrifugar a 222.228 xg (36.000 rpm), durante 2 horas a 4 ° C utilizando rotor SW41Ti. Nota: Con el fin de no perturbar gradientes de sacarosa, opción de freno &quot;bajo&quot; debe ser seleccionado. </li></ol> 3. Polisomas Fraccionamiento y Extracción de ARN <ol><li> Prepare el colector de fracciones mediante la limpieza con agua libre de ARNasa caliente que contiene RNasa ZAP (unos sprays). Repita este paso con conexión RNAsa sólo agua tibia. Cambie la lámpara UV y espere a que aparezca la luz verde. </li><li> Retire con cuidado los tubos desde el rotor y colocarlos en hielo. Encienda el ordenador, bomba, detector UV y colector de fracciones. Coloque la bomba en 3 ml / min y filL el tubo con la solución de persecución [60% (w / v) de sacarosa que contiene 0,02% (w / v) de azul de bromofenol] hasta que llega a la aguja. Asegúrese de ver al menos una gota que sale de la aguja, y cerciorarse de que no haya burbujas se introducen en la jeringa de la bomba o el tubo. </li><li> Colocar tubos de 2 ml en un colector de fracciones. Inicie el programa de análisis y ajuste de sensibilidad a + / - 10 MeV. Ajuste &quot;base de tiempo&quot; a 100 seg. </li><li> Coloque cada tubo de ultracentrifugación en el detector UV mientras se asegura de que la sonda está en la posición ortogonal. Perforar el tubo con la aguja girando la perilla debajo del soporte de tubo. </li><li> Ajuste la bomba a 1,5 ml / min y recoger el ajuste del tiempo de 30 segundos en el colector de fracciones (esto se traducirá en ~ 750 l de cada fracción) fracciones. Ponga la bomba en la posición de &quot;mando a distancia&quot;, inicie el colector de la bomba y de la fracción, y al mismo tiempo empezar a grabar usando el trazador DAQ. Esto iniciará un desplazamiento hacia arriba de la gra sacarosadient y una detección simultánea de absorbancia UV a 254 nm. No exijáis tan pronto como la primera gota de solución de persecución cae en unos 2 ml tubo de recogida. </li><li> Guarde el trazado en formato csv y (una vez que se completa paso 3.7), en una aplicación de hoja de cálculo, haga lo siguiente para identificar la posición de cada fracción en el perfil de absorbancia UV.: <ol><li> Seleccione la columna que contiene los valores correspondientes a la absorbancia a 254 nm (canal 0). </li><li> Crear un gráfico de dispersión suave línea de las absorbancias. </li><li> Establecer la unidad principal del eje X a 300 (valor obtenido dividiendo el volumen del 5% -50% gradiente de sacarosa (~ 12 ml) por el tiempo de recogida de cada fracción (30 seg). </li></ol></li><li> Añadir 750 l de Trizol en cada fracción y flash congelar las fracciones en nitrógeno líquido. </li><li> Aislar ARN de polisomas-asociado y citosólica (desde 2,6) utilizando el protocolo de Trizol según las instrucciones del fabricante. Para aumentar la producción de ARN, proceder con precisión de ARNrecer la precipitación a -80 ° C durante 30 min o -20 ° C durante la noche. Nota: Debido a la cantidad de ARN se precipitó a partir de fracciones polysomal puede no ser claramente visibles, se recomienda añadir soporte. Añadir 1 l de soporte al tubo antes de la etapa de precipitación de ARN durante el protocolo de Trizol. </li><li> Determinar qué fracciones corresponden al ARNm asociado con&gt; 3 ribosoma (utilizando el enfoque descrito 3.6) y piscina para estas fracciones. Utilice el kit de ARN de limpieza para realizar la limpieza de ARN polisomas asociados y citosólica combinado (de 2,6). Enviar las muestras a un centro para determinar los niveles de mRNA de todo el genoma utilizando microarrays o profunda-secuenciación. Si la traducción de los ARNm específicos deben ser supervisados ​​por RT-qPCR, se recomienda el uso de 500 ng de ARN (de las fracciones reunidas que contienen&gt; 3 ribosomas o ARN total) para sintetizar ADNc. Nota: los ARNm asociados con&gt; 3 ribosomas se fija arbitrariamente para representar ARNm traducidas de manera eficiente y contener más de 80% de recién sintetizarpolipéptidos de tamaño 28,29. Incluyendo fracciones correspondientes a la luz (1-2), medio (2-3) y polisomas pesados ​​(&gt; 3) sería ventajoso, pero estos aumentar el número de las muestras por 2 veces (4 vs 2 por condición) y por lo tanto la coste del experimento. A pesar de que se anticipa que la disminución en el costo de análisis profundo-y secuenciación de microarrays en el futuro, debería favorecer el último enfoque, se aconseja que durante la validación, la distribución de ARNm individuales se controla en cada fracción. </li></ol> 4. Análisis de todo el genoma de mRNA Traducción <ol><li> Instale R, bioconductor y el paquete Anota: <ol><li> Instale R (descarga desde r-project.org) y comenzar un R-sesión. Nota: R es disponible para todos los sistemas operativos y Anota se ejecutará en todos ellos. </li><li> Instale bioconductor (bioconductor.org). Código R se interpreta a través de la (por ejemplo, la consola de R R-terminal en Windows - que se puso en marcha por double clic en el acceso directo de R). Bioconductor se instala escribiendo (en el R-terminal): fuente (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Instale el paquete bioconductor Anota (y del paquete qvalue que Anota requiere) escribiendo (en el R-terminal): fuente (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;Anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Prueba de que el paquete se ha instalado correctamente y abrir el manual Anota escribiendo (en el R-terminal): biblioteca (&quot;Anota&quot;) viñeta (&quot;Anota&quot;) </li><li> Nota: La ayuda adicional para todas las funciones que se utilizan en el paquete Anota se puede encontrar ya sea en la página web Anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) o mediante el uso de la función de ayuda en R. Por ejemplo, para obtener ayuda sobre la función anotaPerformQc ir a la R-terminal y tipo (tenga en cuenta que esto sólo funciona cuando el paquete Anota se ha cargado): biblioteca (&quot;Anota&quot;) # carga el paquete Anota ? AnotaPerformQc # abre la ayuda para esta función </li></ol></li><li> Importar datos a R: <ol><li> Preparar los datos de expresión para el análisis. Los datos deben ser pre-procesados ​​(por ejemplo, normalizado y de calidad controlada) con respecto a la técnica que se utilizó para medir los niveles de mRNA. Los valores de entrada deben conectarse transformaron, más común es log2. Compilar una tabla con los datos de todas las muestras de ARN polisoma asociada y una para todas las muestras de ARN citosólicos. La primera columna debe contener el gen de identificadores seguidas de una columna de datos por muestra; la primera fila debe incluir los nombres de las muestras. Es fundamental que las tablas tienen orden de la muestra idénticos y orden de genes idénticos. Guarde los archivos como archivos de texto delimitados por tabuladores llamados &quot;myPolysomeData.txt&quot; y &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> En este ejemplo dos clases de muestra se utilizan (de control o enfermo) con 3 réplicas por clase, generando de ese modo 6 muestras con este fin: C1, C2, C3, D1, D2, D3 en ambos los archivos myCytosolicData.txt y myPolysomeData.txt. Anota requiere al menos 3 réplicas por condición cuando hay dos clases de prueba. Estos deben ser réplicas biológicas independientes. </li><li> Cree un directorio que contiene los archivos de entrada de datos (myPolysomeData.txt y myCytosolicData.txt). Abrir R desde este directorio. En Windows / Mac esto se puede hacer copiando un R-atajo en este directorio y el lanzamiento de R utilizando este método abreviado (el trabajo directo también se puede cambiar utilizando los menús desplegables). </li><li> Cree un archivo denominado myCode.R dentro del directorio recién creado y abrirlo con un programa de edición de texto. Escribir el código en este archivo. </li><li> Para cargar los datos en R escribir el siguiente código al archivo myCode.R (recuerde que debe volver a guardar el archivo después de cada adición de código). Abajo hay una s paso atep explicación del código, pero todo el código también se podría escribir desde la fuente y la función de fuente (que se ejecuta el código, ver más abajo) se utiliza sólo una vez: # # Esto carga la biblioteca Anota biblioteca (Anota) # # Esto carga los datos de entrada en R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) </li><li> Ejecute el código en R escribiendo directamente en el terminal R: fuente (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Compruebe que los datos se han cargado correctamente escribiendo (en el R-terminal): cabeza (dataCyto) # mostrará la parte superior de la tabla dataCyto cabeza (dataPoly) </li></ol></li><li> Identificación de genes diferencialmente traducidos: <ol><li> Generar un vector que describelas categorías de la muestra (un vector es un tipo de objeto en R). Este vector debe reflejar el orden de la muestra en el myPolysomeData.txt y myCytosolicData.txt de manera que todos los tres objetos tienen un orden idéntico de las muestras. El vector se utilizará cuando se den instrucciones Anota sobre los que las muestras para comparar. Agregue lo siguiente al archivo myCode.R: # # Tenga en cuenta que las muestras replicadas tienen clase muestra idéntica # # Descripciones (por ejemplo, &quot;C&quot; o &quot;D&quot;) en este vector. myPhenotypes &lt;- C (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Realizar el control de calidad del conjunto de datos. Hay una serie de medidas de calidad que necesitan ser evaluado antes de Anota se puede utilizar para el análisis. Estos se discuten en detalle en el manual Anota. Agregue este código al myCode.R archivo y guardarlo: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Ejecute el código escribiendo en R-terminal: fuente (&quot;myCode.R&quot;) Esto va a generar una serie de archivos de salida, que puede ser examinada como se indica en el manual Anota. </li><li> Identificar genes diferencialmente traducidos. Las muestras se compararán según el orden alfabético de los nombres suministrados al parámetro &quot;phenoVec&quot; (es decir, el &quot;myPhenotypes&quot; vector) a menos que sean especificados por el usuario (con el parámetro &quot;contrastes&quot;). Agregue el código siguiente para myCode.R archivo y acabado mediante el comando &quot;source&quot; dentro de la R-terminal como se describe más arriba: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Utilice la ayuda para anotaGetSigGenes para entender cómo el output se formatea y ver cómo elegir las categorías de muestras para comparar escribiendo (en el R-terminal): ? anotaGetSigGenes </li><li> Genes del filtro y de la trama que se traducen diferencialmente. Existen múltiples umbrales que se pueden aplicar dentro de la función y el uso de anotaPlotSigGenes ayuda será simplificar una combinación personalizada de dichos umbrales. Para seleccionar los genes analizados de forma fiable aplicar el minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) y (0.01) slopeP ajustes. Nota: Además, los ajustes se aplican a RVM 23,26,30 tasa de falsos descubrimiento (FDR) (0,15) y retire los cambios (log2 [1,5]) puede por ejemplo utilizarse para identificar genes diferencialmente traducidos. Otros filtros tales como &quot;selDeltaPT&quot; pueden ser útiles para un filtrado más estricta (por ejemplo establecer selDeltaPT con el log2 [1,5]). También es necesario precisar que la comparación debe ser filtrada (utilizando el argumento selCont). Aplicar los ajustes descritos añadiendo la siguiente línea a la myCode.Rarchivo: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) </li><li> Efectuar el análisis mediante el uso de la función de fuente de la R-terminal como se ha descrito anteriormente. Esto también va a generar una salida gráfica. El examen de esta salida es un buen punto de partida para evaluar el desempeño de los análisis e identificar los cambios necesarios en la configuración. </li><li> Generar una tabla de salida. Agregue el código siguiente al archivo myCode.R: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, sep = &quot; t&quot;) </li><li> Ejecute el código utilizando la función de fuente en el R-terminal. Las columnas de la tabla resultante se explican en la ayuda para la función anotaPlotSigGenes. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

En este artículo se describe un protocolo de fraccionamiento polysome bien establecida seguida de un método de análisis de desarrollo propio para la captura de los cambios cualitativos y cuantitativos en la actividad de traducción en un genoma de gran escala en las células de mamíferos. Para completar con éxito este protocolo especial se debe prestar atención a: 1) la confluencia de células (como las tasas de proliferación y disponibilidad de nutrientes se correlacionan con la actividad de la traducción del ARNm y pueden afectar a la composición de la translatome, confluencia celular debe ser consistente a través de repeticiones y las condiciones experimentales), 2) la lisis celular rápida (A pesar de la presencia de cicloheximida y los inhibidores de RNAsa en tampones de lisis debe ser rápida y extractos celulares deben ser superpuestos en gradientes de sacarosa inmediatamente después de la lisis para evitar la degradación del ARN y la disociación de polisomas), 3) la preparación de degradado (para asegurar alta reproducibilidad de datos, gradientes de sacarosa deben prepararse usando el fabricante del gradiente y espeatención social debe tener cuidado al manipularlos). Además de estudiar los cambios en la actividad de traslación, este protocolo se puede utilizar para aislar los complejos de proteínas de ribosomas asociados y establecer sus funciones fisiológicas. Para este fin, los niveles y el estado de fosforilación de diversas proteínas de ribosomas asociados se pueden determinar por precipitación con TCA, seguido por transferencia Western, mientras que los complejos de proteínas asociadas ribosoma-pueden ser inmunoprecipitada a partir de fracciones del gradiente y se analizaron por transferencia de Western o la espectrometría de masa. Un inconveniente de esta técnica es que el método de fracción de gradiente lento podría dar lugar a la disociación de las proteínas incluso estrechamente unidas cuya cinética de unión se encuentran en rápida asociación / disociación. Los factores asociados a polipéptidos recién sintetizados son ejemplos típicos. Polipéptidos recién sintetizados emergentes formar los ribosomas se pueden inmovilizar en los complejos de proteínas asociadas con ribosomas utilizando reticuladores químicos, tales como 3, 3&#39;-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Este enfoque reveló que el receptor para C activada quinasa 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal quinasa (JNK) / factor de elongación de la traducción eucariota 1A2 (eEF1A2) complejo regula la degradación de los polipéptidos recién sintetizados en respuesta al estrés 27. Además, se utilizó una metodología similar en estudios que muestran que la proteína quinasa C bII (PKCbII) se reclutó a los ribosomas por RACK1 32 y que la activación de complejo mTOR 2 (mTORC2) se produce en los ribosomas en los que fosforila polipéptidos recién sintetizados AKT y regula su estabilidad 33,34. Las principales limitaciones del método de fraccionamiento de polisomas seguido por análisis Anota son: 1) el requisito para un número relativamente alto de células (~ 15 x 10 6 células), 2) la falta de información de posición con respecto a la localización de ribosoma en una molécula de ARNm dado, y 3 cuestiones relacionadas con la hetero) celular y molecularheterogeneidad de los tejidos normales y tumorales. Los temas relacionados con el número de células requerido pueden ser resueltos mediante la alineación de los picos de los espectros de absorbancia correspondientes a monosomas (80S) de células cuyas cantidades están limitando con los obtenidos a partir de células de alta abundancia (por ejemplo, células HeLa) 35. Técnica de perfiles de ribosoma (ver más abajo) se puede utilizar para determinar la posición exacta del ribosoma en una molécula de ARNm dado, mientras que se discuten los problemas relacionados con los efectos de confusión de la heterogeneidad del tejido sobre la interpretación de los cambios en la expresión génica obtenidos a partir de sistemas complejos, tales como tejidos humanos en detalle en una publicación de Leek y Storey 36. Recientemente, una novela ribosoma de perfiles técnica fue desarrollada, en el que fragmentos de ribosomas protegida (PRSA) se generan por tratamiento con ARNasa I y analizados por secuenciación profunda-22. Esta técnica permite la determinación de la posición ribosoma en una única resolución de nucleótidos, proporcionando de este modo hasta ahora UNPRconocimientos sobre la biología ecedented ribosoma. Por ejemplo, perfiles de ribosoma se puede utilizar para la determinación de la densidad de ribosoma en una molécula de ARNm dado o la identificación de los elementos que influencia las tasas de inicio de traducción, tales como los sitios de iniciación alternativos, en los codones de iniciación no agosto y elementos reguladores tales como uORFs. Sin embargo, hay varias limitaciones metodológicas que restringen la capacidad de los perfiles de los ribosomas para estimar con precisión la eficacia de traducción del ARNm. Estos incluyen sesgos independientes introducidas por fragmentación aleatoria y digestión con RNAsa I, sesgos introducidos por inhibidores de la traducción (por ejemplo, inhibidores de elongación tales como la emetina y cicloheximida son propensos a inducir la acumulación de ribosomas en los sitios de iniciación de traducción), un gran número de resultados positivos falsos y negativos falsos asociados con puntuaciones de TE, así como su imprecisión en la predicción de las lecturas que se originan a partir de ARNm que codifican la proteína 37. Quizás lo más importante, mientras queperfilado ribosoma permite la identificación directa de la posición ribosoma en una molécula de ARNm dado, el número de ribosomas que se asocia con un ARNm dado se estima indirectamente por la normalización de las frecuencias de lee en rPFS (ARNm al ribosoma-asociado) sobre los observados en los ARNm azar fragmentados (Total ARNm). Por ejemplo, en un entorno sencillo donde cuatro moléculas de ARNm &quot;B&quot; (BA, BB, BC y Bd) están ocupados por cuatro ribosomas en las posiciones 1, 2, 3 y 4, un defecto inherente de la técnica de perfiles ribosoma no permitirá una distinción entre un escenario en el que todos los 4 ribosomas asocian sólo con un ARNm de Ba en las posiciones 1, 2, 3, y 4 y un escenario en el Ba, Bb, Bc y Bd ARNm son cada ocupadas por un solo ribosoma en la posición 1, 2 , 3, y 4, respectivamente. En contraste, durante el fraccionamiento de polisomas, polisomas se conserva la integridad, permitiendo de este modo el aislamiento de piscinas de los ARNm asociados con un número definido de los ribosomas (Figura 1). Esta importacióndistinción entre hormiga fraccionamiento polisomas y perfiles ribosoma sugiere que mientras que el método anterior puede ser utilizado para comparar directamente los ARNm en mRNP, luz y polisomas fracciones pesada, el último método será probablemente fallará a captar los cambios en el translatome que son causados ​​por los mRNAs que la transición de iluminará para polisomas pesados, mientras que sobreestimar la contribución de los que pasar de la fracción mRNP a polisomas pesados. La importancia biológica de estas discrepancias entre los métodos anteriormente mencionados es subrayada por un gran cuerpo de datos que muestran que la activación de la traducción de un subconjunto de ARNm tales como los que son-eIF4E sensible, la transición de la luz a polisomas pesados, mientras que otros, tales como los que albergan elementos 5&#39;TOP, son reclutados a polisomas pesados ​​directamente de charcos de ribosomas libres mRNA 6. Curiosamente, la vía mTOR se ha demostrado que modulan de forma concomitante traducción de &quot;eIF4E-sensible&quot; y 5&#39;TOP ARNm 11. Por lo tanto, las diferencias metodológicas que se describen anteriormente pueden explicar la aparente discordancia de la conclusión entre los estudios utilizando ribosoma de perfiles de 38,39 y fraccionamiento polisomas 24 para evaluar los efectos de la inhibición de mTOR en el translatome. En conclusión, el fraccionamiento de polisomas y perfiles de ribosoma son métodos complementarios que proporcionan principalmente información sobre el número de ribosomas asociados con el ARNm y la posición del ribosoma en el ARNm, respectivamente. Es importante destacar que, a pesar de las deficiencias y ventajas de estos métodos, sigue siendo esencial que los datos de todo el genoma obtenidos por ambos procedimientos se analizan de manera adecuada y funcional y bioquímico validados.

Las redes reguladoras que controlan la expresión de genes han sido ampliamente estudiados en las dos últimas décadas. La gran mayoría de estos esfuerzos de investigación centrados en la regulación transcripcional, por el que se utilizaron los cambios en los niveles de mRNA en el estado estacionario en un genoma de gran escala para determinar los llamados perfiles &quot;de la expresión génica&quot;. Estudios recientes revelan que los niveles de mRNA en estado estacionario sólo corresponden en términos generales a la composición del proteoma 1,2, lo que indica que los mecanismos de post-transcripcionales, incluyendo la traducción del ARNm, juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica 3,4. De hecho, se ha estimado que ~ 50% de los niveles de proteína se determina en el nivel de la traducción del mRNA en fibroblastos de ratón inmortalizadas 5. la traducción del mRNA es un proceso altamente regulado durante el cual los ARNm se traducen en proteínas a través de la acción orquestada de los ribosomas, ARN de transferencia (ARNt) y factores accesorios commonly referido como factores de conversión (TFS) 6. La síntesis de proteínas es el proceso de consumo de energía más en células de mamífero 7 y por lo tanto las tarifas de traducción de ARNm globales se ajustan para adaptarse a la disponibilidad de nutrientes y las tasas de proliferación celular 8. Además de las alteraciones en las tasas globales de traducción de ARNm, varios estímulos extracelulares (por ejemplo, hormonas y factores de crecimiento), las señales intracelulares (por ejemplo, los niveles de aminoácidos) y diferentes tipos de estrés (por ejemplo, ER-estrés) inducir cambios selectivos en las piscinas de mRNAs que son ser traducido (translatome) 6. Dependiendo del tipo de estímulo, la actividad de traducción de algunos, pero no todos los mRNAs se ven afectados drásticamente, lo que resulta en cambios en el proteoma que se requieren para montar una rápida respuesta celular 6. Se cree que estos cambios cualitativos y cuantitativos en el translatome estar mediado por la interacción entre los factores que actúan en trans (por ejemplo, </em&gt; componentes de maquinaria de traducción, factores auxiliares o miRNAs) y cis-elementos (elementos de ARN o características) presentes en determinados subconjuntos de mRNAs 6,9. Por ejemplo, los cambios en los niveles y / o actividad de iniciación de la traducción que limita la velocidad factores eIF4E y eIF2 modulan selectivamente la traducción de las transcripciones en base a las características específicas 5&#39;UTR 6. eIF4E y eIF2 se requieren para la contratación de mRNA y tRNA iniciador al ribosoma, respectivamente 6. Un aumento en la actividad de eIF4E refuerza selectivamente la traducción de mRNAs que albergan 5&#39;UTRs largas y altamente estructurados incluyendo aquellos proliferación y la supervivencia de codificación de proteínas, incluyendo la estimulación de las ciclinas, c-Myc y Bcl-XL 10. A su vez, la inactivación de eIF2 conduce a la síntesis de una proteína de apagado mundial, mientras que selectivamente la regulación hasta la traducción de mRNAs que contienen tramas cortas inhibitorios aguas arriba de lectura abierta (uORFs) en sus 5&#39;UTRs, tales como los que codifican Master Treguladores ranscriptional de la respuesta de la proteína desplegada (por ejemplo ATF4). En respuesta a diversos estímulos incluyendo nutrientes, factores de crecimiento y hormonas, el objetivo mecanicista / de mamífero de la rapamicina (mTOR) vía estimula la actividad de eIF4E mediante la inactivación de la proteína de unión 4E (4E-BP) de la familia de los supresores de traducción, mientras que la vía MAPK fosforila directamente eIF4E 6,11. A su vez, eIF2α quinasas (es decir PERK, PKR, HRI y GCN2) inhiben eIF2 fosforilando su subunidad reguladora eIF2α en respuesta a la privación de nutrientes, ER-estrés y la infección por el virus de 6,12. Las alteraciones en la actividad y / o expresión de TFS, otros componentes de la maquinaria de traducción y factores reguladores incluyendo miRNAs se han observado en varios estados patológicos incluyendo cáncer, síndromes metabólicos, trastornos neurológicos y psiquiátricos, y las enfermedades renales y cardiovasculares 13-19. Colectivamente, estos datos indican que el Me traslacionalcanismos desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular y que su abrogación juega un papel central en la etiología de diversas enfermedades humanas. En la presente memoria, se describe un protocolo para fraccionamiento de polisomas por la densidad de centrifugación en gradiente de sacarosa en células de mamífero, que se utiliza para separar los polisomas de monosomas, subunidades ribosómicas y las partículas de ribonucleoproteína mensajero (mRNPs). Esto permite la discriminación entre traducida de manera eficiente (asociado con polisomas pesados) de mal traducidos (asociado con polisomas luz) mRNAs. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando inhibidores de elongación de la traducción tales como cicloheximida 20 y extractos citosólicos se separan en 5-50% de sacarosa lineal gradientes de densidad por ultracentrifugación. Fraccionamiento subsiguiente de gradientes de sacarosa permite el aislamiento de ARNm de acuerdo con el número de ribosomas que se unen a. ARN extraído de cada fracción se puede entonces utilizar para determinarcambios en las distribuciones de los ARNm de todo el gradiente entre diferentes condiciones, por lo que aumenta la eficiencia de traducción de la parte superior a la parte inferior del gradiente. Transferencia Northern o la transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT-PCR) se utilizan para determinar los niveles de ARNm en cada fracción. Alternativamente, las fracciones que contienen polisomas pesados ​​(por lo general más de 3 ribosomas) se reúnen y los niveles de mRNA polisomas asociados a todo el genoma se determinan utilizando microarrays o profunda-secuenciación. Es de suma importancia destacar que los niveles de ARNm polisoma asociada son, además de la traducción, afectado por mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales que influyen en los niveles de ARNm citosólicas 21. Por lo tanto, para determinar las diferencias en la traducción a partir de datos de todo el genoma de mRNA polisomas asociados, es necesario corregir los efectos de los pasos en la vía de la expresión de genes que se encuentran aguas arriba de traslaciónción 21. Para permitir una corrección tal, ARN citosólica se prepara en paralelo con ARN de polisomas-asociada de cada muestra y los niveles de mRNA en estado estacionario en todo el genoma se determinó 21. Actualmente, la llamada (TE) marca &quot;traducción-eficiencia&quot; (es decir, el log-ratio entre los datos de ARNm polisoma asociada y los datos de ARNm citosólicas) se emplea a menudo para corregir los efectos de los cambios en los niveles de mRNA citosólicas sobre la eficiencia de traducción de un dado ARNm 22. Sin embargo, el uso de puntuaciones de TE para identificar traducción diferencial se asocia con un número importante de resultados positivos falsos y negativos falsos debido a una propiedad matemática de las puntuaciones TE comúnmente se hace referencia como correlación espuria 27. De hecho, un estudio de series de datos procedentes de múltiples laboratorios indicaron que tales correlaciones espurias parecen ser inevitables cuando se analizan los cambios en las translatomes 23. Esto impulsó el desarrollo del &quot;análisis del diferencial de tr<html> anslation &quot;(Anota) algoritmo, que no adolezca de los inconvenientes antes mencionados 23. Durante Anota-análisis de un modelo de regresión se utiliza para derivar medidas de la actividad de traducción independientes de los niveles de ARN citosólicos. Tales medidas se comparan entonces entre las condiciones y las estadísticas se calcula. El usuario tiene la opción de aplicar un método de varianza contracción, lo que mejora la potencia estadística y reduce la aparición de resultados falsos positivos en los estudios con pocas repeticiones 24. Significativamente, se ha demostrado recientemente que las perturbaciones en la translatome capturados por Anota, pero los resultados no TE, se correlacionan con los cambios en el proteoma 25. Por lo tanto, se recomienda aplicar el análisis Anota para la identificación de los cambios en la traducción en un genoma de gran escala. Si bien los fundamentos teóricos del algoritmo Anota se discutieron en detalle previamente 21,23,26, aquí se centra en la manera de aplicarlo en la práctica. ve_content &quot;&gt; Además de estudiar los cambios en la actividad de la traducción del ARNm en la célula, este protocolo de fraccionamiento ribosoma se puede utilizar para aislar y caracterizar bioquímicamente y funcionalmente ribosoma y complejos de proteínas polisomas-asociado. Este enfoque ha sido desplegado con éxito en el pasado para identificar complejos que regulan la estabilidad de los polipéptidos recién sintetizados 27 y / o están involucradas en la fosforilación de los componentes de la maquinaria de traducción. también se discutirán brevemente Esta aplicación del método de fraccionamiento de polisomas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

la traducción del ARNm juega un papel central en la regulación de la expresión génica y representa el proceso que consume energía más en células de mamífero. En consecuencia, la desregulación de la traducción del mRNA se considera que desempeñan un papel importante en una variedad de estados patológicos incluyendo cáncer. Los ribosomas también alojan chaperonas, que facilitan el plegado de polipéptidos nacientes, la función y la estabilidad de los polipéptidos recién sintetizados modulando de esta manera. Además, los datos emergentes indican que los ribosomas sirven como una plataforma para un repertorio de moléculas de señalización, que están implicados en una variedad de modificaciones post-traduccionales de polipéptidos recién sintetizados a medida que emergen del ribosoma, y ​​/ o componentes de maquinaria de traducción. En la presente memoria, se describe un método bien establecido de fraccionamiento ribosoma usando centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. En combinación con el algoritmo desarrollado &quot;Anota&quot; in-house este método permite la determinación directa de diferencial traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Por otra parte, este protocolo versátil se puede utilizar para una variedad de estudios bioquímicos destinados a diseccionar la función de los complejos de proteínas de ribosomas asociados, incluyendo los que juegan un papel central en el plegamiento y la degradación de los polipéptidos recién sintetizados.

mTOR es un importante nodo de la red celular que coordina las tasas globales de síntesis de proteínas con la disponibilidad de nutrientes 19. la traducción del ARNm está regulada principalmente en la etapa de iniciación limitante de la velocidad 6. La proporción de los ribosomas que participan en polisomas se correlaciona positivamente con las tasas de iniciación de la traducción 28. Se presenta un ejemplo de aplicación del método de fraccionamiento de polisomas para investigar el papel de la señalización de mTOR en la mediación de los efectos de la insulina sobre la traducción del ARNm. Para este fin, las células de cáncer de mama humano MCF7 se mantuvieron en suero bajo y luego se estimularon con insulina sola o en combinación con el inhibidor de mTOR-sitio activo Torin1. Las células no estimuladas que se mantuvieron continuamente en suero bajo, sirvieron como control. mRNPs, monosome (80S) y fracciones de polisomas se separaron usando el método de fraccionamiento de polisomas. Relativa a las células de control, la insulina inducida por un aumento en la absorbancia en fracciones de gradiente correspondientesa polisomas, acompañado por una disminución concomitante en la absorbancia en la fracción monosome (Figura 1). Estos hallazgos muestran que la proporción de los ribosomas que participan en polisomas se incrementa en la insulina tratado en comparación con las células de control, por lo tanto, lo que indica que, como se esperaba, la insulina estimula las tasas de iniciación de la traducción globales. Torin1 invirtió los efectos de la insulina sobre los perfiles de absorbancia (Figura 1), corroborando así los resultados que la señalización de mTOR desempeña un papel importante en la mediación de los efectos de la insulina sobre la maquinaria de traducción 19. Sobre la base de un principio que las incongruencias en la preparación de gradiente no se pueden evitar, se han planteado dudas en cuanto a la reproducibilidad de los datos obtenidos mediante el método de fraccionamiento polysome 22. Para probar empíricamente esta cuestión potencialmente perjudicial, citosólicas y ARN polisomas asociados pesada (ARNm asociado con 4 o más ribosomas) fueron aislados<html> a partir de células MCF7 tratados con insulina sola o en combinación con la insulina Torin1 de 4 réplicas biológicas independientes (Figura 2). Los efectos de la insulina y Torin1 sobre la composición de citosólica y pesado mRNA polisomas asociados en cada repetición se determinó en un genoma de gran escala utilizando un enfoque de microarrays. Para determinar la reproducibilidad del método de fraccionamiento polisomas se aplicó el análisis de componentes principales (ACP). Este análisis mostró que las muestras que pertenecen a cada condición fueron fuertemente posicionados dentro de los dos primeros componentes, mientras que las diferentes condiciones fueron bien separados (Figura 2). Estos resultados muestran que el método de fraccionamiento polysome como se describe aquí es altamente reproducible y, por tanto, adecuado para estudiar los cambios cuantitativos y cualitativos en la traducción a nivel de todo el genoma. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Perfiles polysomal que muestran los efectos de la privación de suero, la insulina y la señalización de mTOR en la traducción global en células MCF7. Células MCF7 fueron privados de nutrientes (mantenido en 0,1% de FBS) durante 16 horas y se trataron con 5 nM de insulina (Ins) solo o en combinación con 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) durante 4 horas. Las células no tratadas que fueron privadas de forma continua de nutrientes (0,1% de FBS) se utilizaron como control. Los extractos citosólicos correspondientes se sedimentaron por centrifugación en gradientes de sacarosa 5-50%. Subunidades ribosomales Gratis (años 40 y 60), monosomas (80S) y el número de ribosomas en las fracciones polisomas se indican. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figura 2. Datos pangenómicos obtenidos utilizando polysome de perfiles es altamente reproducible. células MCF7 fueron tratados como en la Figura 1. citosólica y polisomas asociados a ARN (&gt; 3 ribosomas) se extrajo a partir de 4 réplicas biológicas independientes y sus niveles de mRNA de todo el genoma se determinaron utilizando matrices GeneTitan (Affymetrix). PCA se utilizó para evaluar la reproducibilidad de los datos resultantes. Se muestran los dos primeros componentes de la PCA para todos los tratamientos (T1 = Torin 1; ctrl = control; Ins = insulina), origen del ARN (C = citosólica; P = polisomas asociados) y se replica. Las muestras de la misma condición y origen ARN están estrechamente posicionadas que indica una alta reproducibilidad.

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K vistas.  McGill University.  Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización. 

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Investigación

Biología

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

La ampliación de los cultivos celulares de mamíferos con un frasco de varias capas de Nueva

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Un bayesiano novela Cambio de punto Algoritmo para el Genoma en todo el análisis de diversos tipos de datos ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...