نشكر بشؤون تكنولوجيز (كورفاليس، OR) لتوفير ST-246. وأيد DKR من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة في علم المناعة في جامعة بوسطن (5T32AI 7309). وأيد هذا العمل في جزء من P41 086180، المعاهد الوطنية للصحة RO1AI1096159-01، وRO3 (لJHC).

1. خلايا بلايت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل خلايا هيلا من لوحة وتمييع في وسائط النمو (DMEM، 2 مم L-تخمة، و 10٪ FBS) إلى ما يقرب من 2.0 × 10 5 خلية / مل. الاستغناء 100 ميكرولتر / جيد في وواضحة لوحة 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران (20،000 خلية / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة حتى متكدسة في حاضنة 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2. </li></ol> 2. تصيب الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الفيروسات وتصيب الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد TrpV (الفيروس الثلاثي؛ فينوس المبكر والمتوسط ​​mCherry، في وقت متأخر TagBFP) وPLV (المروج أقل فينوس) فيروس الفلورسنت وتفصيل باستخدام صوتنة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، مخزونات فيروس الخام يمكن أن تكون مختلطة مع 01:01 0.25 ملغ / مل التربسين في وسائل الإعلام العدوى والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مخزونات فيروس الخام في 37 ° C وسائل الإعلام العدوى (DMEM، 2 مم L-تخمة، 2٪ FBS). لالتهابات وزارة الداخلية عالية (10 PFU / خلية)، وتمييع الأسهم الفيروس إلى 1.0 × 10 7 PFU / مل على افتراض 5 × 10 4خلايا / جيد وحجم اللقاح من 50 ميكرولتر. الخطة على اصابة 3 آبار تكرار لكل معاملة مع TrpV و 3 آبار أخرى لتكرار نفس المعاملة مع PLV لحساب مضان الخلفية محددة لكل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الآبار وذلك بإضافة 50 ميكرولتر / المخفف جيدا الفيروس في وسائل الإعلام العدوى. ويعرف هذا باسم عدوى الوقت = 0 ساعة آخر (0 HPI). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المركبات العلاج المطلوب في وسائل الإعلام العدوى. لجميع العلاجات وينبغي بذل واحد 2X سيد مزيج التخفيف وتطبيقها لتكرار الآبار (مثلا 350 ميكرولتر اجمالى حجم 96 لمدة ستة آبار مع 50 ميكرولتر لكل منهما). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المركبات التجريبية في وسائل الإعلام العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع للسيطرة على السيارة المذيبات (مثل برنامج تلفزيوني، DMSO) في وسائل الإعلام العدوى. ملاحظة: تركيزات النهائي مماثلة المذيبات السيطرة على السيارة وينبغي أن تستخدم على النحو المطبق للمركبات التجريبية (على سبيل المثال إذا تم IBT الأسهم الخاصة بك مع DMSO وتستخدم في concentratio النهائينانوثانية من 1 ميكرولتر / مل، ثم استخدم وحده في DMSO 1 ميكرولتر / مل كما السيطرة على السيارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مركبات التحكم في وسائل الإعلام العدوى. وتشمل المركبات المكافحة الموصى بها: 3.6 ميكرومتر (1 ميكروغرام / مل) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (أراك)، و 50 ميكرومتر (11.7 ميكروغرام / مل) إيزاتين β-thiosemicarbazone (IBT)، 60 ميكرومتر (50 ميكروغرام / مل) ريفامبيسين، أو 5 ميكرومتر (1.9 ميكروغرام / مل) ST-246 8،15،16. رؤية النتائج الممثل للآثار المتوقعة. ملاحظة: جعل هذا التخفيف في مرتين (2X) على التركيز النهائي المطلوب لأن هذا يضاف إلى نسبة 1:1 لحجم بالفعل في البئر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إضافة الفيروس، إضافة 50 ميكرولتر التي تحتوي على وسائل الاعلام العدوى العلاجات المطلوبة والضوابط المخففة كما في الخطوة 2.2. ملاحظة: لمقايسة لتثبيط قبل مرحلة مبكرة التعبير، مجمع (ق) يمكن أن تكون إما إضافتها مباشرة إلى اللقاح الفيروس المخفف (الخطوة 2.1.2) أو لاستضافة الخلايا قبل عدوى (قبل الخطوة 2.1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 6-24 ساعة في 37 &amp; #176؛ C + حاضنة 5٪ CO 2. </li></ol> 3. إصلاح خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر 8٪ بارافورمالدهيد إلى وسائل الإعلام العدوى بالفعل في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. ملاحظة: من المستحسن لإضافة 2X PFA (8٪) مباشرة إلى وسائل الإعلام لمنع العدوى هباء من اللقاحية المعدية التي يمكن أن تحدث إذا تم مقلوب وسائل الإعلام عالية عيار مباشرة في طبق النفايات قبل التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي التي كتبها قلب لوحة في طبق النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم لاصق واضحة بصريا. ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجات مئوية إذا لم يقرأ على الفور. ومن المؤكد أن عودة وحات مختوم إلى درجة حرارة الغرفة قبل قراءة لمنع التكثيف من تشويه قياسات معمل. </li></ol> 4. القياس الكمي الفيروسات النمو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان نقطة النهاية في 515:530 لفينوس، 587:610 لmCherry، و415:457 وأو TagBFP (الإثارة: الانبعاثات الطول الموجي في نانومتر). ينبغي أن متوسط ​​أربعة قياسات لكل بئر باستخدام إعدادات مكاسب الأمثل لكل قناة. ملاحظة: قد يكون الطول الموجي الانبعاثات الملائمة مختلفة اعتمادا على نموذج وتصفية الخصائص المحددة للقارئ لوحة الخاص بك. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا عن طريق إجراء فحص الانبعاثات الطول الموجي لتحديد نقطة حيث هناك أعظم الفرق بين TrpV وPLV لكل قناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات الخام لتسهيل المقارنة بين التجارب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل قناة، وتحديد متوسط ​​TrpV تكرار والآبار PLV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح متوسط ​​قياسات الخلفية PLV المصابة من القياسات التجريبية متوسط ​​TrpV المصابة عن كل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات عن طريق قسمة قيمة كل خلفية طرح من قبل قيمة السيارة فقط أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تكرر تجربة عدة مرات، وتحليل التباين في اتجاه واحد (في اتجاه واحد أنوفا) واختبار متعددة جomparison يمكن إجراء اختبار آخر لتحديد ما إذا كان أي من العلاجات يعكس فروق ذات دلالة إحصائية من العلاج للمركبات فقط لكل قناة. </li></ol></li></ol> 5 بروتوكول بديل: فحوصات لوحة الحركية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات من خلال إضافة العلاجات (الخطوة 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم لاصقة وضعها في غرفة قارئ لوحة معايرتها إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب أن يتم إيلاء عناية خاصة للحفاظ على لوحات باستمرار عند 37 درجة مئوية لمنع الإجهاد الخلية لا مبرر له والتكثيف. لفحوصات الحركية، من المهم بشكل خاص لاستخدام وسيلة مخزنة (بيكربونات الصوديوم وHEPES) للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة دون إضافة 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة كسب قارئ لوحة يدويا لمنع تشبع نقاط وقت لاحق. ملاحظة: يمكن الحصول على دقة مكاسب الأمثل عن طريق إجراء فحوصات نقطة النهاية في ظل ظروف مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على قراءات للساعة 8-24 HPI وتطبيع باستخدام سيميلار الإجراء كما هو الحال في نقطة النهاية مقايسة (الخطوة 4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقاط زمنية الفردية يمكن تحليلها إحصائيا باستخدام أساليب مماثلة لفحص نقطة النهاية هو موضح سابقا. </li></ol>

<ol>
	<li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+infection+&amp;+temporal+analysis+of+virus+gene+expression:+part+1.">Vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li><li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiZyme:+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance.">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li><li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection.">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li><li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts.">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li><li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein.">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li><li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library.">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir,+Adefovir,+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections.">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li><li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents.">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox.">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li><li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+dilemmas--monkeypox,+smallpox,+and+biologic+terrorism.+The+New+England.">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li><li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox,+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections.">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li><li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo.">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li><li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+vaccinia+virus:+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65.">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li><li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic.">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li><li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+transcription.">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li><li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection.">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li><li>D&#237;az-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase/RNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication.">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li><li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ppp(A2&#8217;p)nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus.">Modulation of ppp(A2&#8217;p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li><li>S&#225;nchez-Puig, J. M., S&#225;nchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection.">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li><li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription.">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما تكشف ولا براءات الاختراع في انتظار بحثا عن الفيروسات أو أساليب الفحص.

هنا، لقد وصف الاستخدام العملي لمرحلة متعددة مراسل اللقاحية الفيروس (TrpV)، والذي يوفر، في الوقت الحقيقي التدابير ردود فعل استنساخه من تكاثر الفيروس. باستخدام الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا، وكنا قادرين على إظهار أن TrpV يستجيب بطريقة متسقة مع آلية عمل ليفهم كل مثبط....

تقليديا، يتم درس التعبير الفيروس باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية (مثل النشاف الشمالية، النشاف الغربية، ميكروأري التهجين، الخ) 1. في حين أن هذه الأساليب هي قادرة على توفير معلومات مفصلة فيما يتعلق بتصنيف التغييرات التعبير عن mRNAs والفردية أو البروتينات، فإنها عادة ما تكون غير قابلة للعمليات في الوقت الحقيقي والإنتاجية العالية. وقد تم تطبيق النهج البديلة باستخدام صحفيين القائم على مضان سابقا عند العمل مع فيروسات الجدري؛ ومع ذلك، فقد كان الدافع تنميتها واستخدامها من قبل أهداف متنوعة. تم تصميم العديد من هذه الأساليب للاختيار من الفيروسات المؤتلف 2،3. هذه التقنيات التعبير عن EGFP عند التأسيس السليم والتعبير من الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة الخارجية اللقاحية المؤتلف. وبالمثل، عدة سلالات اللقاحية معربا عن ثابت للذوبان EGFP أو البروتينات GFP الموسومة أعرب تحت اللقاحية المروج الأصلي قد استخدمت على نطاق واسع. هذه هي الطباعically تستخدم لتحديد دخول الفيروس وتكرارها خلال فحوصات تحييد الأجسام المضادة على أساس، وتثبيط المواد الكيميائية، أو المقارنة بين فعالية المضادة للفيروسات 4-6. في حين أثبتت هذه الفيروسات مفيدة، فهي محدودة في قدرتها على تقديم معلومات مفصلة عن وجهة تثبيط بسبب استخدامها لغامضة في وقت مبكر / متأخر المروج الفيروسية واحد. جعلت الطرق السابقة أيضا استخدام البروتين EGFP مع الإشارة إلى الضوضاء الخصائص الأمثل. نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية وعدم وجود الأدوات المتوافرة لفحص التغييرات في الوقت الحقيقي في التعبير الجيني الفيروسي، وقد وضعنا مجموعة من الفيروسات واحد ومتعدد مراسل المرحلة 7،8. كما هو موضح في المنشورات السابقة، هذه الفيروسات تعبير عن واحد أو اثنين أو ثلاثة البروتينات الفلورية متميزة طيفيا من المروجين اللقاحية الأم خلال وقت مبكر، ومراحل وسيطة، أو في وقت متأخر من العدوى. هذه الفيروسات يمكن أن يكون لناإد كمؤشرات للفيروس التقدم النسخ المتماثل باستخدام المجهر مضان وأنهم على قدم المساواة مناسبة تماما لوحة وقارئ مقرها المقايسات الإنتاجية العالية. هذه الفيروسات هي سهلة الاستخدام في مكان النوع البري الفيروس، وتزايد مع حركية مماثلة لتصل إلى ما يعادل 7 التتر. خلال تخطيط وإنشاء هذه الفيروسات، واتخذت الكثير من الرعاية في اختيار fluorophores التي لها خصائص عالية إشارة إلى خلفية قابلة للطي مع كفاءة متفوقة على تسهيل الكمي موثوق بها مع ردود الفعل السريعة للتغيرات في التعبير (فينوس، mCherry وTagBFP). بالإضافة إلى ذلك، تم اختيار مجموعات من المروجين الفيروسية التي تنتج الدقة العالية، لا لبس فيها التعبير مرحلة محددة، وتوفير المعلومات حول مجموعة كاملة من وقت مبكر (C11R المروج) والمتوسطة (G8R المروج) وأواخر (F17R المروج) التعبير الجيني، على النقيض من غامض المروجين المبكر / في وقت متأخر. ويمكن لهذه الفيروسات أن تستخدم كأداة لإنفيتقصى دورة حياة تنميط الفيروسة الجدرية، فيروس اللقاحية. الكثير لا يزال غير معروف عن التفاعل المضيفة للفيروس على الرغم من تاريخها الطويل من الدراسة. اللقاحية معقدة، وتنتج أكثر من 200 بروتينات فريدة من نوعها، وكثير منها المناعية واستضافة عدائية. على العدوى، يبدأ الفيروس في وقت مبكر اللقاحية فورا مرنا النسخ. ومما يسهل هذا من قبل البلمرة الحمض النووي الريبي والنسخ العوامل التي تم تحميلها على الجينوم الفيروسي خلال التعبئة والتغليف الفيريون والذي عقد في دولة مؤقتا حتى عدوى لاحقة. هذا التعبير في وقت مبكر تنتج أساسا من البروتينات اللازمة لقمع نظام المناعة المضيف (مرنا decapping، عزل الرنا المزدوج الجديلة، والبروتينات مستقبلات شرك وكذلك مثبطات موت الخلايا المبرمج، استجابة الإجهاد، وتول، IL، وNF كيلوبايت إشارات) وتكرار الجينوم. التعبير المبكر تنتج أيضا عوامل النسخ اللازمة للتعبير وسيطة. ويشمل تعبير وسيطة للتعبير عن العوامل أواخر مرحلة النسخ. هذاالتعبير تتالي يؤدي إلى إنتاج بروتينات الفيروس الهيكلية والأنزيمية خلال المراحل المتأخرة من العدوى، والتي هي ضرورية لتجميع كامل للاللقاحية الفيريون ناضجة. لدينا مجموعة من الفيروسات مراسل الفلورسنت يسمح للتقدم السريع الذي سيدلي في فهم علم الأحياء الفيروسة الجدرية. إحدى الطرق الأكثر شيوعا وتستغرق وقتا طويلا في مجال علم الفيروسات هو فحص النمو. هذا عادة ما ينطوي على اصابة الخلايا، بسن سلسلة من العلاجات، وفيروس الحصاد من قبل lysing الخلايا المصابة، وقياس عيار الفيروسية الناتجة عن طريق فحص اللوحة. باستخدام الفيروسات مراسل الموصوفة هنا يسمح قياس الوقت الحقيقي للنمو الفيروس الذي يمكن أن يعاير بسهولة ومقارنة بين العديد من العلاجات يقوم بالتوازي. نتوقع هذه المجموعة من الكواشف سيتم استخدامها في بروتوكولات مختلفة لتحديد التغيرات في التعبير الجيني الفيروسي في الاستجابة للعلاج بالعقاقير، رني كnockdown، أو تقييد نطاق المضيف. هذه الطريقة تمكن أيضا تحليل عالية المحتوى على نطاق أوسع مما كان متاحا في السابق، مما يسمح للشاشات العقاقير المضادة للفيروسات الإنتاجية العالية لمراحل محددة تحديدا الهدف من الفائدة. في حين تم التعرف على العديد من العلاجات المحتملة لمكافحة عدوى الفيروسة الجدرية، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فقط علاجات فعالة لعلاج عدوى الفيروسة الجدرية هي نوكليوزيد اللاحلقية فسفونات، السيدوفير، والعلاج المناعي مع اللقاحية الجلوبيولين 9،10. على الرغم من القضاء على الجدري في عام 1977 11، تظل فيروسات الجدري خطرا كبيرا على صحة الإنسان 12. وقد أدى وقف انتشار التطعيم ضد فيروس الجدري إلى زيادة التعرض لفيروسات الجدري الأخرى 13. على سبيل المثال، مناطق وسط أفريقيا محمية من قبل التطعيم تشهد طفرة في فيروس جدري القردة الإصابات 14. وكان مصدر قلق كبير أيضاالمثارة بشأن قابلية كامنة لإطلاق المتعمد للفيروس الجدري. ويرجع ذلك إلى العلاجات المتاحة حاليا محدودة، وهناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة. هذه الفيروسات مراسل تسمح فحص جزيء صغير المانع السريع والإنتاجية العالية لتثبيط مرحلة معينة من تكاثر الفيروس. سوف تحديد مثبطات التي تستهدف المراحل التعبير الفيروسية حاليا لا هدف تثبيط تسهيل تطوير علاجات تركيبة مع زيادة رجولية. الكثير يمكن استخلاصها حول اللقاحية بيولوجيا الخلية من خلال مراقبة التغيرات في التعبير الجيني في كل مرحلة. وعادة ما يتم التعبير عن التوهين بواسطة مادة كيميائية أو التلاعب الجيني للخلية المضيفة المصابة من حيث انخفاض التتر الفيروسية. ومع ذلك، من خلال مقارنة التغيرات في كل مرحلة من مراحل سلسلة التعبير الفيروسية، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر اكتمالا لكيفية تأثير الفيروس هو اللياقة البدنيةإد عن طريق علاج خاص. وقد تبين أن هذه البيانات أنها تتطابق جيدا مع الإخراج عيار الفيروس التقليدية، ولكن تقديم معلومات أكثر تفصيلا الآلية فضلا عن قدرات إنتاجية عالية 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1249">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:747px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>TRLVMF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB03091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1-&#946;-D-Arabinofuranosylcytosine&#160; (AraC), MW= 280 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">isatin &#946; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9075202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Rifampicin, MW= 823 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ST-246, MW= 376 g/mol</td>
			<td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TempPlate RT optically clear film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2978-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression

فيروسات الجدري هي عائلة من الفيروسات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل التي تشمل مسببات الأمراض البشرية النشطة مثل جدري القرود، المليساء contagiousum، وفيروس Contagalo. ويشمل الأسرة أيضا فيروس الجدري، الجدري. نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية، العديد من الأسئلة لا تزال قائمة بشأن استراتيجيتهم التعبير الجيني. في هذه المادة ونحن تصف وضع تصور واستخدام الفيروسات اللقاحية المؤتلف التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من مراحل واحدة ومتعددة في التعبير الجيني الفيروسي في شكل عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا من خلال استخدام البروتينات الفلورية متميزة طيفيا كما صحفيين لكل من ثلاث مراحل من تكاثر الفيروس. توفر هذه الفيروسات على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء مع الحفاظ على أنماط محددة المرحلة التعبير، وتمكين المقايسات القائمة على لوحة والملاحظات المجهرية من انتشار الفيروسات والنسخ المتماثل. هذه الأدوات لها استخدامات لاكتشاف فيروسات، ودراسات للتفاعل الفيروس المضيف، والبيولوجية التطوريةبليد الحركة.

كمثال على استخدام نموذجي من هذه الفيروسات، وكان يستخدم الفيروس الثلاثي مضان مراسل لمقارنة وجهة تثبيط العديد من الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا. كانت مطلية خلايا هيلا في زراعة الأنسجة المعالجة واضحة لوحات 96 جيدا مسطحة القاع ا...

Watch this Scientific Journal Video about Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression at JoVE.com

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Views.  Boston University School of Medicine.  وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر ت?...

Video: Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&#39;Bioluminescent&#39; بالعاثية مراسل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الفئة أ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...