نشكر جيمس بيرنا لتوضيح الرسم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية لYZ

يحتاج الى موافقة التي يمكن الحصول عليها من المؤسسات المنزل قبل بدء الجراحة ودراسة التصوير. وأجريت التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. 1. جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل مع 70٪ كحول جيدا قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن KX حل مخدر (200 ملغ / كغ الكيتامين و 20 مغ / كغ زيلازين) وفقا لوزن الجسم الماوس، ملاحظة: KX الجرعة يمكن تعديلها وفقا للسلالة، والعمر، والحالة الصحية من الفئران. ويوصى أيضا التشاور البيطرية لتحديد الجرعة المثالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء اختبار قرصة أخمص القدمين بشكل دوري عن طريق الضغط على أصابع القدم الماوس، والتحقق من وجود استجابة انعكاسية لمراقبة حالة التخدير.تأكد من أن الفأر هو تخدير كامل قبل البدء في الجراحة ملاحظة: خلال جلسات التصوير لفترات طويلة، تحقق من حالة التخدير الماوس، بشكل دوري وإداراتها إضافية KX إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس من الفأرة باستخدام شفرة حلاقة لفضح فروة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم منطقة حلق بواسطة المسح الجلد بالتناوب مع منصات الكحول وبتدين. إزالة أي قصاصات الشعر المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم العين بلطف لتليين كلتا العينين، وبالتالي منع الأضرار الناجمة عن الجفاف دائمة أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق مستقيم على طول خط الوسط من فروة الرأس، ونقل الجلد أفقيا نحو حواف الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسيج الضام تعلق على الجمجمة. </li></ol> 2. ضعفت الجمجمة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة على أساس التصوير ستير. الإحداثيات eotaxic ملاحظة: في محاولة لتجنب الأوعية الدموية الكبيرة، والتي تغلغل ضوء كتلة وطمس الهياكل تصويرها. ويلاحظ الأوعية الدموية أفضل عند الجمجمة رطبة مع ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر الصغيرة عالية السرعة إلى منطقة دائرية رقيقة من الجمجمة (0.5-1.0 ملم القطر). نقل موازية الحفر إلى السطح الجمجمة، بدلا من عقد ضد الجمجمة والضغط على أسفل. الحفر حتى كل من طبقة العظم المضغوط الخارجي وطبقة العظم الإسفنجي منتصف تتم إزالة ملاحظة: لمنع الأضرار الناجمة عن ارتفاع درجة الحرارة، وتجنب الاتصال المطول بين مثقاب والجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل ترقق الطبقة الداخلية العظام التعاقد مع شفرة المجهرية في وسط منطقة الحفر ضعيفة. عقد شفرة المجهرية في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى كشط الجمجمة دون الضغط انخفض مقابل الجمجمة حتى يتم ضعفت بالتساوي منطقة صغيرة (200-300 ميكرون قطر) مع سمك تقريبييتم الحصول لاي 20-30 ميكرومتر. نظرا لصناعة السيارات في مضان من الجمجمة، ويمكن قياس سماكة عن طريق مسح المسافة بين السطح العلوي والسفلي من الجمجمة تحت المجهر ثنائي الفوتون ملاحظة: على الرغم من أن سمك الجمجمة أقل من 20 ميكرون يوفر جودة تصوير جيدة، لا ينصح به لأنه يجعل عملية ترقق في جلسات لاحقة إعادة التصوير صعبا. لتجنب الإفراط رقيق، سمك الجمجمة يحتاج إلى أن يتم التحقق بشكل دوري أثناء الجراحة (انظر مناقشة). </li></ol> 3. تجميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الحطام العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على كل حافة من افتتاح مركز لوحة الرأس العقيمة، والتي تم تعقيمها (انظر الشكل 1). عقد لوحة الرأس بإحكام ضد الجمجمة مع المنطقة ضعيفة تقع في وسط افتتاح ملاحظة: إذا كان الغراء يلوث ص ضعيفةegion عن طريق الصدفة، إزالته بعناية مع شفرة المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برفق الجلد من الجانبين من الجمجمة إلى حواف افتتاح مركز لوحة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حوالي 10 دقيقة حتى يتم إرفاق لوحة رأس البئر في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الرأس على اثنين من كتل الجانبية من لوحة بعقد ثم تضييق الخناق على حواف لوحة الرأس لشل حركة الماوس على لوحة عقد (انظر الشكل 1) ملاحظة: تأكد من عدم وجود الجلد أو شعيرات بين لوحة الرأس والكتل قبل تشديد الخناق. A إعداد يجمد جيدة ينبغي أن لا تظهر أي حركة ملحوظة من الجمجمة تحت المجهر تشريح عند الجزء الخلفي من الحيوان يربت بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . شطف الجمجمة يتعرض بمحلول ملحي لإزالة الغراء unpolymerized ملاحظة: من المهم لإزالة أي الغراء المتبقية، والغراء unpolymerized يطمس الصور والأضرار المجهر أهداف &lt;./ لى&gt; </ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من الأوعية الدموية من الجمجمة يتعرض مع المنطقة ضعفت كما خريطة 1، والذي يستخدم لنقل المنطقة المصورة في جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس تحت المجهر التصوير. تحديد المنطقة ضعيفة تحت الهدف 10X الهواء باستخدام epifluorescence ونقل أنحف المنطقة إلى مركز العرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من المياه المالحة في الجزء العلوي من الجمجمة والتحول إلى الهدف 60X، والتي تم تشطف بالماء المعقم. تحديد المنطقة التي تصور العمود الفقري شجيري الفردية بوضوح على طول التشعبات. تحديد وتسمية المنطقة المقابلة على خريطة 1 من خلال مقارنة بين الأوعية الدموية وجهة نظر المجهر epifluorescent والصورة الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الطول الموجي ليزر ثنائي الفوتون وفقا لfluorophores. على سبيل المثال، 920 نانومتر لYFP؛ 890 نانومتر لGFP؛ 1،000 نانومتر لDsRed وtdTomato 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة أكوام مع 2الخطوات ميكرومتر على طول ض محور باستخدام الهدف 60X. هذه الصورة كومة يغطي × 200 ميكرون المنطقة حوالي 200 ميكرون (512 X 512 بيكسل) ويتم استخدام خريطة 2 لنقل خلال جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تسعة مداخن صورة داخل الخريطة 2 باستخدام تقريب رقمي 3X. كل صورة كومة يغطي مساحة تقارب 70 ميكرومتر × 70 ميكرون (512 X 512 بكسل)، مع 0.7 ميكرومتر الخطوات على طول ض محور ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الليزر أقل من 40 ميغاواط عند قياسها على عينات لتقليل الضيائية. </li></ol> 5. استعادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير، وفصل بلطف لوحة الرأس من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تنظيف الجمجمة والجلد لإزالة كافة الغراء المتبقية ملاحظة: إن أي الغراء المتبقي على الجلد يسبب تهيج وتبطئ الشفاء الجلد في حين أن أي الغراء المتبقية على الجمجمة ويسبب تآكل الجمجمة وngiogenesis في طبقة العظام نمت حديثا، مما يجعل نقل اللاحقة وإعادة التصوير صعبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجمجمة والجلد بمحلول ملحي عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة فروة الرأس مع خياطة جراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة في قفص منفصل. إدارة مسكن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. عودة الحيوان إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام. مراقبة الحيوانات عن كثب (فحص مرة واحدة يوميا على الأقل) حتى تشفى شق ويتم إزالة الغرز. إدارة الحقن اللاحقة من البوبرينورفين مسكن إذا لزم الأمر. </li></ol> 6. Reimaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،1-1،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع المنطقة تصويرها سابقا بمقارنة نمط الأوعية الدموية لخريطة 1 ونمط فرع شجيري إلى خريطة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تنفيذ reimaging في حدود 1 في الاسبوع، كرر الخطوة 2.3 لإزالة طبقة رقيقة من العظام نمت حديثا على رأس إعادة ضعيفةجيون باستخدام شفرة المجهرية. إذا تم تنفيذ reimaging بعد أكثر من 1 أسبوع، كرر الخطوات على حد سواء 2.2 و 2.3 ملاحظة: تتكون طبقة العظام نمت حديثا هيكل أقل مكثف مقارنة مع طبقة العظم المضغوط الأصلي، مما يؤدي إلى انخفاض جودة الصورة. لذا، للحصول على نفس النوعية، فمن الضروري رقيقة الجمجمة أكثر قليلا من الدورة السابقة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف والتوجه للحصول على أكوام الصورة التي تطابق المتخذة سابقا مداخن صورة تحت المجهر ثنائي الفوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور كما في الخطوة 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،1-5،5 بعد التصوير. </li></ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li><li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+plasticity+in+the+motor+cortex.">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li><li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+plasticity:+looking+beyond+development.">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li><li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+and+long-term+plasticity.">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li><li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging.">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li><li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo.">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li><li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis.">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li><li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices.">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li><li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization.">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li><li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation.">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation.">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window.">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex.">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li><li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

للحصول على نجاح إعداد ضعفت الجمجمة، عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة. 1) سمك الجمجمة. عظم الجمجمة لديها بنية ساندويتش، مع اثنين من طبقات من العظم المضغوط عالي الكثافة وطبقة وسطى من الاسعار المنخفضة للكثافة العظام الاسفنجية. في حين أن الحفر الصغيرة عالية السرعة مناسب...

تشارك القشرة الثدييات في العديد من وظائف الدماغ، من الحسي الإدراك والحركة التحكم لمعالجة المعلومات المجردة والإدراك. وظائف القشرية المختلفة بناء على الدوائر العصبية المختلفة، والتي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التواصل وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وباستمرار يتم تعديل هيكل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي ردا على الخبرات والأمراض. في الدماغ ناضجة، اللدونة متشابك يأخذ شكل كلا من التغيرات قوة وبالإضافة إلى ذلك / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، ولعب أدوارا مهمة في تشكيل والحفاظ على الدوائر العصبية الوظيفية. العمود الفقري شجيري هي المكونات بعد المشبكي الأغلبية من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ مثير الثدييات. ويعتقد أن دوران مستمر وتغيرات شكلية في العمود الفقري لتكون بمثابة مؤشر جيد من التعديلات في الاتصالات متشابك 1-7. ثنائي الفوتون المسح الضوئي ليزر الصغيرةيقدم SCOPY الاختراق العميق في السراء، والأعمال التحضيرية مبهمة والضيائية منخفضة، مما يجعلها مناسبة للتصوير الحية في الدماغ سليمة 8. في تركيبة مع وضع العلامات الفلورسنت، ويوفر اثنين من الفوتون التصوير أداة قوية لنظرة خاطفة إلى الدماغ يعيشون واتبع إعادة التنظيم الهيكلي في نقاط الاشتباك العصبي الفردية مع مكانية عالية والقرار الزماني. وقد استخدمت أساليب مختلفة لإعداد الفئران لتصوير حي 9-13. هنا، نحن تصف إعداد ضعفت الجمجمة من الجسم الحي في اثنين من الفوتون التصوير للتحقيق في اللدونة الهيكلية في العمود الفقري شجيري بعد المشبكي في القشرة الماوس. باستخدام هذا النهج، وقد صورت دراساتنا الأخيرة صورة ديناميكية التغيرات العمود الفقري شجيري ردا على تعلم المهارات الحركية مع زيادة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا مع fluorescently المسمى فرعية العصبية والتطور السريع للتقنيات وضع العلامات في الجسم الحي، وإجراءات مماثلة وصفها هنا يمكن أن تطبق أيضا لinvestigaالشركة المصرية للاتصالات أنواع أخرى الخلية والمناطق القشرية، جنبا إلى جنب مع معالجات أخرى، فضلا عن استخدامها في نماذج المرض 16-23.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>Mixed with xylazine for anesthesia</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>Mixed with ketamine for anesthesia</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>0.9% NaCl for injection and imaging</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>72000</td><td>Double-edge stainless steel razor blades</td></tr><tr><td>Alcohol pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Sterile alcohol prep pads</td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant</td></tr><tr><td>High-speed micro drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area</td></tr><tr><td>Micro drill steel burrs</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td>1.4 mm diameter</td></tr><tr><td>Microsurgical blade</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>Fix the head plate onto the skull</td></tr><tr><td>Suture</td><td>Havard Apparatus</td><td>510461</td><td>Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Infinity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, air</td></tr><tr><td>60X objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, IR permeable, water immersion</td></tr><tr><td>Ti-sapphire laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Mai Tai HP</td></tr></tbody></table>

two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex using a thinned-skull preparation

في القشرة الثدييات، الخلايا العصبية تشكيل شبكات معقدة للغاية، وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي. التغيرات في قوة متشابك، فضلا عن إضافة / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، تحدث بطريقة تعتمد على الخبرة، وتوفير الأساس الهيكلي للاللدونة العصبية. كمكونات بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي معظم مثير في القشرة، وتعتبر العمود الفقري شجيري أن يكون وكيل جيدة من نقاط الاشتباك العصبي. الاستفادة من مزايا وتقنيات الوراثة الماوس وضع العلامات الفلورسنت، والخلايا العصبية الفردية وهياكلها متشابك يمكن أن توصف في الدماغ سليمة. ونحن هنا نقدم بروتوكول التصوير عبر الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمتابعة fluorescently المسمى العمود الفقري شجيري بعد المشبكي على مر الزمن في الجسم الحي. هذا البروتوكول يستخدم إعداد ضعفت الجمجمة، والتي تحافظ على الجمجمة سليمة ويتجنب الآثار الناجمة عن التعرض للالتهابات السحايا والقشرة. لذلك، يمكن الحصول على الصور مباشرة بعد سويتم تنفيذ rgery. لا يمكن أن يؤديها إجراء التجارب بشكل متكرر على مدى فترات زمنية مختلفة تتراوح من ساعات إلى سنوات. يمكن أيضا استخدام هذا المستحضر يتم توسيع التحقيق في مختلف المناطق القشرية وطبقات، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

في YFP-H خط الفئران 25، بروتين فلوري الصفراء يعبر في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الهرمية طبقة V، التي توقع لها قمية التشعبات إلى طبقات سطحية في القشرة. من خلال إعداد ضعفت الجمجمة، وقطاعات شجيري fluorescently المسمى ولا يمكن تصوير تحت المجهر متكررة اثنين من الفوتون عل...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

17.8K Views.  University of California, Santa Cruz. Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Video: Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

التصوير الطولي اثنين من الفوتون من CA1 فرس النهر الأورسيال في الفئران الحية

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Behavior

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

ثنائي الفوتون

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video