نشكر جيمس بيرنا لتوضيح الرسم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية لYZ

يحتاج الى موافقة التي يمكن الحصول عليها من المؤسسات المنزل قبل بدء الجراحة ودراسة التصوير. وأجريت التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. 1. جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل مع 70٪ كحول جيدا قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن KX حل مخدر (200 ملغ / كغ الكيتامين و 20 مغ / كغ زيلازين) وفقا لوزن الجسم الماوس، ملاحظة: KX الجرعة يمكن تعديلها وفقا للسلالة، والعمر، والحالة الصحية من الفئران. ويوصى أيضا التشاور البيطرية لتحديد الجرعة المثالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء اختبار قرصة أخمص القدمين بشكل دوري عن طريق الضغط على أصابع القدم الماوس، والتحقق من وجود استجابة انعكاسية لمراقبة حالة التخدير.تأكد من أن الفأر هو تخدير كامل قبل البدء في الجراحة ملاحظة: خلال جلسات التصوير لفترات طويلة، تحقق من حالة التخدير الماوس، بشكل دوري وإداراتها إضافية KX إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس من الفأرة باستخدام شفرة حلاقة لفضح فروة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم منطقة حلق بواسطة المسح الجلد بالتناوب مع منصات الكحول وبتدين. إزالة أي قصاصات الشعر المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم العين بلطف لتليين كلتا العينين، وبالتالي منع الأضرار الناجمة عن الجفاف دائمة أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق مستقيم على طول خط الوسط من فروة الرأس، ونقل الجلد أفقيا نحو حواف الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسيج الضام تعلق على الجمجمة. </li></ol> 2. ضعفت الجمجمة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة على أساس التصوير ستير. الإحداثيات eotaxic ملاحظة: في محاولة لتجنب الأوعية الدموية الكبيرة، والتي تغلغل ضوء كتلة وطمس الهياكل تصويرها. ويلاحظ الأوعية الدموية أفضل عند الجمجمة رطبة مع ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر الصغيرة عالية السرعة إلى منطقة دائرية رقيقة من الجمجمة (0.5-1.0 ملم القطر). نقل موازية الحفر إلى السطح الجمجمة، بدلا من عقد ضد الجمجمة والضغط على أسفل. الحفر حتى كل من طبقة العظم المضغوط الخارجي وطبقة العظم الإسفنجي منتصف تتم إزالة ملاحظة: لمنع الأضرار الناجمة عن ارتفاع درجة الحرارة، وتجنب الاتصال المطول بين مثقاب والجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل ترقق الطبقة الداخلية العظام التعاقد مع شفرة المجهرية في وسط منطقة الحفر ضعيفة. عقد شفرة المجهرية في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى كشط الجمجمة دون الضغط انخفض مقابل الجمجمة حتى يتم ضعفت بالتساوي منطقة صغيرة (200-300 ميكرون قطر) مع سمك تقريبييتم الحصول لاي 20-30 ميكرومتر. نظرا لصناعة السيارات في مضان من الجمجمة، ويمكن قياس سماكة عن طريق مسح المسافة بين السطح العلوي والسفلي من الجمجمة تحت المجهر ثنائي الفوتون ملاحظة: على الرغم من أن سمك الجمجمة أقل من 20 ميكرون يوفر جودة تصوير جيدة، لا ينصح به لأنه يجعل عملية ترقق في جلسات لاحقة إعادة التصوير صعبا. لتجنب الإفراط رقيق، سمك الجمجمة يحتاج إلى أن يتم التحقق بشكل دوري أثناء الجراحة (انظر مناقشة). </li></ol> 3. تجميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الحطام العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على كل حافة من افتتاح مركز لوحة الرأس العقيمة، والتي تم تعقيمها (انظر الشكل 1). عقد لوحة الرأس بإحكام ضد الجمجمة مع المنطقة ضعيفة تقع في وسط افتتاح ملاحظة: إذا كان الغراء يلوث ص ضعيفةegion عن طريق الصدفة، إزالته بعناية مع شفرة المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برفق الجلد من الجانبين من الجمجمة إلى حواف افتتاح مركز لوحة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حوالي 10 دقيقة حتى يتم إرفاق لوحة رأس البئر في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الرأس على اثنين من كتل الجانبية من لوحة بعقد ثم تضييق الخناق على حواف لوحة الرأس لشل حركة الماوس على لوحة عقد (انظر الشكل 1) ملاحظة: تأكد من عدم وجود الجلد أو شعيرات بين لوحة الرأس والكتل قبل تشديد الخناق. A إعداد يجمد جيدة ينبغي أن لا تظهر أي حركة ملحوظة من الجمجمة تحت المجهر تشريح عند الجزء الخلفي من الحيوان يربت بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . شطف الجمجمة يتعرض بمحلول ملحي لإزالة الغراء unpolymerized ملاحظة: من المهم لإزالة أي الغراء المتبقية، والغراء unpolymerized يطمس الصور والأضرار المجهر أهداف &lt;./ لى&gt; </ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من الأوعية الدموية من الجمجمة يتعرض مع المنطقة ضعفت كما خريطة 1، والذي يستخدم لنقل المنطقة المصورة في جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس تحت المجهر التصوير. تحديد المنطقة ضعيفة تحت الهدف 10X الهواء باستخدام epifluorescence ونقل أنحف المنطقة إلى مركز العرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من المياه المالحة في الجزء العلوي من الجمجمة والتحول إلى الهدف 60X، والتي تم تشطف بالماء المعقم. تحديد المنطقة التي تصور العمود الفقري شجيري الفردية بوضوح على طول التشعبات. تحديد وتسمية المنطقة المقابلة على خريطة 1 من خلال مقارنة بين الأوعية الدموية وجهة نظر المجهر epifluorescent والصورة الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الطول الموجي ليزر ثنائي الفوتون وفقا لfluorophores. على سبيل المثال، 920 نانومتر لYFP؛ 890 نانومتر لGFP؛ 1،000 نانومتر لDsRed وtdTomato 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة أكوام مع 2الخطوات ميكرومتر على طول ض محور باستخدام الهدف 60X. هذه الصورة كومة يغطي × 200 ميكرون المنطقة حوالي 200 ميكرون (512 X 512 بيكسل) ويتم استخدام خريطة 2 لنقل خلال جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تسعة مداخن صورة داخل الخريطة 2 باستخدام تقريب رقمي 3X. كل صورة كومة يغطي مساحة تقارب 70 ميكرومتر × 70 ميكرون (512 X 512 بكسل)، مع 0.7 ميكرومتر الخطوات على طول ض محور ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الليزر أقل من 40 ميغاواط عند قياسها على عينات لتقليل الضيائية. </li></ol> 5. استعادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير، وفصل بلطف لوحة الرأس من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تنظيف الجمجمة والجلد لإزالة كافة الغراء المتبقية ملاحظة: إن أي الغراء المتبقي على الجلد يسبب تهيج وتبطئ الشفاء الجلد في حين أن أي الغراء المتبقية على الجمجمة ويسبب تآكل الجمجمة وngiogenesis في طبقة العظام نمت حديثا، مما يجعل نقل اللاحقة وإعادة التصوير صعبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجمجمة والجلد بمحلول ملحي عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة فروة الرأس مع خياطة جراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة في قفص منفصل. إدارة مسكن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. عودة الحيوان إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام. مراقبة الحيوانات عن كثب (فحص مرة واحدة يوميا على الأقل) حتى تشفى شق ويتم إزالة الغرز. إدارة الحقن اللاحقة من البوبرينورفين مسكن إذا لزم الأمر. </li></ol> 6. Reimaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،1-1،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع المنطقة تصويرها سابقا بمقارنة نمط الأوعية الدموية لخريطة 1 ونمط فرع شجيري إلى خريطة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تنفيذ reimaging في حدود 1 في الاسبوع، كرر الخطوة 2.3 لإزالة طبقة رقيقة من العظام نمت حديثا على رأس إعادة ضعيفةجيون باستخدام شفرة المجهرية. إذا تم تنفيذ reimaging بعد أكثر من 1 أسبوع، كرر الخطوات على حد سواء 2.2 و 2.3 ملاحظة: تتكون طبقة العظام نمت حديثا هيكل أقل مكثف مقارنة مع طبقة العظم المضغوط الأصلي، مما يؤدي إلى انخفاض جودة الصورة. لذا، للحصول على نفس النوعية، فمن الضروري رقيقة الجمجمة أكثر قليلا من الدورة السابقة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف والتوجه للحصول على أكوام الصورة التي تطابق المتخذة سابقا مداخن صورة تحت المجهر ثنائي الفوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور كما في الخطوة 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،1-5،5 بعد التصوير. </li></ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li><li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+plasticity+in+the+motor+cortex.">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li><li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+plasticity:+looking+beyond+development.">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li><li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+and+long-term+plasticity.">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li><li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging.">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li><li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo.">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li><li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis.">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li><li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices.">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li><li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization.">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li><li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation.">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window.">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li><li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

للحصول على نجاح إعداد ضعفت الجمجمة، عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة. 1) سمك الجمجمة. عظم الجمجمة لديها بنية ساندويتش، مع اثنين من طبقات من العظم المضغوط عالي الكثافة وطبقة وسطى من الاسعار المنخفضة للكثافة العظام الاسفنجية. في حين أن الحفر الصغيرة عالية السرعة مناسب...

تشارك القشرة الثدييات في العديد من وظائف الدماغ، من الحسي الإدراك والحركة التحكم لمعالجة المعلومات المجردة والإدراك. وظائف القشرية المختلفة بناء على الدوائر العصبية المختلفة، والتي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التواصل وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وباستمرار يتم تعديل هيكل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي ردا على الخبرات والأمراض. في الدماغ ناضجة، اللدونة متشابك يأخذ شكل كلا من التغيرات قوة وبالإضافة إلى ذلك / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، ولعب أدوارا مهمة في تشكيل والحفاظ على الدوائر العصبية الوظيفية. العمود الفقري شجيري هي المكونات بعد المشبكي الأغلبية من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ مثير الثدييات. ويعتقد أن دوران مستمر وتغيرات شكلية في العمود الفقري لتكون بمثابة مؤشر جيد من التعديلات في الاتصالات متشابك 1-7. ثنائي الفوتون المسح الضوئي ليزر الصغيرةيقدم SCOPY الاختراق العميق في السراء، والأعمال التحضيرية مبهمة والضيائية منخفضة، مما يجعلها مناسبة للتصوير الحية في الدماغ سليمة 8. في تركيبة مع وضع العلامات الفلورسنت، ويوفر اثنين من الفوتون التصوير أداة قوية لنظرة خاطفة إلى الدماغ يعيشون واتبع إعادة التنظيم الهيكلي في نقاط الاشتباك العصبي الفردية مع مكانية عالية والقرار الزماني. وقد استخدمت أساليب مختلفة لإعداد الفئران لتصوير حي 9-13. هنا، نحن تصف إعداد ضعفت الجمجمة من الجسم الحي في اثنين من الفوتون التصوير للتحقيق في اللدونة الهيكلية في العمود الفقري شجيري بعد المشبكي في القشرة الماوس. باستخدام هذا النهج، وقد صورت دراساتنا الأخيرة صورة ديناميكية التغيرات العمود الفقري شجيري ردا على تعلم المهارات الحركية مع زيادة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا مع fluorescently المسمى فرعية العصبية والتطور السريع للتقنيات وضع العلامات في الجسم الحي، وإجراءات مماثلة وصفها هنا يمكن أن تطبق أيضا لinvestigaالشركة المصرية للاتصالات أنواع أخرى الخلية والمناطق القشرية، جنبا إلى جنب مع معالجات أخرى، فضلا عن استخدامها في نماذج المرض 16-23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1253">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ketamine</td>
			<td style="width:181px;">Bioniche Pharma</td>
			<td style="width:108px;">67457-034-10</td>
			<td style="width:775px;">Mixed with xylazine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Xylazine</td>
			<td style="width:181px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:108px;">139-236</td>
			<td>Mixed with ketamine for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Saline</td>
			<td style="width:181px;">Hospira</td>
			<td style="width:108px;">0409-7983-09</td>
			<td>0.9% NaCl for injection and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Razor blades</td>
			<td style="width:181px;">Electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:108px;">72000</td>
			<td>Double-edge stainless steel razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Alcohol pads</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">06-669-62</td>
			<td>Sterile alcohol prep pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:181px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:108px;">102-9470</td>
			<td>Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">High-speed micro drill</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">18000-17</td>
			<td>The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Micro drill steel burrs</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:108px;">19007-14</td>
			<td>1.4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Microsurgical blade</td>
			<td style="width:181px;">Surgistar</td>
			<td style="width:108px;">6961</td>
			<td>The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">NC9062131</td>
			<td>Fix the head plate onto the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Suture</td>
			<td style="width:181px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:108px;">510461</td>
			<td>Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">CCD camera</td>
			<td>Infinity</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Two-photon microscope</td>
			<td style="width:181px;">Prairie Technologies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:775px;">Ultima IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">10X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 0.30, air</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">60X objective</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>NA 1.1, IR permeable, water immersion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Ti-sapphire laser</td>
			<td style="width:181px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td>Mai Tai HP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex using a thinned-skull preparation

في القشرة الثدييات، الخلايا العصبية تشكيل شبكات معقدة للغاية، وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي. التغيرات في قوة متشابك، فضلا عن إضافة / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، تحدث بطريقة تعتمد على الخبرة، وتوفير الأساس الهيكلي للاللدونة العصبية. كمكونات بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي معظم مثير في القشرة، وتعتبر العمود الفقري شجيري أن يكون وكيل جيدة من نقاط الاشتباك العصبي. الاستفادة من مزايا وتقنيات الوراثة الماوس وضع العلامات الفلورسنت، والخلايا العصبية الفردية وهياكلها متشابك يمكن أن توصف في الدماغ سليمة. ونحن هنا نقدم بروتوكول التصوير عبر الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمتابعة fluorescently المسمى العمود الفقري شجيري بعد المشبكي على مر الزمن في الجسم الحي. هذا البروتوكول يستخدم إعداد ضعفت الجمجمة، والتي تحافظ على الجمجمة سليمة ويتجنب الآثار الناجمة عن التعرض للالتهابات السحايا والقشرة. لذلك، يمكن الحصول على الصور مباشرة بعد سويتم تنفيذ rgery. لا يمكن أن يؤديها إجراء التجارب بشكل متكرر على مدى فترات زمنية مختلفة تتراوح من ساعات إلى سنوات. يمكن أيضا استخدام هذا المستحضر يتم توسيع التحقيق في مختلف المناطق القشرية وطبقات، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

في YFP-H خط الفئران 25، بروتين فلوري الصفراء يعبر في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الهرمية طبقة V، التي توقع لها قمية التشعبات إلى طبقات سطحية في القشرة. من خلال إعداد ضعفت الجمجمة، وقطاعات شجيري fluorescently المسمى ولا يمكن تصوير تحت المجهر متكررة اثنين من الفوتون عل...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

17.8K Views.  University of California, Santa Cruz. Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Video: Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...