Diese Forschung wurde von der kanadischen Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) und FRQ-S IT, der auch ein Empfänger von CIHR Young Investigator Award unterstützt; und die schwedische Forschungsrat und die schwedische Krebsgesellschaft zu OL

1. Sucrose Gradient Vorbereitung <ol><li> Es werden 100 ml 60% (w / v) Saccharoselösung in ddH 2 O. Lösung sollte durch eine 0,22 &amp;mgr; m-Filter gefiltert werden, um ein Verstopfen der Rohrleitung während der Fraktionierung (Schritt 3,5) zu verhindern. </li><li> Vorbereitung 5 ml 10x Saccharosegradienten Puffer: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl 2, 100 &amp;mgr; g / ml Cycloheximid, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei), 100 Einheiten / ml RNase-Inhibitor. </li><li> Verwendung der 60% igen Lösung, hergestellt wie in Schritt 1.1 beschrieben, stellen 40 ml 5% und 50% Sucroselösungen in 1x Saccharose-Gradienten-Puffer. </li><li> Verwenden Sie das mit dem Gradienten-Hersteller zur Verfügung gestellt, um die Markierung Block halb voll Punkt auf jeder Polyallomer Ultrazentrifugation Rohr für die Schichtung (6 Ultrazentrifugation Rohre insgesamt) markieren. Mit der Schichtung Gerät mit dem Farbverlauf-Hersteller zur Verfügung gestellt, plus 5% Saccharose-Lösung, bis sie den halb vollen Punkt erreicht. Dann fügen Sie 50% Saccharose-Lösung vom Boden bis zur interfAss zwischen den beiden Lösungen erreicht die Halb vollen Punkt. Besondere Sorgfalt sollte während dieser Stufe entnommen werden, so daß Steigungen sind so ähnlich wie möglich, wie dies zur Erzielung einer hohen Reproduzierbarkeit (siehe unten). </li><li> Seal Röhrchen mit Rate zonale Kappen mit dem Gradienten-Hersteller zur Verfügung gestellt und übergeben die verschlossenen Röhrchen mit dem Rohrhalter auf der Steigung ausgestattet. </li><li> Führen Sie den Gradienten-Hersteller, um eine lineare 5% bis 50% Steigung zu erhalten. 6 lineare Farbverläufe werden in wenigen Minuten durch die Rotation bei hohen Neigungswinkel gebildet werden. Hinweis: Saccharosegradienten kann sofort für 6 Monate verwendet oder bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Isolierung und Sedimentation von Polysomen <ol><li> Je nach Zelltyp, Samenzellen in 1-5 15 cm Petrischalen (etwa 15 x 10 6 Zellen) mindestens einen Tag vor der Lyse. Am Tag der Experimente sollten die Zellen ~ 80% konfluent sein. <!-- Hinweis: Optimale Konfluenz ist kritisch, weil Übersetzung und Proliferationsraten sind direktproportional 8, und deshalb sollte Polysomen in aktiv proliferierenden Zellen analysiert werden (dh Übersetzung Preise werden deutlich sinken in über konfluenten Zellen während niedrige Konfluenz von Zellen nicht genügend Material für die weitere Analyse). Ausnahmen von dieser Regel können gemacht werden, wenn zum Beispiel der Experimentator interessiert sich für die Untersuchung der Wirkung von Kontakthemmung auf Übersetzung. Zellen jedoch nicht unter Über konfluenten Bedingungen zu lange gehalten werden, da dies Auswirkungen auf die unbeabsichtigte translatome haben. Wenn Transfektion erforderlich ist, die meisten der im Handel erhältlichen Kits nicht beeinträchtigen Polysomen Ebenen. Denn am Tag der Transfektion Zellen müssen 80-90% konfluent sein, ist es empfehlenswert, Zellen breiten sich 24 Stunden nach der Transfektion und isolieren Polysomen 48 Stunden nach der Transfektion von Zellen, ~ 80% konfluent. </li><li> Inkubieren Zellen mit Cycloheximid in einer Endkonzentration von 100 ug / ml in Wachstumsmedium für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2; und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS mit 100 ug / ml Cycloheximid. Cycloheximid ist eine Übersetzung Dehnung Inhibitor, &quot;friert&quot; Ribosomen auf der mRNA, wodurch verhindert wird, Ribosom weglaufen 20. </li><li> Kratzen Zellen vorsichtig in 5 ml eiskaltem 1x PBS mit 100 ug / ml Cycloheximid und sammeln sie in einem 50-ml-Tube. Es ist wichtig, dass dieser Schritt recht schnell als Abgangs Zellen auf Eis für eine längere Zeitdauer wird die Qualität der Polysomen-Herstellung drastisch verringern geführt. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 425 ul hypotonischen Puffer [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl 2, 1,5 mM KCl und 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei)], mit 5 &amp;mgr; l 10 mg / CHX ml, 1 &amp;mgr; l 1 M DTT, 100 Einheiten RNase-Inhibitor und Rührers 5 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 25 ul 10% Triton X-100 (Endkonzentration 0,5%) und 25 ul 10% Natriumdeoxycholat (Endkonzentration 0,5%) und 5 Sekunden vortexen. Durch Zellschwellung, wird der hypotonischen Puffer die Plasmamembran stören, während die Bedingungen milden Reinigungsmittel werden verwendet, um cytosolischen und endoplasmatischen Retikulum-assoziierten Ribosomen, ohne dass der Kernhülle zu lösen. </li><li> Zentrifuge Lysate bei 16.000 × g für 7 min bei 4 ° C und Transferüberstand (~ 500 &amp;mgr; l) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen. Messung der OD bei 260 nm für jede Probe unter Verwendung eines Spektrophotometers und halten 10% des Lysats als Eingabe verwendet, um die cytosolische stationären mRNA-Spiegel zu bestimmen wird. Verdünnen Sie den Eingang auf 750 ul in RNAse freiem H 2 O, fügen Sie 750 ul Trizol-und Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff. </li><li> Übertragen Ultrazentrifuge Röhrchen mit Saccharose-Gradienten in vorgekühlte Rotorschaufeln. Entfernen 500 ul von der Spitze des Saccharose-Gradienten. Lysate so einzustellen, dass sie den gleichen Außendurchmesser (10-2 enthalten0 OD bei 260 nm) in 500 ul Lysepuffer (in Schritt 2.5 beschrieben) und laden Sie sie auf jedem Saccharose-Gradienten. Hinweis: Es ist wichtig, sofort zu laden Lysate auf den Steigungen, da dies entscheidend die Qualität der Polysom ​​Vorbereitungen zu verbessern. </li><li> Wiegen und die Waage Steigung vor der Ultrazentrifugation. </li><li> Zentrifuge bei 222.228 xg (36.000 rpm) für 2 h bei 4 ° C unter Verwendung SW41Ti Rotors. Hinweis: Um nicht zu Saccharose-Gradienten zu stören, sollten &quot;low&quot; Bremsoption ausgewählt werden. </li></ol> 3. Polysomprofile Fraktionierung und RNA-Extraktion <ol><li> Bereiten Sie den Fraktionssammler durch Reinigung mit warmem RNAse freies Wasser enthält RNase ZAP (ein paar Spritzer). Wiederholen Sie diesen Schritt nur mit warmen RNAse freies Wasser. Schalten UV-Lampe und warten, bis das grüne Licht zu erscheinen. </li><li> Röhren vorsichtig aus dem Rotor zu entfernen und sie auf Eis. Computer einschalten, Pumpe, UV-Detektor und Fraktionssammler. Pumpenaggregat mit 3 ml / min und fill der Schlauch mit der Verfolger Lösung [60% (w / v) Saccharose, das 0,02% (w / v) Bromphenolblau], bis die Nadel erreicht. Achten Sie darauf, um zu sehen, zumindest ein Tropfen aus der Nadel kommt, und festzustellen, dass keine Blasen in der Spritze oder Pumpe Schlauch eingeführt. </li><li> Platz 2 ml-Röhrchen in einem Fraktionssammler. Starten Analyseprogramm und stellen Sie die Empfindlichkeit zu + / - 10 MeV. Stellen Sie &quot;Zeitbasis&quot;, um 100 Sekunden. </li><li> Positionieren Sie jedes Ultrazentrifugation Rohr in den UV-Detektor gleichzeitig dafür, dass das Rohr in der orthogonalen Position. Durchbohren die Röhre mit der Nadel durch Drehen des Knopfes unter dem Rohrhalter. </li><li> Stellen Sie die Pumpe bei 1,5 ml / min und sammeln die Fraktionen Einstellen der Zeit bis 30 Sekunden auf der Fraktionssammler (dies wird in ~ 750 ul in jeder Fraktion führen). Stellen Sie die Pumpe in der &quot;Remote-Position&quot;, starten Sie die Pumpe und Fraktionssammler, und zur gleichen Zeit starten Sie die Aufnahme mit dem DAQ-Tracer. Dies wird eine Aufwärtsverschiebung der Saccharose gra startendient und eine gleichzeitige Detektion UV-Absorption bei 254 nm auf. Stoppen Sie sammeln, sobald der erste Tropfen jagen Lösung in einem 2 ml Sammelrohr fällt. </li><li> Speichern Sie die Ablaufverfolgung im csv-Format und (einmal Schritt 3.7 abgeschlossen ist) in einem Tabellenkalkulationsprogramm, gehen Sie wie folgt, um die Positionierung der einzelnen Fraktionen im UV-Absorptionsprofil identifizieren.: <ol><li> Wählen Sie die Spalte, die Werte entsprechend bei 254 nm Extinktion (Kanal 0). </li><li> Erstellen Sie eine glatte Linie Streudiagramm der Absorptionen. </li><li> Stellen Sie die Haupteinheit der X-Achse 300, indem das Volumen von 5% -50% Saccharose-Gradienten (~ 12 ml) durch die Erfassungszeit jeder Fraktion (30 sec) erhaltene (Wert. </li></ol></li><li> In 750 ul Trizol in jeder Fraktion und Flash Einfrieren der Fraktionen in flüssigem Stickstoff. </li><li> Isolieren Polysomen-assoziierten und cytosolische (2,6)-RNA unter Verwendung von Trizol-Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um RNA-Ausbeute zu erhöhen, gehen Sie mit RNA Präzisionschlags bei -80 ° C für 30 min und 20 ° C über Nacht. Hinweis: Da die Menge von RNA aus polysomaler Fraktionen gefällt nicht deutlich sichtbar sein, wird empfohlen, Träger hinzuzufügen. 1 &amp;mgr; l des Trägers an dem Rohr vor der RNA-Fällungsschritt während des Trizol-Protokoll. </li><li> Bestimmen Sie, welche Fraktionen entsprechen mRNA mit&gt; 3 Ribosomen assoziiert (mit Ansatz beschrieben 3.6) und bündeln diese Fraktionen. Verwenden Sie die RNA Cleanup Kit zur Reinigung von gepoolten Polysom-assoziierten und zytosolischen RNA (ab 2.6) durchzuführen. Proben Senden an eine Anlage zur genomweiten mRNA-Spiegel bestimmen mit Microarrays oder tief Sequenzierung. Wenn die Übersetzung von spezifischen mRNAs müssen durch RT-qPCR überwacht werden, ist es empfehlenswert, 500 ng RNA (aus gepoolten Fraktionen, die&gt; 3 Ribosomen oder Gesamt-RNA), um cDNA zu synthetisieren. Hinweis: mRNAs mit&gt; 3 Ribosomen assoziiert ist willkürlich festgelegt, um effizient übersetzt mRNAs darstellen und enthalten mehr als 80% der neu synthetisiertenGröße Polypeptide 28,29. Inklusive Fraktionen, die Licht (1-2), mittel-(2-3) und schweren Polysomen (&gt; 3) wäre es von Vorteil, aber diese werden Anzahl der Proben, die durch 2-fach (4 vs 2 pro Bedingung) zu erhöhen und damit die Kosten des Experiments. Ungeachtet dessen, dass es wird erwartet, dass der Rückgang der Kosten für die Tief Sequenzierung und Microarray-Analyse in Zukunft sollte den zweiten Ansatz bevorzugen, ist es ratsam, dass bei der Validierung, die Verteilung der einzelnen mRNAs ist in jeder Fraktion überwacht. </li></ol> 4. Genom-weite Analyse der mRNA-Translation <ol><li> Installieren Sie R, Bioconductor und die anota Paket: <ol><li> Installieren Sie R (Download von r-project.org) und starten Sie eine R-Sitzung. Hinweis: R ist für alle Betriebssysteme verfügbar und anota wird auf alle von ihnen laufen. </li><li> Installieren Bioconductor (bioconductor.org). Die von do gestartet wird - R-Code wird durch den R-Anschluss (z. B. die R-Konsole in Windows interpretiertuble Sie auf die R-Verknüpfung). Bioconductor wird durch Eingabe von (in der R-Terminal) installiert: Quelle (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Installieren Sie das Paket anota Bioconductor (und die qvalue Paket, das anota erfordert), indem Sie (in der R-Anschluss): Quelle (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Testen Sie, ob das Paket erfolgreich installiert und öffnen Sie die anota Handbuch, indem Sie (in der R-Anschluss): Bibliothek (&quot;anota&quot;) Vignette (&quot;anota&quot;) </li><li> Hinweis: Zusätzliche Hilfe für alle Funktionen, die im anota Paket verwendet werden, können entweder an der anota Web-Seite (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) oder über gefunden werden Die Hilfe-Funktion in R. Zum Beispiel, um Hilfe zum anotaPerformQc Funktion erhalten Sie auf der R-terminal und Art (beachten Sie, dass dies nur funktioniert, wenn die anota Paket geladen wurde): Bibliothek (&quot;anota&quot;) # lädt das Paket anota ? AnotaPerformQc # öffnet Hilfe für diese Funktion </li></ol></li><li> Importiert Daten in R: <ol><li> Bereiten Expressionsdaten für die Analyse. Daten sollten vorverarbeitet werden (zB normalisiert und Qualitätskontrolle) in Bezug auf die Technik, die verwendet wurde, um die mRNA-Spiegel zu messen. Eingabewerte müssen sich transformiert werden, am häufigsten ist log2. Kompilieren einer Tabelle mit Daten für alle Polysomen-assoziierten RNA-Proben und eine für alle zytosolischen RNA-Proben. Die erste Spalte ist die Gen-Identifikatoren, gefolgt von einer Datenspalte pro Probe enthalten; die erste Zeile sollten Namen für die Proben enthalten. Es ist entscheidend, dass die Tabellen identische Probe bestellen und identischen Gen Ordnung. Speichern Sie die Dateien als durch Tabulatoren getrennte Textdateien namens &quot;myPolysomeData.txt&quot; und &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> In diesem Beispiel werden zwei Beispielklassen verwendet werden (Steuer oder kranken) mit 3 Wiederholungen pro Klasse, wodurch 6 Proben mit dieser Reihenfolge: C1, C2, C3, D1, D2, D3 in den beiden myCytosolicData.txt und myPolysomeData.txt-Dateien. Anota benötigt mindestens drei Wiederholungen pro Bedingung, wenn es zwei Beispielklassen. Diese sollten unabhängige biologische Wiederholungen sein. </li><li> Erstellen Sie ein Verzeichnis, das die Daten-Eingabedateien (myPolysomeData.txt und myCytosolicData.txt) enthält. Offene R aus diesem Verzeichnis. In Windows / Mac kann dies durch Kopieren eines R-Verknüpfung in dieses Verzeichnis und starten mit R diese Abkürzung durchgeführt werden (die direkte Arbeit kann auch über die Dropdown-Menüs geändert werden). </li><li> Erstellen Sie eine Datei namens myCode.R in das neu erstellte Verzeichnis und öffnen Sie sie mit einem Textbearbeitungssoftware. Schreiben Sie den Code in dieser Datei. </li><li> Um die Daten in R zu laden schreiben Sie den folgenden Code in die Datei myCode.R (denken Sie daran, erneut speichern Sie diese Datei nach jeder Zugabe von Code). Unten finden Sie eine Schritt-für-step Erklärung der Code, sondern den gesamten Code könnte auch zunächst und die Quellenfunktion geschrieben werden (das führt den Code, siehe unten) nur einmal verwendet: # # Dies lädt die Bibliothek anota Bibliothek (anota) # # Dies lädt Eingangsdaten in R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, September = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, September = &quot; t&quot;)) </li><li> Führen Sie den Code in R, indem Sie direkt in die R-Terminal: Quelle (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Prüfen, ob die Daten erfolgreich, indem Sie (in den R-Anschluss) geladen: Kopf (dataCyto) # wird oben in der Tabelle zeigen dataCyto Kopf (dataPoly) </li></ol></li><li> Identifizierung der Gene unterschiedlich übersetzt: <ol><li> Erzeugen Sie einen Vektor, der beschreibt,die Proben Kategorien (ein Vektor ist eine Art von Objekt in R). Dieser Vektor sollte die Probe, um in der myPolysomeData.txt myCytosolicData.txt und zu reflektieren, so dass alle drei Objekte eine identische Reihenfolge der Proben. Der Vektor wird bei der Beauftragung anota, über die Proben zum Vergleich verwendet werden. Fügen Sie den folgenden auf die myCode.R Datei: # # Beachten Sie, dass die Wiederholungsproben identische Beispielklasse # # Beschreibungen (dh &quot;C&quot; oder &quot;D&quot;) in diesem Vektor. myPhenotypes &lt;- c (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;E&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Eine Qualitätskontrolle des Datensatzes. Es gibt eine Reihe von Qualitätsmaßen, die bewertet werden, bevor anota kann für die Analyse verwendet werden müssen. Diese sind im Detail in der anota Handbuch besprochen. Fügen Sie diesen Code myCode.R Datei und speichern: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (DATAT = dataCyto, DataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Führen Sie den Code, indem Sie in die R-Terminal: Quelle (&quot;myCode.R&quot;) Dies wird eine Reihe von Ausgabedateien, die untersucht wie in der Anleitung beschrieben werden anota generieren. </li><li> Identifizieren unterschiedlich übersetzt Gene. Die Proben werden auf der Grundlage der alphabetischen Reihenfolge der auf den Parameter &quot;phenoVec&quot; (dh die &quot;myPhenotypes&quot; Vektor) geliefert, sofern sie nicht durch den Benutzer (mit dem Parameter &quot;Kontraste&quot;) angegeben sind Namen verglichen werden. Fügen Sie den folgenden Code, um Datei-und Abgang mit dem &quot;Quelle&quot;-Befehl innerhalb myCode.R die R-Terminal, wie oben beschrieben: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (DATAT = dataCyto, DataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Verwenden Sie die Hilfe für anotaGetSigGenes zu verstehen, wie die output formatiert und sehen, wie man Probe Kategorien wählen, indem Sie (in der R-Anschluss) zu vergleichen: ? AnotaGetSigGenes </li><li> Filter und Grundstück Gene, die übersetzt werden. Es gibt mehrere Schwellenwerte, die innerhalb der anotaPlotSigGenes Funktion angewendet werden kann, und mit Hilfe eine benutzerdefinierte Kombination solcher Schwellenwerte zu vereinfachen. Um zuverlässig analysierten Gene wählen, gelten die minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) und slopeP (0,01)-Einstellungen. Hinweis: Zusätzlich, Einstellungen der Anwendung zu RVM 23,26,30 False Discovery Rate (FDR) (0,15) und falten Änderungen (log2 [1.5]) kann zB verwendet werden, um Gene zu identifizieren unterschiedlich übersetzt werden. Andere Filter wie &quot;selDeltaPT&quot; kann für eine strengere Filterung (zB Einstellung selDeltaPT log2 [1.5]) sein. Es ist auch notwendig, um festzulegen, die den Vergleich sollte (mit dem Argument selCont) gefiltert werden. Übernehmen Sie die beschriebenen Einstellungen, indem Sie folgende Zeile in die myCode.RDatei: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5) = selDeltaPT log2 (1.5)) </li><li> Führen die Analyse unter Verwendung der Quellenfunktion von der R-Klemme, wie oben beschrieben. Dies wird auch eine grafische Ausgabe erzeugen. Untersuchen Sie diese Ausgabe ist ein guter Ausgangspunkt, um die Leistung der Analyse zu bewerten und die notwendigen Änderungen an den Einstellungen zu identifizieren. </li><li> Generieren einer Ausgabetabelle. Fügen Sie den folgenden Code in die Datei myCode.R: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, September = &quot; t&quot;) </li><li> Führen Sie den Code mit der Quellenfunktion in der R-Terminal. Die Spalten in der Ergebnistabelle sind in der Hilfe zum anotaPlotSigGenes Funktion erläutert. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieser Artikel beschreibt eine gut etablierte Polysom ​​Fraktionierung Protokoll gefolgt von einer in-house entwickelten Analyseverfahren für die Erfassung von qualitativen und quantitativen Veränderungen in der translationalen Aktivität auf einem genomweiten Maßstab in Säugerzellen. Für sollten erfolgreichen Abschluss dieses Protokoll besonders auf 1) Handy Konfluenz bezahlt werden (wie die Proliferationsraten und Nährstoffverfügbarkeit korrelieren mit mRNA-Translation-Aktivität und kann die Zusammensetzung der translatome beeinflussen, Zellkonfluenz sollte konsistent über Wiederholungen und experimentellen Bedingungen), 2) Schnelle Zelllyse (trotz der Gegenwart von Cycloheximid und RNAse-Inhibitoren in Puffer sollte Lyse schnell und Zellextrakten sollte Saccharose-Gradienten unmittelbar nach der Lyse zu RNA-Abbau und Dissoziation von Polysomen verhindern lagert werden), 3) verlaufend Herstellung (um sicherzustellen, hohe Daten Reproduzierbarkeit sollte Saccharose-Gradienten unter Verwendung des Gradienten-Hersteller und spe vorbereitet werdensoziale Sorgfalt sollte beim Umgang mit ihnen) entnommen werden. Neben der Untersuchung die Veränderungen in der translationalen Aktivität können dieses Protokoll verwendet, um Ribosomen-assoziierten Protein-Komplexe zu isolieren und ihre physiologischen Funktionen einzurichten. Zu diesem Zweck können Ebenen und Phosphorylierung verschiedener Ribosomen-assoziierten Proteinen, die durch TCA-Fällung bestimmt werden, gefolgt von Western-Blot, während Ribosomen-assoziierten Proteinkomplexen aus Gradientenfraktionen immunpräzipitiert und mittels Western-Blotting oder Massenspektrometrie analysiert werden. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die langsame Gradientenfraktion Methode könnte in Dissoziation von selbst fest gebundenen Proteine, deren Bindungs ​​Kinetik in schneller Verband / Dissoziation führen. Faktoren, die neu synthetisierten Polypeptiden assoziiert sind typische Beispiele. Neu synthetisierte Polypeptide Schwellen bilden die Ribosomen können Proteinkomplexe mit Ribosomen unter Verwendung chemischer Vernetzungsmittel, wie 3 zugeordnet immobilisiert, 3&#39;-Dithiobis [sulfosuccinimidylpropionat] (DTSSP) 31. Dieser Ansatz zeigte, dass der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminale Kinase (JNK) / Übersetzung eukaryotischen Elongationsfaktor 1A2 (eEF1A2)-Komplex reguliert Abbau von neu synthetisierten Polypeptide in Reaktion auf Stress 27. Darüber hinaus wurde eine ähnliche Methodik wie in Studien, die zeigen, dass die Proteinkinase C bII (PKCbII) an Ribosomen durch RACK1 32 und daß die Aktivierung des mTOR-Komplex 2 (mTORC2) rekrutiert tritt an den Ribosomen, wo es phosphoryliert neu synthetisierte Polypeptide AKT reguliert und verwendet ihre Stabilität 33,34. Haupteinschränkungen der Polysomen-Fraktionierungsverfahren gefolgt von anota Analyse sind: 1) Erfordernis einer relativ hohen Anzahl von Zellen (~ 15 × 10 6 Zellen), 2) das Fehlen von Positionsinformationen über die Lokalisierung des Ribosoms auf einer gegebenen mRNA-Moleküls, und 3 ) Fragen, die zellulären und molekularen Zusammenhang Heterogenität von Normal-und Tumorgewebe. Probleme, auf die erforderliche Zellzahl bezogen kann durch Ausrichten Absorptionsspektren Peaks, die monosomes (80S) von Zellen, deren Beträge werden mit denen von Hochfluss-Zellen erhalten (zB HeLa-Zellen) 35 Begrenzung gelöst werden. Ribosomen-Profiling-Technik (siehe unten) kann die genaue Position des Ribosoms auf einer gegebenen mRNA-Moleküls zu bestimmen, während Probleme Störfaktoren Wirkungen einer Gewebe Heterogenität über die Auslegung von Veränderungen in der Genexpression von komplexen Systemen wie menschlichen Geweben gewonnen Zusammenhang diskutiert im Detail in einer Veröffentlichung von Lauch und Storey 36. Kürzlich wurde eine neue Ribosomen Profitechnik entwickelt, bei der Ribosomen-geschützten Fragmente (RPF) von RNase I-Behandlung erzeugt und durch Tief Sequenzierung 22 analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Position des Ribosoms an einer einzelnen Nukleotid-Auflösung, wodurch bisher UNPRecedented Einblicke in Ribosomen Biologie. Zum Beispiel kann Ribosomen Profilierung zur Bestimmung der Ribosomendichte auf einer gegebenen mRNA-Moleküls oder die Identifizierung von Elementen verwendet werden, die Einfluss Translationsinitiationsraten wie die alternativen Initiierungsstellen, Initiierung bei nicht-Aug-Codons und regulatorischen Elementen wie uORFs. Es gibt jedoch einige methodische Einschränkungen, die die Fähigkeit des Ribosoms Profiling genau zu schätzen mRNA Translationseffizienz zu beschränken. Dazu gehören unabhängige Verzerrungen durch zufällige Fragmentierung und RNase-Verdau eingeführt, Vorurteile durch Übersetzung Inhibitoren (zB Dehnung Inhibitoren wie Emetin und Cycloheximid wahrscheinlich Ribosom Ansammlung an Translationsinitiationsstellen induzieren) eingeführt, eine große Anzahl von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen verbunden mit TE-Scores sowie deren Ungenauigkeit bei der Vorhersage der liest, dass von Protein-kodierenden mRNAs 37 stammen. Vielleicht am wichtigsten ist, währendRibosomen Profilierung ermöglicht eine direkte Identifizierung der Ribosomen Position auf einer gegebenen mRNA-Moleküls, ist die Anzahl der Ribosomen, die mit einer gegebenen mRNA assoziiert wird indirekt durch Normalisieren Frequenzen liest RPF (Ribosomen-assoziierten mRNA) über die in zufällig fragmentiert mRNAs beobachtet (geschätzte Gesamt mRNA). Zum Beispiel wird in einer einfachen, in dem vier &quot;B&quot;-mRNA-Moleküle (Ba, Bb, Bc und Bd) werden durch vier Ribosomen an den Positionen 1, 2, 3 und 4 ist ein inhärenter Nachteil des Ribosoms Profiling-Technik ermöglicht nicht besetzt eine Unterscheidung zwischen einem Szenario, bei dem alle 4 Ribosomen assoziieren nur mit einem Ba-mRNA in den Positionen 1, 2, 3 und 4 und einem Szenario, Ba, Bb, Bc und Bd mRNA sind jeweils durch eine einzige Ribosomen an der Position 1, 2 besetzt , 3 und 4. Im Gegensatz dazu während der Polysomen-Fraktionierung wird Polysomen Integrität bewahrt, wodurch eine Isolierung des Pools von mRNAs mit einer definierten Anzahl von Ribosomen (Fig. 1) verbunden. Dieser Important Unterscheidung zwischen Polysom ​​Fraktionierung und Ribosom Profilierung schlägt vor, dass, während die erste Methode verwendet werden, um direkt vergleichen mRNAs in mRNP werden, leichte und schwere Polysom ​​Fraktionen, die letztere Methode wird wahrscheinlich nicht zu Veränderungen in der translatome, die von mRNAs, die verursacht werden, zu erfassen Übergang von Leichte bis schwere Polysomen, während Überschätzung der Beitrag von denen, die von der Fraktion auf mRNP schweren Polysomen verschieben. Die biologische Bedeutung dieser Abweichungen zwischen den vorgenannten Verfahren ist von einer großen Menge an Daten, die zeigen, dass Translations Aktivierung einer Untergruppe von mRNAs, wie jene, die eIF4E-empfindlich sind unterstrichen, Übergang von leicht bis schwer Polysomen, während andere, wie die Beherbergung 5&#39;TOP Elemente, um schwere Polysomen direkt aus Pools von Ribosomen-mRNA frei 6 rekrutiert. Interessanterweise ist die mTOR wurde gezeigt, gleichzeitig modulieren Übersetzung von &quot;eIF4E empfindlich&quot; und 5&#39;TOP mRNAs 11. Daher kann methodischen Unterschieden, die oben diskutiert sind die scheinbare Unstimmigkeit des Abschlusses zwischen Studien mit Ribosomen-Profilierung 38,39 und 24 Polysomen-Fraktionierung, um die Auswirkungen von mTOR Inhibition am translatome beurteilen zu erklären. Abschließend Polysomen-Fraktionierung und Ribosom Profilierung komplementär sind Methoden, die in erster Linie Informationen über die Anzahl der Ribosomen-mRNA und die Position des Ribosoms an mRNA zugeordnet sind. Wichtig ist, dass trotz der Mängel und Vorteile dieser Verfahren ist es wesentlich, daß die genomweite Daten von beiden Verfahren erhalten werden, ausreichend analysiert und funktionell und biochemisch bestätigt.

Die regulatorischen Netzwerke, die die Genexpression steuern, sind ausführlich in den letzten zwei Jahrzehnten untersucht. Die überwiegende Mehrheit dieser Forschung auf Transkriptionsregulation, wobei Änderungen in der Steady-State-mRNA-Spiegel auf einem genomweiten Maßstab wurden verwendet, um so genannte &quot;Gen-Expression&quot;-Profile bestimmen, konzentriert. Neuere Studien zeigen, dass stationäre mRNA-Spiegel nur lose mit der Zusammensetzung des Proteoms 1,2 entsprechen, wodurch angezeigt wird, dass die post-transkriptionale Mechanismen, einschließlich mRNA-Translation, spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Genexpression 3,4. Tatsächlich wird geschätzt, dass ~ 50% der Protein-Ebene auf der Ebene der mRNA-Translation in immortalisierten Mausfibroblasten 5 bestimmt. mRNA-Translation ist ein hoch regulierter Prozess, bei dem mRNAs werden über orchestrierte Aktion von Ribosomen, Transfer-RNAs (tRNAs) und Hilfsfaktoren Zusammenarbeit in Proteine ​​übersetztmmonly als Übersetzungsfaktoren (TFs) 6 bezeichnet. Die Proteinsynthese ist die energieverbrauchenden Prozess in Säugetierzellen 7 und damit globale mRNA Umrechnungskurse werden eingestellt, um die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Zellproliferationsraten 8 zubringen. Neben den Veränderungen in der globalen mRNA Umrechnungskurse, verschiedene extrazelluläre Stimuli (z. B. Hormone und Wachstumsfaktoren), intrazelluläre Signale (zB Aminosäurespiegel) und verschiedene Arten von Stress (z. B. ER-Stress) induzieren selektive Veränderungen in den Pools von mRNAs, die sind übersetzt (translatome) 6. Abhängig von der Art des Reizes, Translationsaktivität von einigen, aber nicht alle mRNAs dramatisch beeinflusst, was zu Veränderungen im Proteom, die erforderlich sind, um eine schnelle zelluläre Reaktion 6 zu montieren. Diese qualitative und quantitative Veränderungen in der translatome gedacht werden, um durch das Zusammenspiel zwischen trans-wirkende Faktoren (vermittelt werden, z. B. </em&gt; Komponenten der Translationsmaschinerie, Hilfsfaktoren oder miRNAs) und cis-Elemente (RNA Elemente oder Merkmale) in ausgewählten Teilmengen von 6,9 mRNAs vorhanden. Zum Beispiel Veränderungen in der Höhe und / oder Aktivität von geschwindigkeitsbegrenzenden Translationsinitiationsfaktoren eIF4E und eIF2 selektiv modulieren Übersetzung von Transkripten auf die spezifischen Merkmale 5&#39;UTR 6. eIF4E und eIF2 sind für die Rekrutierung von mRNA und Initiator-tRNA zum Ribosom erforderlich, bzw. 6. Eine Zunahme der Aktivität selektiv eIF4E Wangen Translation von mRNAs beherbergen lang und stark strukturierten 5&#39;UTRs einschließlich der Codierung Proliferation und Überleben stimulierende Proteine, einschließlich Cycline, c-myc-und Bcl-xL-10. Im Gegenzug Inaktivierung von eIF2 führt zu einer globalen Proteinsynthese Abschaltung, während selektiv Regel Übersetzung von mRNAs, die kurze hemmende aufwärts offenen Leserahmen (uORFs) in ihrer 5&#39;UTRs, wie solche Codierung Master transcriptional Regulatoren des ungefalteten Protein-Reaktion (z. B. ATF4). Als Reaktion auf verschiedene Reize wie Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Hormone, die mechanistische / mammalian target of Rapamycin (mTOR)-Weg stimuliert eIF4E-Aktivität durch Inaktivierung des 4E-Bindungsprotein (4E-BP)-Familie von Übersetzungsunterdrücker, während die MAPK-Weg direkt phosphoryliert EIF4E 6,11. Im Gegenzug eIF2a Kinasen (dh Perk, PKR, HRI und GCN2) hemmen eIF2 durch Phosphorylierung seiner eIF2a regulatorischen Untereinheit in Reaktion auf einen Nährstoffmangel, ER-Stress-und Virus-Infektion 6,12. Veränderungen in der Aktivität und / oder Expression von Transkriptionsfaktoren, haben andere Komponenten der Translationsmaschinerie und regulatorische Faktoren miRNAs in verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Stoffwechselsyndrome, neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen und Nierenerkrankungen und Herz-Kreislauf 13-19 beobachtet. Insgesamt zeigen diese Daten, dass mir translationalenismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zell-Homöostase und dass ihre Aufhebung spielt eine zentrale Rolle in der Ätiologie der verschiedenen menschlichen Krankheiten. Hierin wird ein Protokoll für die Fraktionierung von Polysomen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation in Säugerzellen, die verwendet wird, um von Polysomen monosomes, ribosomalen Untereinheiten und Messenger Ribonukleoproteinpartikel (mRNPs) getrennt beschrieben. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen effizient übersetzt (mit schweren Polysomen assoziiert) von schlecht übersetzt (mit Licht Polysomen assoziiert) mRNAs. In diesem Assay werden Ribosomen auf der mRNA mit immobilisierten Translationselongation Inhibitoren wie Cycloheximid 20 und cytosolische Extrakte werden auf 5-50% linearen Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation getrennt durch. Anschließende Fraktionierung Saccharosegradienten erlaubt die Isolierung von mRNA nach der Zahl von Ribosomen sie zu binden. RNA aus jeder Fraktion extrahiert können dann verwendet werden, um zu bestimmen,Veränderungen in der Verteilung der mRNAs für die Gradienten zwischen unterschiedlichen Bedingungen, wobei die Translationseffizienz nimmt von der Oberseite zur Unterseite des Gradienten. Northern Blotting oder quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) verwendet werden, um Niveaus von mRNA in jeder Fraktion zu bestimmen. Alternativ Fraktionen mit schweren Polysomen (in der Regel mehr als 3 Ribosomen) werden gesammelt und Genom-weiten Polysomen-assoziierter mRNA-Spiegel werden mittels Microarray-oder Tief Sequenzierung bestimmt. Es ist von größter Wichtigkeit zu betonen, dass das Niveau der Polysom ​​assoziierte mRNAs sind, zusätzlich zur Übersetzung von Transkriptions-und post-transkriptionale Mechanismen, die cytosolische mRNAs 21 Ebenen beeinflussen betroffen. Deshalb, um Unterschiede in der Übersetzung mit genomweiten Daten von Polysomen-assoziierten mRNA zu bestimmen, ist es notwendig, die Auswirkungen der Schritte der Genexpression Weg, der stromaufwärts des Translations sind korrigierention 21. Um eine solche Korrektur zu ermöglichen, wird zytosolischen RNA parallel Polysom-assoziierten RNA von jeder Probe und der Genom-weiten Steady-State-mRNA-Mengen hergestellt werden, bestimmt 21. Derzeit sogenannten &quot;Übersetzung Effizienz&quot; (TE) Bewertung (dh die Log-Verhältnis von Polysomen-assoziierten mRNA-Daten und cytosolische mRNA-Daten) werden oft verwendet, um die Effekte von Änderungen der cytosolischen mRNA-Mengen auf die Translationseffizienz eines korrekten 22 mRNA gegeben. Allerdings mit TE-Scores zu identifizieren Differential Übersetzung ist mit einer beträchtlichen Zahl von falsch positiven und falsch negativen Befunde durch eine mathematische Eigenschaft der TE-Partituren allgemein als Scheinkorrelation 27 Absatz verbunden. In der Tat eine Erhebung von Datensätzen aus verschiedenen Labors gezeigt, dass solche Scheinkorrelationen scheint unvermeidlich zu sein, wenn die Analyse von Veränderungen in den translatomes 23. Dies veranlasste Entwicklung der &quot;Analyse der Differenz tr<html> anslation &quot;(anota)-Algorithmus, der nicht von den vorgenannten Unzulänglichkeiten 23 leidet. Während anota-Analyse ein Regressionsmodell wird verwendet, um Maßnahmen der translationalen Aktivität unabhängig von zytosolischen RNA-Werte abzuleiten. Solche Maßnahmen werden dann zwischen den Bedingungen und eine Statistik berechnet wird, verglichen. Der Benutzer hat die Möglichkeit der Anwendung einer Schrumpfung Varianz-Methode, die statistische Aussagekraft verbessert und reduziert das Auftreten von falsch-positive Ergebnisse aus Studien mit wenigen Wiederholungen 24. Bezeichnenderweise wurde kürzlich gezeigt, dass Störungen in der translatome durch anota erfasst, aber nicht TE Partituren, korrelieren mit Veränderungen im Proteom 25. Es wird daher dringend empfohlen, anota Analyse zur Identifizierung von Änderungen in der Übersetzung auf einem genomweiten Maßstab gelten. Während die theoretischen Grundlagen der anota Algorithmus wurden zuvor im Detail diskutiert 21,23,26, Schwerpunkt liegt hier auf, wie es in der Praxis anzuwenden. ve_content &quot;&gt; Zusätzlich zu der Untersuchung von Veränderungen in der mRNA-Übersetzung Aktivität in der Zelle, kann diese Ribosomen Fraktionierung Protokoll zur Isolierung und funktionell und biochemisch zu charakterisieren Ribosomen und Polysomen-assoziierten Protein-Komplexe werden. Dieser Ansatz hat sich in der Vergangenheit erfolgreich zu identifizieren, im Einsatz Komplexe, die die Stabilität von neu synthetisierten Polypeptiden, 27 und / oder der Phosphorylierung von Komponenten des Translationsmaschinerie beteiligt regulieren. Diese Anwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren wird auch kurz beschrieben werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

mRNA-Translation spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation der Genexpression und repräsentiert die Energie verbrauchenden Verfahren in Säugerzellen. Dementsprechend ist eine Fehlregulation der mRNA-Übersetzung als eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen wie Krebs spielen. Ribosomen hosten auch Chaperone, die Faltung des entstehenden Polypeptide zu erleichtern, damit Funktion und Stabilität von neu synthetisierten Polypeptide modulieren. Zusätzlich Schwellen Daten zeigen, dass Ribosomen dienen als Plattform für ein Repertoire von Signalmolekülen, die in einer Vielzahl von post-translationalen Modifikationen von neu synthetisierten Polypeptiden beteiligt sind, wie sie aus dem Ribosom hervorgehen, und / oder Komponenten der Translationsmaschinerie. Hierin ist ein gut etabliertes Verfahren zur Ribosomen Fraktionierung unter Verwendung von Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation beschrieben. In Verbindung mit der in-house entwickelten &quot;anota&quot;-Algorithmus diese Methode erlaubt die direkte Bestimmung der verschierenz Übersetzung der einzelnen mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann diese vielseitige Protokoll für eine Vielzahl von biochemischen Untersuchungen mit dem Ziel, die Funktion der Ribosomen-assoziierten Proteinkomplexen, einschließlich derjenigen, die in Falz-und Abbau von neu synthetisierten Polypeptiden eine zentrale Rolle spielen, zu sezieren verwendet werden.

mTOR ist ein wichtiger Knotenpunkt des globalen Mobilfunknetz, die Proteinsyntheserate mit Nährstoffverfügbarkeit 19 koordiniert. mRNA-Translation wird vor allem an der geschwindigkeitsbestimmende Schritt Einleitung 6 geregelt. Der Anteil der Ribosomen in Polysomen engagiert positiv korreliert mit Translationsinitiationsraten 28. Ein Beispiel der Anwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren, die Rolle des mTOR-Signalweg in die Vermittlung der Wirkung von Insulin auf die mRNA-Translation zu untersuchen dargestellt. Zu diesem Zweck wurden MCF7-Brustkrebszellen in niedrigen Serum gehalten und dann mit Insulin allein oder in Kombination mit dem aktiven Zentrum mTOR Inhibitor Torin1 stimuliert. Nicht-stimulierten Zellen, die kontinuierlich in niedrigen Serum gehalten wurden, dienten als Kontrolle. mRNPs, monosome (80S) und Polysomen-Fraktionen wurden unter Verwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren getrennt. Relativ zu den Kontrollzellen induzierte Insulin eine Zunahme der Absorption in Gradientenfraktionen entsprechendePolysomen an, begleitet von einer gleichzeitigen Abnahme der Extinktion im monosome Fraktion (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Anteil der Ribosomen in Polysomen Eingriff ist in der Insulin im Vergleich zu Kontrollzellen behandelt, erhöht daher darauf hinweist, dass, wie erwartet, stimuliert die Insulin globalen Translationsinitiationsraten. Torin1 umgekehrt die Wirkung von Insulin auf die Absorptionsprofile (Fig. 1), wodurch die übereinstimmende Ergebnisse, dass mTOR Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Wirkungen von Insulin auf den Translationsmechanismus 19. Basierend auf einem Grundsatz, dass die Unstimmigkeiten in Gradienten Vorbereitung nicht vermieden werden kann, sind Fragen wurden in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der mit der Polysom ​​Fraktionierungsmethode 22 erhaltenen Daten erhöht. Um dieses Problem möglicherweise schädlichen, cytosolische und schwere Polysom-assoziierten RNA (mRNA mit 4 und mehr Ribosomen assoziiert) empirisch zu testen, wurden isoliert<html> von MCF7-Zellen mit Insulin allein oder in Kombination mit Insulin Torin1 aus 4 unabhängigen biologischen Wiederholungen (Fig. 2) behandelt. Die Wirkung von Insulin und Torin1 über die Zusammensetzung der cytosolischen und schwere Polysom-assoziierten mRNA in jeder Wiederholung wurde auf einem genomweiten Maßstab unter Verwendung eines Mikroarray-Ansatz bestimmt. Um die Reproduzierbarkeit der Polysomen-Fraktionierungsverfahren die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde angewendet bestimmen. Eine derartige Analyse zeigte, daß die Proben auf die jeweilige Gegebengehör wurden eng in die beiden ersten Komponenten angeordnet, während die anderen Bedingungen waren gut getrennt (Fig. 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fraktionierung Polysom ​​Verfahren wie hier beschrieben wird, ist in hohem Maße reproduzierbar und daher angebracht, quantitative und qualitative Veränderungen in der Übersetzung auf einer Genom-weiten Ebene zu studieren. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Polysomen-Profile, welche die Effekte von Serumentzug, Insulin und mTOR Signalisierung auf globale Translation in MCF7-Zellen. MCF7-Zellen wurden von Nährstoffen (in 0,1% FBS) für 16 Stunden entzogen und mit 5 nM Insulin (Ins) allein oder behandelt in Kombination mit 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) für 4 Stunden. Unbehandelte Zellen, die kontinuierlich von Nährstoffen (0,1% FBS) entzogen wurden, wurden als Kontrolle verwendet. Die entsprechenden cytosolischen Extrakte wurden durch Zentrifugation auf 5-50% Saccharose-Gradienten sedimentiert. Kostenlose ribosomalen Untereinheiten (40S und 60S), monosomes (80S) und Anzahl der Ribosomen in den Polysom ​​Fraktionen sind angegeben. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendung von p erhalten Genom-weite Datenolysome Profilierung ist in hohem Maße reproduzierbar. MCF7-Zellen wurden, wie in 1. cytosolische und Polysomen-assoziierten RNA (&gt; 3 Ribosomen) wurde aus 4 unabhängigen biologischen Replikaten und deren Genom-weiten-mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung von extrahierten GeneTitan Arrays (Affymetrix) bestimmt behandelt. PCA wurde verwendet, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Daten zu bewerten. Gezeigt werden die ersten beiden PCA-Komponenten für alle Behandlungen (T1 = Torin 1; ctrl = Kontrolle; Ins = Insulin), Ursprung der RNA (C = cytosolische, p = Polysom-assoziiert) und repliziert. Die Proben aus den gleichen Bedingungen und RNA Herkunft sind eng positioniert was eine hohe Reproduzierbarkeit.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

68.2K Aufrufe.  McGill University.  Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden. 

Serie: Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Forschung

Biologie

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Genomweite Analyse der Aminoacylierung (Charging) Ebenen der tRNA mittels Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...