Questa ricerca è stata sostenuta dal Canadian Institutes of Health Research (sovvenzione CIHR MOP-115195) e FRQ-S ad esso, che è anche destinatario di CIHR Young Investigator Award; e il Consiglio svedese della ricerca e la svedese Cancer Society di OL

1. Gradiente di saccarosio Preparazione <ol><li> Preparare 100 ml di 60% (w / v) di soluzione di saccarosio in DDH 2 O. Soluzione deve essere filtrata attraverso un filtro da 0,22 micron per impedire intasamento del tubo durante la fase di frazionamento (passo 3.5). </li><li> Preparare 5 ml di 10x tampone di gradiente di saccarosio: HEPES 200 mM (pH 7.6), 1 M KCl, 50 mM MgCl 2, 100 pg / ml cycloheximide, 1x inibitore della proteasi cocktail (gratuito-EDTA), 100 unità / inibitore della RNasi ml. </li><li> Utilizzando la soluzione al 60% preparata come descritto al punto 1.1, fare 40 ml di 5% e soluzioni di saccarosio 50% in 1x tampone gradiente di saccarosio. </li><li> Utilizzare il blocco Marker fornito con il produttore di sfumatura per segnare il punto mezzo pieno su ciascun tubo ultracentrifugazione polyallomer per la stratificazione (6 tubi ultracentrifugazione in totale). Utilizzo del dispositivo di stratificazione fornito con la macchina gradiente, aggiungere la soluzione di saccarosio 5% fino a raggiungere il punto di mezzo pieno. Quindi, aggiungere una soluzione di saccarosio al 50% dal fondo fino alla interfasso tra le due soluzioni raggiunge il punto di mezzo pieno. Particolare attenzione deve essere assunto durante questa fase in modo che le sfumature siano il più possibile simili, in quanto ciò è essenziale per ottenere un&#39;alta riproducibilità (vedi sotto). </li><li> Sigillare i tubi con tariffa tappi zonali forniti con il produttore di gradiente e trasferire i tubi sigillati al titolare tubo sul creatore di gradiente. </li><li> Eseguire il creatore gradiente per ottenere un 5% al ​​50% gradiente lineare. 6 gradienti lineari saranno formati in pochi minuti dalla rotazione ad alta inclinazione. Nota: gradienti di saccarosio possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -80 ° C per 6 mesi. </li></ol> 2. Isolamento e sedimentazione di polisomi <ol><li> A seconda del tipo di cellula, sementi celle in 1-5 15 cm piastre Petri (~ 15 x 10 6 cellule) almeno un giorno prima della lisi. Il giorno degli esperimenti celle devono essere ~ 80% confluenti. <!-- Nota: confluenza ottimale è fondamentale perché i tassi di traduzione e di proliferazione sono direttamenteproporzionali 8, e quindi polisomi dovrebbero essere analizzati in cellule attivamente proliferanti (cioè tassi di conversione saranno significativamente goccia in più di cellule confluenti che bassa confluenza di cellule non può fornire materiale sufficiente per ulteriori analisi). Le eccezioni a questa regola può essere fatto se per esempio lo sperimentatore è interessato a studiare l&#39;effetto di inibizione da contatto sulla traduzione. Tuttavia, le cellule non devono essere tenuti sotto sulle condizioni confluenti per troppo tempo, in quanto ciò potrebbe avere effetti involontari sul translatome. Se è necessario trasfezione, la maggior parte dei kit disponibili in commercio non influenzano i livelli polisoma. Poiché il giorno della trasfezione le cellule devono essere 80-90% confluenti, si raccomanda di propagare le cellule 24 ore dopo la trasfezione e isolare polisomi 48 ore dopo la trasfezione di cellule ~ 80% confluenti. </li><li> Incubare le cellule con cicloesimide ad una concentrazione finale di 100 mg / ml in terreno di crescita per 5 min a 37 ° C e 5% Di CO 2; e lavare le cellule due volte con 10 ml di ghiacciata 1x PBS contenente 100 pg / ml cycloheximide. Cicloeximide è un inibitore traduzione allungamento che &quot;congela&quot; ribosomi sul mRNA, impedendo così eseguito ribosoma off 20. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule, in 5 ml di ghiacciata 1x PBS contenenti 100 pg / ml cicloeximide e raccoglierli in un tubo da 50 ml. È importante che questo passo è eseguito ragionevolmente velocemente lasciando le cellule in ghiaccio per un periodo prolungato di tempo drasticamente diminuire la qualità della preparazione polisoma. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 425 ml di tampone ipotonico [(5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM MgCl 2, KCl 1.5 mM e 1x inibitore della proteasi cocktail (gratuito-EDTA)], aggiungere 5 ml di 10 mg / CHX ml, 1 ml di 1 M DTT, 100 unità di inibitore di RNAsi e vortex per 5 sec seguita da aggiunta di 25 ml di 10% Triton X-100 (concentrazione finale 0,5%) e 25 ml di 10% di sodio desossicolato (concentrazione finale 0,5%) e vortex per 5 sec. A causa di rigonfiamento delle cellule, il buffer ipotonico interromperà la membrana plasmatica, considerando che le condizioni detergente delicato vengono utilizzati per solubilizzare citosolica e ribosomi del reticolo endoplasmatico associate senza interrompere la busta nucleare. </li><li> Lisati centrifugare a 16.000 xg per 7 minuti a 4 ° C e il trasferimento di surnatante (~ 500 microlitri) per un nuovo tubo pre-raffreddata da 1,5 ml. Misurare OD a 260 nm per ciascun campione utilizzando uno spettrofotometro e mantenere il 10% del lisato come ingresso che verrà utilizzata per determinare citosolici livelli di mRNA di stato stazionario. Diluire l&#39;ingresso a 750 microlitri RNasi libero in H 2 O, aggiungere 750 ml di Trizol e il flash congelare in azoto liquido. </li><li> Trasferire i tubi ultracentrifuga contenenti gradienti di saccarosio in secchi rotore pre-refrigerati. Rimuovere 500 microlitri dalla parte superiore della gradienti di saccarosio. Regolare lisati in modo che contengano lo stesso OD (10-20 OD a 260 nm) in 500 ml di tampone di lisi (descritto nel passo 2.5) e caricarli su ogni gradiente di saccarosio. Nota: È importante caricare immediatamente lisati sulle pendenze, in modo critico migliorare la qualità delle preparazioni polisoma. </li><li> Pesare ed equilibrare ogni sfumatura prima della ultra-centrifugazione. </li><li> Centrifugare a 222.228 xg (36.000 rpm), per 2 ore a 4 ° C con rotore SW41Ti. Nota: Al fine di non perturbare gradienti di saccarosio, l&#39;opzione freno &quot;basso&quot; dovrebbe essere selezionata. </li></ol> 3. Polisoma frazionamento e RNA Estrazione <ol><li> Preparare il collettore di frazioni pulendo con acqua priva di RNAsi calda contenente RNase ZAP (un paio di spruzzi). Ripetere questa fase con solo acqua RNAsi calda gratuita. Interruttore lampada UV e attendere la luce verde a comparire. </li><li> Rimuovere con attenzione i tubi dal rotore e disporli sul ghiaccio. Accendere il computer pompa, rivelatore UV e raccoglitore di frazioni. Impostare pompa a 3 ml / min e fill il tubo con la soluzione inseguimento [60% (w / v) contenente saccarosio 0,02% (w / v) di blu di bromofenolo] fino a raggiungere l&#39;ago. Assicurarsi vedere almeno una goccia che esce l&#39;ago, e accertare che nessuna bolla sono introdotti nella siringa pompa o tubazione. </li><li> Mettere 2 ml provette in un collettore di frazioni. Avviare il programma di analisi e di impostare la sensibilità di + / - 10 MeV. Impostare &quot;base dei tempi&quot; per 100 sec. </li><li> Posizionare ciascuna provetta ultracentrifugazione nel rivelatore UV assicurandosi che il tubo sia in posizione ortogonale. Forare il tubo con l&#39;ago ruotando la manopola sotto il supporto del tubo. </li><li> Impostare la pompa a 1,5 ml / min e raccogliere le frazioni di impostazione del tempo di 30 sec sul collettore frazione (questo si tradurrà in ~ 750 microlitri di ogni frazione). Mettere la pompa in &quot;posizione remota&quot;, avviare la pompa e collettore frazione, e allo stesso tempo avviare la registrazione utilizzando il tracciatore DAQ. Ciò avvierà uno spostamento verso l&#39;alto della gra saccarosiodiente e una rivelazione simultanea di assorbanza UV a 254 nm. Interrompere la raccolta non appena la prima goccia di soluzione di inseguimento cade in un tubo di raccolta da 2 ml. </li><li> Salvare il tracciato in formato csv e (una volta che passo 3.7 è completato), in un foglio di calcolo, effettuare le seguenti operazioni per identificare la posizione di ogni frazione nel profilo assorbanza UV.: <ol><li> Selezionare la colonna contenente i valori corrispondenti a assorbanza a 254 nm (canale 0). </li><li> Creare una linea liscia della dispersione delle assorbanze. </li><li> Impostare l&#39;unità principale dell&#39;asse X a 300 (valore ottenuto dividendo il volume del 5% -50% gradiente di saccarosio (~ 12 ml) entro la raccolta di ogni frazione (30 sec). </li></ol></li><li> Aggiungere 750 ml di Trizol in ogni frazione e flash congelare le frazioni in azoto liquido. </li><li> Isolare polisoma associati e citosolica (da 2,6) RNA utilizzando il protocollo Trizol secondo le istruzioni del produttore. Per aumentare la resa di RNA, procedere con la precisione di RNApitation a -80 ° C per 30 minuti oa -20 ° C per una notte. Nota: Poiché la quantità di RNA precipitato dalle frazioni polisomi potrebbe non essere chiaramente visibile si consiglia di aggiungere vettore. Aggiungere 1 ml di vettore al tubo prima della fase di precipitazione RNA durante il protocollo Trizol. </li><li> Determinare quali frazioni corrispondono a mRNA associati a&gt; 3 ribosoma (utilizzando l&#39;approccio descritto 3.6) e piscina per queste frazioni. Utilizzare il kit RNA pulizia per eseguire la pulitura del pool di RNA polisoma associata e citosolica (da 2,6). Inviare i campioni ad un impianto per determinare i livelli di mRNA genome-wide utilizzando microarrays o deep-sequencing. Se la traduzione di specifici mRNA deve essere monitorata mediante RT-qPCR, si consiglia di utilizzare 500 ng di RNA (da frazioni raccolte contenenti&gt; 3 ribosomi o RNA totale) per sintetizzare cDNA. Nota: mRNA associati&gt; 3 ribosomi è impostato arbitrariamente per rappresentare mRNA tradotte in modo efficiente e contenere più del 80% della nuova sintedimensioni polipeptidi 28,29. Compreso frazioni corrispondenti alla luce (1-2), medio (2-3) e polisomi pesanti (&gt; 3) sarebbe vantaggioso, ma questi aumenteranno il numero dei campioni da 2 volte (4 vs 2 per condizioni) e quindi la costo dell&#39;esperimento. Nonostante che si prevede che la diminuzione dei costi di deep-sequenziamento e analisi microarray in futuro, dovrebbe favorire il secondo approccio, è consigliabile che durante la convalida, distribuzione di singoli mRNA è monitorato in ogni frazione. </li></ol> 4. Genoma Analisi di mRNA traduzione <ol><li> Installare R, Bioconductor e il pacchetto anota: <ol><li> Installare R (download da r-project.org) e avviare un R-session. Nota: R è disponibile per tutti i sistemi operativi e anota verrà eseguito su ognuna di esse. </li><li> Installare Bioconductor (bioconductor.org). Codice R è interpretato attraverso il (ad esempio, la console R R-terminal in Windows - che viene lanciato da fareuble clic sul collegamento R). Bioconductor è installato digitando (in R-terminale): fonte (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Installare il pacchetto Bioconductor anota (e il pacchetto qvalue che anota richiede) digitando (nella R-terminale): fonte (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Verificare che il pacchetto è stato installato correttamente e aprire il manuale anota digitando (in R-terminale): biblioteca (&quot;anota&quot;) vignette (&quot;anota&quot;) </li><li> Nota: aiuto supplementare per tutte le funzioni che vengono utilizzate nel pacchetto anota possono essere trovate sia alla pagina web anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) oppure utilizzando la funzione di aiuto all&#39;interno di R. Ad esempio, per ottenere aiuto sulla funzione anotaPerformQc andare al R-terminal e il tipo (si noti che questo funziona solo quando il pacchetto anota è stato caricato): biblioteca (&quot;anota&quot;) # carica il pacchetto anota ? AnotaPerformQc # apre aiuto per questa funzione </li></ol></li><li> Importare dati a R: <ol><li> Preparare dati di espressione per l&#39;analisi. I dati devono essere pre-trattati (cioè normalizzato e controllato) rispetto alla tecnica che è stata utilizzata per misurare i livelli di mRNA. Valori di ingresso devono essere login trasformati, più comune è log2. Compilare una tabella con i dati per tutti i campioni di RNA polisoma associati e una per tutti i campioni di RNA citosolico. La prima colonna deve contenere il gene-identificatori seguite da una colonna di dati per campione; la prima riga dovrebbe includere nomi per i campioni. E &#39;fondamentale che le tabelle sono identiche ordine del campione e l&#39;ordine gene identico. Salvare i file come file di testo delimitato da tabulazioni chiamato &quot;myPolysomeData.txt&quot; e &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> In questo esempio due classi di esempio sono utilizzati (controllo o malato) con 3 repliche per classe, generando 6 campioni con questo ordine: C1, C2, C3, D1, D2, D3 in entrambi i file myCytosolicData.txt e myPolysomeData.txt. Anota richiede almeno 3 repliche per condizione quando ci sono due classi di esempio. Questi dovrebbero essere replicati biologici indipendenti. </li><li> Creare una directory che contiene i file di input dati (myPolysomeData.txt e myCytosolicData.txt). Apri R da questa directory. In Windows / Mac questo può essere fatto copiando un R-scorciatoia in questa directory e il lancio di R utilizzando questa scorciatoia (il lavoro direttamente può anche essere modificata utilizzando i menu a scorrimento). </li><li> Creare un file chiamato myCode.R all&#39;interno della directory appena creata e aprirlo con un programma di editing di testo. Scrivere il codice in questo file. </li><li> Per caricare i dati in R scrivere il codice seguente al file myCode.R (ricordatevi di salvare nuovamente il file dopo ogni aggiunta di codice). Sotto è una s passo-tep spiegazione del codice, ma tutto il codice può essere scritta anche inizialmente e la funzione di sorgente (che esegue il codice, vedi sotto) usato una sola volta: # # Questa carica la libreria anota biblioteca (anota) # # Questo carica i dati di input in R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, settembre = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, settembre = &quot; t&quot;)) </li><li> Eseguire il codice in R digitando direttamente nel terminale R: fonte (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Verificare che i dati sono stati caricati correttamente digitando (in R-terminale): testa (dataCyto) # mostrerà superiore della tabella dataCyto testa (dataPoly) </li></ol></li><li> Identificazione di geni differenzialmente tradotti: <ol><li> Generare un vettore che descrivele categorie di esempio (un vettore è un tipo di oggetto in R). Questo vettore dovrebbe riflettere l&#39;ordine del campione in myPolysomeData.txt e myCytosolicData.txt in modo che tutti e tre gli oggetti hanno un ordine identico dei campioni. Il vettore sarà utilizzato durante le spiegazioni anota su quali campioni da confrontare. Aggiungere il seguente al file myCode.R: # # Si noti che i campioni replicati hanno una classe campione identico # # Descrizioni (es. &quot;C&quot; o &quot;D&quot;), in questo vettore. myPhenotypes &lt;- c (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Effettuare il controllo della qualità del set di dati. Ci sono un certo numero di misure di qualità che devono essere valutate prima anota può essere utilizzato per l&#39;analisi. Questi sono discussi in dettaglio nel manuale anota. Aggiungere questo codice myCode.R file e salvarlo: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (datat = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Eseguire il codice digitando in R-terminale: fonte (&quot;myCode.R&quot;) Questo genererà un numero di file di output, che può essere esaminato come indicato nel manuale anota. </li><li> Identificare i geni differenzialmente tradotte. I campioni saranno confrontati in base all&#39;ordine alfabetico dei nomi forniti al parametro &quot;phenoVec&quot; (cioè il &quot;myPhenotypes&quot; vettoriale) a meno che non siano specificati dall&#39;utente (tramite il parametro &quot;contrasti&quot;). Aggiungere il seguente codice al myCode.R file e la finitura utilizzando il comando &quot;fonte&quot; all&#39;interno del R-terminale come sopra descritto: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (datat = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Utilizzare la guida per anotaGetSigGenes per capire come l&#39;Oscita è formattato e vedere come scegliere le categorie di esempio per confrontare digitando (in R-terminale): ? anotaGetSigGenes </li><li> Filtra e trama geni che sono differenzialmente tradotti. Ci sono diverse soglie che possono essere applicati all&#39;interno della funzione anotaPlotSigGenes e con l&#39;aiuto sarà semplificare una combinazione personalizzata di tali soglie. Per selezionare i geni affidabile analizzati applicare il minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) e slopeP impostazioni (0.01). Nota: Inoltre, le impostazioni applicabili ai RVM 23,26,30 tasso di falsi scoperta (FDR) (0,15) e piega le variazioni (log2 [1.5]), può ad esempio essere utilizzato per identificare geni differenzialmente tradotte. Altri filtri come &quot;selDeltaPT&quot; può essere utile per un filtraggio più rigorosa (ad esempio impostando selDeltaPT a log2 [1.5]). È inoltre necessario specificare che il confronto deve essere filtrata (utilizzando l&#39;argomento selCont). Applicare le impostazioni descritte aggiungendo la seguente riga al myCode.Ril file: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1.5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) </li><li> Effettuare l&#39;analisi utilizzando la funzione di sorgente dal R-terminale come descritto sopra. Ciò anche generare un output grafico. Esaminando questa uscita è un buon punto di partenza per valutare le prestazioni di analisi e di individuare le eventuali modifiche necessarie alle impostazioni. </li><li> Generare una tabella di output. Aggiungere il seguente codice al file myCode.R: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, settembre = &quot; t&quot;) </li><li> Eseguire il codice utilizzando la funzione di origine nel terminale R. Le colonne della tabella risultante sono spiegate nella Guida per la funzione anotaPlotSigGenes. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo articolo descrive un protocollo polisoma frazionamento consolidata seguita da un metodo di analisi sviluppato in-house per la cattura delle modifiche qualitative e quantitative dell&#39;attività traslazionale su scala genoma in cellule di mammifero. Per il completamento di questo protocollo particolare attenzione deve essere rivolta a 1) confluenza delle cellule (come i tassi di proliferazione e disponibilità di nutrienti in correlazione con l&#39;attività di traduzione mRNA e possono influenzare la composizione del translatome, confluenza delle cellule dovrebbe essere coerente tutti replicati e le condizioni sperimentali), 2) lisi cellulare rapida (Nonostante la presenza di cicloesimide e inibitori RNasi nei buffer, lisi dovrebbe essere rapido ed estratti cellulari devono essere sovrapposto gradienti di saccarosio subito dopo lisi per prevenire la degradazione dell&#39;RNA e la dissociazione di polisomi), 3) Preparazione Gradiente (per garantire elevata riproducibilità dei dati, gradienti di saccarosio devono essere preparati utilizzando il creatore del gradiente e speassistenza sociale dovrebbe essere presa quando si maneggiano loro). Oltre a studiare le variazioni dell&#39;attività traduzionale, questo protocollo può essere utilizzata per isolare complessi proteici ribosomi associati e stabilire le loro funzioni fisiologiche. A tal fine, i livelli e stato di fosforilazione di varie proteine ​​ribosoma associate possono essere determinati mediante precipitazione TCA, seguita da Western blotting, mentre complessi proteici ribosoma-associati possono essere immunoprecipitate da frazioni gradiente e analizzati mediante Western blotting o spettrometria di massa. Un inconveniente di questa tecnica è che il metodo frazione curva lenta potrebbe causare dissociazione delle proteine ​​anche strettamente legati cui cinetica di legame sono in rapida associazione / dissociazione. I fattori associati a polipeptidi di nuova sintesi sono esempi tipici. Polipeptidi di nuova sintesi emergenti formano i ribosomi possono essere immobilizzati su complessi proteici associati ribosomi utilizzando chimici reticolanti come 3, 3&#39;-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Questo approccio ha rivelato che il recettore attivato C chinasi 1 (RACK1) / c-Jun chinasi N-terminale (JNK) / eucariotico fattore di traslazione di allungamento 1A2 (eEF1A2) complessa regola la degradazione di polipeptidi di nuova sintesi in risposta allo stress 27. Inoltre, metodologia simile è stato utilizzato in studi che dimostrano che la proteina chinasi C BII (PKCbII) viene reclutato per ribosomi dal RACK1 32 e che l&#39;attivazione del complesso di mTOR 2 (mTORC2) avviene sui ribosomi dove fosforila polipeptidi AKT nuova sintesi e regola il loro stabilità 33,34. Le principali limitazioni del metodo polisoma frazionamento seguita da analisi anota sono: 1) necessità di un numero relativamente elevato di cellule (~ 15 x 10 6 cellule), 2) mancanza di informazione posizionale relativa localizzazione di ribosoma su una data molecola di mRNA, e 3 ) questioni relative alla etero cellulare e molecolaregeneità di tessuti normali e tumorali. Questioni relative al numero di cellule necessarie possono essere risolti allineando i picchi spettri di assorbanza corrispondenti a monosomes (80S) di celle di cui importi sono limitando con quelli ottenuti da cellule di alta abbondanza (ad esempio cellule HeLa) 35. Ribosoma tecnica profiling (vedi sotto) può essere utilizzato per determinare la posizione esatta del ribosoma su una data molecola di mRNA, mentre problematiche legate a effetti confondenti di eterogeneità tessuto sull&#39;interpretazione di cambiamenti nell&#39;espressione genica ottenuti con sistemi complessi come tessuti umani sono discussi in dettaglio in una pubblicazione di porri e Storey 36. Recentemente, un romanzo ribosoma tecnica di profilatura è stata sviluppata, in cui ribosoma protetta frammenti (RPF) sono generati dal trattamento RNAsi I e analizzati mediante sequenziamento profondo 22. Questa tecnica permette di determinare la posizione ribosomiale a un singolo nucleotide risoluzione, fornendo così finora UNPRapprofondimenti ecedented in biologia ribosoma. Ad esempio, profilatura ribosoma può essere utilizzato per la determinazione della densità ribosoma su una data molecola di mRNA o l&#39;identificazione degli elementi che influenza i tassi di inizio della traduzione, quali i siti di inizio alternativi, iniziazione codoni non-ago ed elementi regolatori quali uORFs. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni metodologiche che limitano la possibilità di definire un profilo ribosoma stimare con precisione l&#39;efficienza della traduzione dell&#39;mRNA. Questi includono pregiudizi indipendenti introdotte dalla frammentazione casuale e I RNasi digestione, distorsioni introdotte dagli inibitori traduttore (es. allungamento inibitori tipo emetine e cicloeximide possono indurre accumulo ribosomiale a siti di inizio di traduzione), un gran numero di risultati falsi positivi e falsi negativi associati con i punteggi TE così come la loro inesattezza nel predire la legge che provengono da proteine ​​mRNA codificanti 37. Forse ancora più importante, considerando cheprofiling ribosoma consente l&#39;identificazione diretta della posizione del ribosoma su una data molecola di mRNA, il numero di ribosomi che è associato con un dato mRNA è indirettamente stimata normalizzando frequenze di legge in RPF (mRNA ribosoma-associato) rispetto a quelli osservati in mRNA casualmente frammentati (totale mRNA). Per esempio, in un ambiente semplice dove quattro molecole di mRNA &quot;B&quot; (Ba, Bb, Bc e BD) sono occupati da quattro ribosomi nelle posizioni 1, 2, 3 e 4, un difetto intrinseco della tecnica profilatura ribosoma non permetterà una distinzione tra uno scenario in cui tutti e 4 i ribosomi associano solo con un Ba mRNA nelle posizioni 1, 2, 3, e 4 e uno scenario in cui Ba, Bb, Bc e Bd mRNA sono ciascuno occupati da un singolo ribosoma nella posizione 1, 2 , 3, e 4, rispettivamente. Al contrario, durante polisoma frazionamento, polisoma integrità è conservato, consentendo in tal modo l&#39;isolamento del pool di mRNA associati a un numero definito di ribosomi (Figura 1). Questo importdistinzione tra formica polisoma frazionamento e profiling ribosoma suggerisce che mentre il primo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente mRNA in mRNP, leggeri e pesanti polisoma frazioni, quest&#39;ultimo metodo probabilmente riuscirà a cogliere i cambiamenti nel translatome che sono causati da mRNA che la transizione da luce di polisomi pesanti, mentre sopravvalutare il contributo di coloro che spostano dalla frazione mRNP di polisomi pesanti. Il significato biologico di queste differenze tra i metodi di cui sopra è sottolineata da una grande quantità di dati che mostrano che l&#39;attivazione traduzionale di un sottoinsieme di mRNA come quelli che sono eIF4E-sensibili, passaggio dalla luce polisomi pesanti, mentre altri, come quelli ospitare elementi 5&#39;TOP, vengono reclutati per polisomi pesanti direttamente dal pool di libero-ribosoma mRNA 6. È interessante notare che il percorso mTOR ha dimostrato di modulare concomitanza definizione di &quot;eIF4E sensibili&quot; e 5&#39;TOP mRNA 11. Pertanto, le differenze metodologiche che vengono discussi sopra possono spiegare l&#39;apparente discordanza della conclusione tra gli studi che utilizzano ribosoma profilazione 38,39 e polisoma frazionamento 24, per valutare gli effetti di inibizione mTOR sulla translatome. In conclusione, polisoma frazionamento e profilatura ribosoma sono metodi complementari che forniscono principalmente informazioni riguardanti il ​​numero di ribosomi associati mRNA e la posizione del ribosoma su mRNA, rispettivamente. È importante sottolineare che, nonostante le carenze ei vantaggi di questi metodi, rimane essenziale che i dati a livello di genoma ottenuti per entrambe le procedure sono adeguatamente analizzati e funzionalmente e biochimicamente convalidati.

Le reti di regolazione che controllano l&#39;espressione genica sono stati ampiamente studiati negli ultimi due decenni. La stragrande maggioranza di questi sforzi di ricerca focalizzati su regolazione trascrizionale, per cui i cambiamenti nei livelli di mRNA steady-state su scala genome-wide sono stati usati per determinare i cosiddetti &quot;profili di espressione genica&quot;. Recenti studi rivelano che i livelli di mRNA di stato stazionario solo vagamente corrispondono alla composizione del proteoma 1,2, indicando così che i meccanismi post-trascrizionali, compresa la traduzione dell&#39;mRNA, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell&#39;espressione genica 3,4. Infatti, è stato stimato che circa il 50% dei livelli di proteine ​​è determinato a livello di traduzione dell&#39;mRNA in immortalizzate fibroblasti di topo 5. Traduzione mRNA è un processo altamente regolato durante il quale mRNA vengono tradotti in proteine ​​con un&#39;azione orchestrata dei ribosomi, RNA transfer (tRNA) e fattori accessori commonly indicato come fattori di traduzione (TFS) 6. La sintesi proteica è la più processo di consumo di energia nelle cellule di mammifero 7 e quindi tariffe di traduzione mRNA globali sono adeguati per accogliere la disponibilità di nutrienti e tassi di proliferazione delle cellule 8. Oltre ad alterazioni dei tassi globali di traduzione mRNA, vari stimoli extracellulari (ad esempio ormoni e fattori di crescita), segnali intracellulari (ad esempio, i livelli di aminoacidi) e diversi tipi di stress (ad esempio ER-stress) indurre modifiche selettive nelle piscine di mRNA che sono corso di traduzione (translatome) 6. A seconda del tipo di stimolo, attività definizione di alcuni, ma non tutti gli mRNA sono notevolmente influenzate, ottenendo in tal modo variazioni del proteoma necessari per montare una risposta cellulare rapida 6. Questi cambiamenti qualitativi e quantitativi nella translatome sono pensati per essere mediata dalla interazione tra fattori trans-acting (es. </em&gt; componenti di macchine di traduzione, i fattori ausiliari o miRNA) e cis-elementi (elementi di RNA o funzioni) presenti in sottogruppi selezionati di mRNA 6,9. Ad esempio, i cambiamenti nei livelli e / o attività di rate-limiting inizio della traduzione fattori eIF4E e eIF2 selettivamente modulano la traduzione di trascrizioni in base alle caratteristiche specifiche 5&#39;UTR 6. eIF4E e eIF2 sono necessari per l&#39;assunzione di mRNA e tRNA iniziatore al ribosoma, rispettivamente, 6. Un aumento dell&#39;attività eIF4E rafforza selettivamente traduzione di mRNA ospitano 5&#39;UTRs lunghe e altamente strutturate, comprese quelle proliferazione codifica e la sopravvivenza stimolante proteine, tra cui cicline, c-myc e Bcl-xL 10. A sua volta, l&#39;inattivazione di eIF2 porta ad una proteina sintesi arresto globale, mentre selettivamente regolando traduzione di mRNA contenenti brevi inibitori monte open reading frames (uORFs) nelle loro 5&#39;UTRs, come quelli che codificano maestro tregolatori ranscriptional della risposta spiegata della proteina (ad es ATF4). In risposta a vari stimoli, tra cui nutrienti, fattori di crescita e ormoni, l&#39;obiettivo meccanicistico / mammifero della rapamicina (mTOR) percorso stimola l&#39;attività eIF4E inattivando la proteina 4E-binding (4E-BP) famiglia di soppressori di traduzione, mentre la via MAPK fosforila direttamente eIF4E 6,11. A sua volta, chinasi eIF2α (cioè Perk, PKR, HRI e GCN2) inibiscono eIF2 fosforilando sua subunità regolatoria eIF2α in risposta alla privazione di nutrienti, ER-stress e infezione da virus 6,12. Alterazioni dell&#39;attività e / o espressione di TF, altri componenti del macchinario traduzionale e fattori regolatori compresi miRNAs sono stati osservati in diversi stati patologici tra cui il cancro, sindrome metabolica, disturbi neurologici e psichiatrici e malattie renali e cardiovascolari 13-19. Collettivamente, questi dati indicano che me traslazionalechanisms giocano un ruolo centrale nel mantenimento della omeostasi cellulare e che la loro abrogazione gioca un ruolo centrale nell&#39;eziologia di varie malattie umane. Qui, un protocollo per frazionamento di polisomi da saccarosio gradiente di densità centrifugazione in cellule di mammifero, che viene utilizzato per separare polisomi da monosomes, subunità ribosomiale e particelle messaggero ribonucleoproteiche (mRNPs) è descritto. Ciò consente discriminazioni tra tradotto in modo efficiente (associata con polisomi pesanti) da mal tradotte (associata a polisomi leggeri) mRNA. In questo saggio, ribosomi sono immobilizzati sul mRNA utilizzando inibitori traduzione allungamento come cycloheximide 20 e estratti citosolici sono separati sul 5-50% di saccarosio lineare gradienti di densità mediante ultracentrifugazione. Frazionamento posteriori dei gradienti di saccarosio permette l&#39;isolamento di mRNA in base al numero di ribosomi si legano a. RNA estratto da ogni frazione può essere quindi utilizzato per determinarecambiamenti nelle distribuzioni di mRNA in tutto il gradiente tra condizioni diverse, per cui l&#39;aumento dell&#39;efficienza traduzionali dalla parte superiore alla parte inferiore del gradiente. Northern Blotting o trascrizione inversa della polimerasi quantitativa reazione a catena (qRT-PCR) vengono utilizzati per determinare i livelli di mRNA in ogni frazione. In alternativa, frazioni contenenti polisomi pesanti (tipicamente più di 3 ribosomi) sono raggruppati e livelli di mRNA polisoma associati genome-wide sono determinati utilizzando microarray o deep-sequencing. E &#39;della massima importanza sottolineare che i livelli di mRNA polisoma associati sono, oltre alla traduzione, colpiti da meccanismi trascrizionali e post-trascrizionali che influenzano i livelli di mRNA citosolici 21. Pertanto, per determinare le differenze nella traduzione, utilizzando i dati a livello di genoma da mRNA polisoma associata è necessario correggere gli effetti dai passi nell&#39;espressione via gene che sono a monte di traduzionizione 21. Per consentire tale correzione, RNA citosolico viene preparato in parallelo con polisoma associata RNA da ogni campione e dei livelli di mRNA steady-state genome-wide sono determinati 21. Attualmente, la cosiddetta &quot;traduzione-efficienza&quot; (TE) punteggi (cioè il log-rapporto tra i dati di mRNA polisoma associati e dati di mRNA citosolici) sono spesso impiegati per correggere gli effetti dei cambiamenti nei livelli di mRNA citosolici sull&#39;efficienza definizione di un dato mRNA 22. Tuttavia, utilizzando i punteggi TE per identificare traduzione differenziale è associata a un numero considerevole di falsi risultati positivi e falsi negativi a causa di una proprietà matematica dei punteggi TE comunemente indicato come correlazione spuria 27. Infatti un sondaggio di insiemi di dati provenienti da più laboratori indicato che tali correlazioni spurie sembrano essere inevitabili quando si analizzano i cambiamenti nei translatomes 23. Ciò ha indotto lo sviluppo della &quot;analisi di tr differenziale<html> anslation &quot;(anota) algoritmo, che non soffre delle carenze di cui sopra 23. Durante anota-analisi di un modello di regressione viene utilizzata per ricavare le misure di attività traslazionale indipendenti dei livelli di RNA citosolici. Tali misure sono poi confrontati tra le condizioni e le statistiche viene calcolato. L&#39;utente ha la possibilità di applicare un metodo restringimento varianza, che migliora potenza statistica e riduce la comparsa di risultati falsi positivi in studi con poche ripetizioni 24. Significativamente, è stato recentemente dimostrato che perturbazioni nella translatome catturati da anota, ma i punteggi non TE, correla con variazioni del proteoma 25. Pertanto, si raccomanda vivamente di applicare l&#39;analisi anota per l&#39;identificazione delle variazioni di traduzione su scala genome-wide. Mentre i fondamenti teorici dell&#39;algoritmo anota sono state discusse in dettaglio in precedenza 21,23,26, qui focus è su come applicare in pratica. ve_content &quot;&gt; Oltre a studiare i cambiamenti nell&#39;attività traduzione dell&#39;mRNA nella cella, questo protocollo frazionamento ribosoma può essere utilizzata per isolare e caratterizzare biochimicamente e funzionalmente ribosomi e complessi proteici polisoma-associata. Questo approccio è stato impiegato con successo in passato per identificare complessi che regolano la stabilità dei polipeptidi di nuova sintesi 27 e / o sono coinvolti nella fosforilazione di componenti del macchinario traduzionale. L&#39;applicazione del metodo polisoma frazionamento saranno discussi brevemente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

traduzione dell&#39;mRNA gioca un ruolo centrale nella regolazione dell&#39;espressione genica e rappresenta il processo che richiede più energia nelle cellule di mammifero. Pertanto, disregolazione della traduzione dell&#39;mRNA è considerato a svolgere un ruolo importante in una varietà di stati patologici tra cui il cancro. I ribosomi ospitano anche accompagnatori, che facilitano la piegatura di polipeptidi nascenti, la funzione e la stabilità dei polipeptidi di nuova sintesi modulando in tal modo. Inoltre, dati emersi indicano che i ribosomi servono come piattaforma per un repertorio di molecole di segnalazione, che sono implicati in una varietà di modificazioni post-traduzionali di polipeptidi di nuova sintesi che emergono dal ribosoma, e / o componenti di macchine traslazionale. Qui, un metodo consolidato di frazionamento ribosoma con densità di saccarosio centrifugazione in gradiente è descritto. In concomitanza con l&#39;algoritmo sviluppato in-house &quot;anota&quot; questo metodo consente la determinazione diretta di differentitraduzione renziale dei singoli mRNA su scala genoma. Inoltre, questo protocollo versatile può essere utilizzato per una varietà di studi biochimici volti a sezionare la funzione di complessi proteici ribosoma-associata, compresi quelli che svolgono un ruolo centrale nella piegatura e degradazione di polipeptidi di nuova sintesi.

mTOR è un importante nodo della rete cellulare che coordina i tassi globali di sintesi della proteina con la disponibilità di nutrienti 19. Traduzione mRNA è regolata principalmente al iniziazione fattore limitante 6. La percentuale di ribosomi impegnati in polisomi correla positivamente con i tassi di inizio della traduzione 28. Un esempio di applicazione del metodo polisoma frazionamento per studiare il ruolo della segnalazione mTOR nella mediazione degli effetti dell&#39;insulina sulla traduzione dell&#39;mRNA è presentato. A questo scopo, cellule di carcinoma mammario MCF7 umane sono state mantenute in basso siero e quindi stimolate con solo o in combinazione con l&#39;inibitore mTOR sito attivo Torin1 insulina. Cellule non stimolate che sono stati tenuti in maniera continua in basso siero, servito come controllo. mRNPs, monosome (80S) e le frazioni polisoma sono stati separati utilizzando il metodo polisoma frazionamento. Rispetto alle cellule di controllo, insulina indotto un aumento di assorbanza in frazioni gradiente corrispondentia polisomi, accompagnata da una concomitante diminuzione di assorbanza nella frazione monosome (Figura 1). Questi risultati indicano che la percentuale di ribosomi impegnati in polisomi è aumentata in insulina trattati rispetto alle cellule di controllo, indicando quindi che, come previsto, l&#39;insulina stimola tempi di inizio della traduzione globali. Torin1 invertito gli effetti dell&#39;insulina sui profili di assorbanza (Figura 1), avvalorando così i risultati che la segnalazione mTOR svolge un ruolo importante nella mediazione degli effetti dell&#39;insulina sulle macchine traduzione 19. Sulla base di un principio che le incongruenze in preparazione pendenza non può essere evitato, questioni sono state sollevate quanto concerne la riproducibilità dei dati ottenuti con il metodo polisoma frazionamento 22. Per testare empiricamente questo problema potenzialmente deleterio, citosolica e pesante RNA polisoma-associata (mRNA associati con 4 e più ribosomi) sono stati isolati<html> da cellule MCF7 trattati solo con insulina o insulina in combinazione con Torin1 da 4 repliche biologiche indipendenti (Figura 2). Gli effetti di insulina e Torin1 sulla composizione del citosolica e pesante mRNA polisoma associati in ogni replica è stata determinata su scala genoma utilizzando un approccio microarray. Per determinare la riproducibilità del metodo polisoma frazionamento è stato applicato l&#39;analisi delle componenti principali (PCA). Tale analisi ha mostrato che i campioni appartenenti a ciascuna condizione sono stati ben posizionati entro i primi due componenti mentre le diverse condizioni erano ben separati (Figura 2). Questi risultati dimostrano che il metodo polisoma frazionamento come descritto qui è altamente riproducibile e pertanto opportuno studiare i cambiamenti quantitativi e qualitativi in ​​traduzione a livello genoma. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Profili polisomi che mostrano gli effetti della deprivazione di siero, insulina e mTOR segnalazione sulla traduzione globale MCF7. MCF7 cellule sono state private di nutrienti (mantenuti nello 0,1% FBS) per 16 ore e trattati con insulina 5 nM (Ins) da solo o in combinazione con 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) per 4 ore. Cellule non trattate che sono state continuamente privi di nutrienti (0,1% FBS) sono stati usati come controllo. I corrispondenti sono stati estratti citosolici sedimentate mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio 5-50%. Sono indicati subunità ribosomiale gratuite (40S e 60S), monosomes (80S) e il numero di ribosomi nelle frazioni polisoma. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figura 2. Dati genome-wide ottenuti con polysome profiling è altamente riproducibile. MCF7 cellule sono state trattate come in Figura 1. citosolico e polisoma associate RNA (&gt; 3 ribosomi) è stato estratto da 4 repliche biologiche indipendenti e dei loro livelli di mRNA genome-wide sono stati determinati utilizzando matrici GeneTitan (Affymetrix). PCA è stato utilizzato per valutare la riproducibilità dei dati risultanti. Vengono mostrati i primi due componenti PCA per tutti i trattamenti (T1 = Torin 1; ctrl = controllo; Ins = insulina), l&#39;origine di RNA (C = citosolica; P = polisoma associate) e replica. I campioni della stessa condizione e origine RNA sono strettamente posizionati indicando elevata riproducibilità.

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l&#39;analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

68.2K Views.  McGill University.  Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione. 

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In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Ricerca

Biologia

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...