אנו מודים Siga טכנולוגיות (Corvallis, OR) למתן ST-246. DKR נתמכה על ידי מענק NIH אימונים באימונולוגיה באוניברסיטת בוסטון (5T32AI 7309). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי P41 086,180, NIH RO1AI1096159-01, וRO3 (לJHC).

1. תאי פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את תאי הלה מהצלחת ולדלל בתקשורת צמיחה (DMEM, 2 L-שפע מ&quot;מ, 10% FBS) לכ 2.0 x 10 5 תאים / מיליליטר. לוותר 100 μl / גם בצלחת שחורה עם קירות, ברורה שטוחה תחתונה 96 היטב (20,000 תאים / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 24 שעות עד מחוברות בחממה 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 2. להדביק תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל וירוס ולהדביק תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו TrpV (וירוס חדר לשלושה; המוקדם ונוס, בינוני mCherry, TagBFP המאוחר) וPLV (יזם פחות ונוס) וירוס ניאון וdisaggregate באמצעות sonication במשך 5 דקות. לחלופין, יכולות להיות מעורבות במניות וירוס גולמי 01:01 עם 0.25 מ&quot;ג / מיליליטר טריפסין בתקשורת זיהום וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מניות וירוס גולמי ב37 ° C מדיה זיהום (DMEM, 2 L-שפע מ&quot;מ, 2% FBS). לזיהומים גבוהים משרד הפנים (10 PFU / תא), לדלל מניות וירוס ל1.0 x 10 7 PFU / מיליליטר בהנחת 5 x 10 4תאים / היטב ובידוד נפח 50 μl. תכנית על הדבקה של 3 בארות לשכפל עבור כל טיפול עם TrpV ועוד בארות לשכפל 3 לאותו טיפול עם PLV לתת דין וחשבון לקרינת רקע ספציפי לכל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק בארות על ידי הוספת 50 וירוס μl / מדוללת היטב בתקשורת זיהום. זה מוגדר כזמן = 0 הודעה hr זיהום (0 HPI). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות טיפול רצויים לתקשורת זיהום. עבור כל טיפולי דילול תערובת אחת 2x אדון צריך להיעשות ומיושם לשכפל בארות (נפח כולל למשל 350 μl במשך שש 96 בארות עם 50 μl כל אחד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות ניסיוניות לתקשורת זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ממס רכב שליטה (למשל PBS, DMSO) לתקשורת זיהום. הערה: יש להשתמש בריכוזים סופיים דומים של ממסים רכב שליטה כפי שהוחלו לתרכובות ניסיוניות (למשל, אם מניית IBT שלך הוא עשה עם DMSO והשתמשה בconcentratio סופיNS של μl 1 / מיליליטר, ואז להשתמש DMSO לבד ב1 μl / מיליליטר כשליטה ברכב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות שליטה לתקשורת זיהום. תרכובות שליטה מומלצות כוללות: 3.6 מיקרומטר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (Arac), 50 מיקרומטר (11.7 מיקרוגרם / מיליליטר) isatin β-thiosemicarbazone (IBT), 60 מיקרומטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ריפאמפיצין, או 5 מיקרומטר (1.9 מיקרוגרם / מיליליטר) ST-246 8,15,16. ראה נציג תוצאות להשפעות צפויות. הערה: לעשות דילול זה בפעמים (2x) הריכוז הסופי הרצוי שכן זה מתווסף ביחס של 1:1 להיקף כבר בבאר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר תוספת של וירוס, להוסיף 50 תקשורת זיהום μl מכילה טיפולים ובקרות רצויים בדילול בשלב 2.2. הערה: כדי assay לעיכוב לפני ביטוי בשלב מוקדם, מתחם (ים) יכול להיות שהוסיף ישירות לבידוד הנגיף המדולל (הצעד 2.1.2) או לארח את התאים לפני ההדבקה (לפני הצעד 2.1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 6-24 שעות ב# 37 &amp;176; חממת C + CO 2 של 5%. </li></ol> 3. תקן תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 100 μl paraformaldehyde 8% לתקשורת זיהום כבר בכל טוב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות מוגנות מפני אור. הערה: מומלץ להוסיף PFA 2x (8%) ישירות לתקשורת כדי למנוע זיהום aerosolization של vaccinia זיהומיות, אשר יכול להתרחש אם תקשורת גבוה כייל היא הפוכה ישירות לתוך צלחת פסולת לפני הקיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע על ידי היפוך צלחת למנת הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של טמפרטורת חדר PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום צלחת עם סרט דבק ברור אופטי. הערה: ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C, אם לא קראו באופן מיידי. הקפד להחזיר צלחות אטומות לטמפרטורת חדר לפני הקריאה כדי למנוע התעבות מעיוות מדידות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 4. לכמת צמיחת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה נקודת סיום ב515:530 עבור ונוס, 587:610 לmCherry, ו415:457 fאו TagBFP (עירור: פליטת גל בננומטר). ארבע מדידות צריכה להיות בממוצע לכל גם באמצעות הגדרות רווח מותאמות לכל ערוץ. הערה: פליטת הגל המתאים עשוי להיות שונה בהתאם למאפייני הדגם ומסנן הספציפיים של קורא הצלחת שלך. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי ביצוע סריקת פליטת גל כדי לקבוע את הנקודה שבה יש ההבדל הגדול ביותר בין TrpV וPLV לכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים הגולמיים כדי להקל על השוואה בין ניסויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ערוץ, לקבוע את הממוצע של TrpV לשכפל ובארות PLV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את מדידות רקע שנדבק ב-PLV הממוצעים מהמדידות הניסיוניות שנדבקו ב-TrpV ממוצע לכל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים על ידי חלוקת כל ערך מופחת רקע על ידי ערך הרכב רק טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שניסוי כבר חזר מספר פעמים, ניתוח בכיוון אחד של שונות מבחן (ANOVA חד כיווני) וג מספרomparison לאחר הבדיקה ניתן לבצע על מנת לקבוע אם כל אחד מהטיפולים משקף הבדל מובהק סטטיסטי מטיפול הרכב בלבד לכל ערוץ. </li></ol></li></ol> . 5 פרוטוקול אלטרנטיבי: מבחני פלייט קינטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הפעולות באמצעות תוספת של טיפולים (שלב 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם עם סרט דבק ואת מקומו בתא של צלחת קורא equilibrated 37 ° C. שים לב: יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי לשמור על צלחות באופן עקבי על 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מתח תא מופרז ועיבוי. עבור מבחני הקינטית, זה חשוב במיוחד להשתמש במדיום שנאגרו (סודיום ביקרבונט וHEPES) כדי לשמור על רמת חומציות תקינה ללא תוספת של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורא צלחת קבוצה לזכות באופן ידני כדי למנוע הרוויה של נקודות זמן מאוחר יותר. הערה: ניתן להשיג אופטימיזציה של רווח מדויק על ידי ביצוע מבחני נקודת סיום בתנאים דומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש קריאות לשעה ל8-24 HPI ולנרמל באמצעות סימיהליך lar כמו בassay נקודת הסיום (שלב 4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודות זמן בודד ניתן לנתח למובהקות סטטיסטיות תוך שימוש בשיטות דומות כמו assay נקודת הסיום שתואר קודם לכן. </li></ol>

<ol>
	<li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+infection+&amp;+temporal+analysis+of+virus+gene+expression:+part+1.">Vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li><li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiZyme:+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance.">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li><li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection.">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li><li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts.">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li><li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein.">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li><li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library.">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir,+Adefovir,+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections.">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li><li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents.">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox.">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li><li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+dilemmas--monkeypox,+smallpox,+and+biologic+terrorism.+The+New+England.">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li><li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox,+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections.">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li><li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo.">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li><li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+vaccinia+virus:+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65.">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li><li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic.">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li><li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+transcription.">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li><li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection.">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li><li>D&#237;az-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase/RNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication.">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li><li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ppp(A2&#8217;p)nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus.">Modulation of ppp(A2&#8217;p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li><li>S&#225;nchez-Puig, J. M., S&#225;nchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection.">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li><li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription.">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף ואין פטנטים תלויים ועומדים לוירוסים או שיטות הקרנה.

הנה, יש לנו תיארתי את השימוש המעשי של וירוס רב שלבית כתב vaccinia (TrpV), המספק אמצעים לשחזור, בזמן אמת משוב של שכפול נגיף. על ידי שימוש במעכבי poxvirus מוגדר היטב, הצלחנו להראות כי TrpV מגיב באופן עקבי עם המנגנון הבין פעולה עבור כל מעכבי. בעוד וירוס TrpV מספק את המידע המקיף ביותר על הת...

באופן מסורתי, ביטוי וירוס הוא למד תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות (סופג למשל צפוני, מערבי סופג, הכלאה microarray, וכו &#39;) 1. בעוד שיטות אלה מסוגלים לספק מידע מפורט ביחס לסיווג שינויי ביטוי של mRNAs או חלבונים הבודדים, הם בדרך כלל לא ניתנים לתהליכים בזמן אמת ותפוקה גבוהה. גישות אלטרנטיביים באמצעות כתבי הקרינה מבוססת יושמו בעבר בעבודה עם poxviruses; עם זאת, הפיתוח והשימוש שלהם כבר מונעים על ידי מטרות מגוונות. מספר שיטות כגון נועדו לבחירה של וירוסי רקומביננטי 2,3. טכניקות אלה מבטאים EGFP על התאגדות וביטוי של ה-DNA אקסוגני משיבוטי vaccinia רקומביננטי מתאימים. באופן דומה, מספר זני vaccinia יציבות להביע EGFP מסיס או חלבוני GFP-tagged הביעו תחת אמרגן vaccinia ילידים היו בשימוש נרחב. אלה typically משמש לכמת כניסת וירוס ושכפול במהלך מבחני נטרול מבוסס נוגדנים, עיכוב כימי, או השוואה של יעילות אנטי 4-6. בעוד וירוסים אלה הוכיחו שימושיים, הם מוגבלים ביכולתם כדי לספק מידע מפורט על הנקודה של עיכוב עקב שימושם של אמרגן מוקדם / מאוחר משמעי אחת נגיפי. גם שיטות קודמות עשו שימוש בחלבון EGFP עם מאפייני אות לרעש שאינו אופטימליים. בשל המורכבות של שכפול poxvirus והמחסור בכלים קיימים לרשות assay שינויים בזמן אמת בביטוי גנים נגיפי, פיתחנו חבילה של וירוסי כתב במה יחיד ורב 7,8. כפי שמתואר בפרסומים קודמים, וירוסים אלה מבטאים אחד, שתיים, או שלושה חלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל מיזמי vaccinia ילידים במהלך מוקדם, שלבי ביניים, או מאוחר בזיהום. וירוסים אלה יכולים להיות לנוed כסמן להתקדמות שכפול נגיף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם באותה מידה גם מתאימים למבחני צלחת וקורא המבוסס על תפוקה גבוהה. וירוסים אלה הם קלים לשימוש במקום של סוג בר וירוס, הולך וגדל עם קינטיקה דומה כדי להגיע לכותרות שווה ערך 7. במהלך התכנון וההקמה של הווירוסים הללו, הרבה טיפול נלקח בבחירת fluorophores שיש להם מאפייני אות לרקע גבוהים עם יעילות קיפול מעולה כדי להקל על כימות אמין עם משוב מהיר לשינויים בביטוי (ונוס, mCherry וTagBFP). בנוסף, שילובים של יזמים ויראלי נבחרו אשר מייצרים באיכות גבוהה, ביטוי בשלב מסוים חד משמעי, המספק מידע על מגוון רחב של מוקדם (אמרגן C11R), (אמרגן G8R) ביניים וביטוי גנים (אמרגן F17R) באיחור, בניגוד למעורפל יזמים מוקדם / מאוחר. וירוסים אלה יכולים לשמש ככלי לinvestigating את מחזור החיים של poxvirus, וירוס vaccinia הטיפוסי. הרבה עדיין לא ידוע על האינטראקציה מארח וירוס למרות ההיסטוריה הארוכה של מחקר. Vaccinia הוא מורכב, לייצר מעל 200 חלבונים ייחודיים, אשר רבים מהם המערכת החיסונית ולארח עוינים. לאחר ההדבקה, וירוס vaccinia מתחיל מייד שעתוק mRNA המוקדם. זה הקל על ידי גורמי RNA פולימראז ותעתיק שהועמסו על הגנום הנגיפי במהלך אריזת virion והחזיקו במצב מושהה עד זיהום שלאחר מכן. ביטוי מוקדם זה בעיקר מייצר חלבונים הנדרשים לדיכוי של מערכת חיסון המארח (decapping-mRNA, תפיסת dsRNA, וחלבונים הקולטן דמה כמו גם מעכבים של אפופטוזיס, תגובת לחץ, ושיחה, אילינוי, ואיתות NF-κB) ושכפול הגנום. ביטוי מוקדם מייצר גם גורמי שעתוק הכרחיים לביטוי ביניים. ביטוי ביניים כולל את הביטוי של גורמי שעתוק בשלב מאוחר. זהמפל ביטוי מוביל לייצור של חלבוני נגיף מבניים והאנזימטית בשלבים מאוחרים של זיהום, אשר נחוצים להרכבה של virion vaccinia הבוגרת מלאה. הקבוצה של וירוסי כתב ניאון שלנו מאפשרת להתקדמות מהירה שעשתה בהבנה של הביולוגיה poxvirus. אחת השיטות הנפוצות וזמן רב ביותר בתחום וירולוגיה הוא assay הצמיחה. זה בדרך כלל כרוך בהדבקה של תאים, לחוקק שורה של טיפולים, וירוס קצירה ידי lysing תאים נגועים, וכימות כייל נגיף וכתוצאה מכך על ידי assay פלאק. שימוש בוירוסי הכתב המתואר כאן מאפשר מדידה בזמן אמת של צמיחת וירוס שיכול להיות assayed בקלות ובהשוואה בין מספר רב של טיפולים שבוצעו במקביל. אנו צופים זו קבוצה של חומרים כימיים אשר תשמש בפרוטוקולים שונים לזיהוי שינויים בביטוי הגנים נגיפי בתגובה לטיפול תרופתי, RNAi knockdown, או הגבלת טווח מארח. שיטה זו גם מאפשרת ניתוח גבוה תוכן בקנה מידה גדולה יותר מאשר היו זמין בעבר, מה שמאפשר למסכי תרופה אנטי ויראלית תפוקה גבוהה לשלבים יעד ספציפי מוגדרים של עניין. בעוד טיפולים פוטנציאליים רבים כדי להילחם בזיהום poxvirus זוהו, ה-FDA אישרה רק טיפולים יעילים לטיפול בזיהום poxvirus הם נוקלאוזידים אציקליות פוספונאט, cidofovir, וטיפול עם 9,10 גלובולין חיסוניים vaccinia. למרות מיגור האבעבועות השחורות בשנת 1977 11, poxviruses יישאר איום משמעותי על בריאות אדם 12. הפסקת חיסון רחב היקף נגד וירוס אבעבועות הובילה לרגישות מוגברת לpoxviruses האחר 13. לדוגמא, האזורים של מרכז אפריקה המוגן בעבר על ידי חיסון חווים עלייה חדה בנגיף Monkeypox 14. גם דאגה משמעותית כברהועלה בנוגע הרגישות הסמויה לשחרור מכוון של נגיף אבעבועות. בשל הטיפולים מוגבלים הזמינים כרגע, יש צורך דחוף בפיתוח של טיפולים חדשניים. וירוסי כתב אלה מאפשרים הקרנת מעכבי מולקולה קטנות מהירה ותפוקה גבוהה לעיכוב של שלב מסוים בשכפול נגיף. זיהוי של מעכבים כי יעד שלבי ביטוי ויראלי כרגע לא היעד של עיכוב יהיה להקל על פיתוח של טיפולים משולבים עם עוצמה מוגברת. ניתן ללמוד הרבה על ביולוגיה של תא vaccinia על ידי התבוננות שינויים בביטוי הגנים של כל שלב. הנחתה על ידי כימי או מניפולציה גנטית של תא מארח נגוע מתבטאת בדרך כלל במונחים של כותרות ויראלי מופחתות. עם זאת, על ידי השוואת שינויים בכל שלב של מפל ביטוי ויראלי, ניתן לקבל הבנה של איך כושר וירוס הוא השפעה שלמה יותרed על ידי טיפול מסוים. נתונים אלו הוכחו לתאם גם עם פלט כייל נגיף המסורתי, אלא לספק מידע מכניסטית מפורט יותר, כמו גם יכולות תפוקה גבוהה 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1249">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:747px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>TRLVMF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB03091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1-&#946;-D-Arabinofuranosylcytosine&#160; (AraC), MW= 280 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">isatin &#946; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9075202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Rifampicin, MW= 823 g/mol</td>
			<td>SigmaAldrich Co</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ST-246, MW= 376 g/mol</td>
			<td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TempPlate RT optically clear film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2978-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression

Poxviruses הוא משפחה של וירוסי DNA גדילים כפולים הכוללים פתוגנים פעילים אדם כגון קוף, contagiousum molluscum, ווירוס Contagalo. המשפחה כוללת גם את נגיף האבעבועות השחורות, אבעבועות. בשל המורכבות של שכפול poxvirus, שאלות רבות עדיין נותרו לגבי אסטרטגית ביטוי הגנים שלהם. במאמר זה אנו מתארים את המשגה והשימוש בוירוסי vaccinia רקומביננטי המאפשרים מדידה של שלבי יחיד המרובים של ביטוי גנים נגיפי בפורמט תפוקה גבוהה בזמן אמת. זו מופעלת באמצעות השימוש בחלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל כתבים לכל אחד משלושה שלבים בשכפול נגיף. וירוסים אלה מספקים יחס אות לרעש גבוה, תוך שמירה על דפוסי שלב ספציפיים ביטוי, מבחני מבוססי צלחת מאפשרים ותצפיות מיקרוסקופיות של התפשטות נגיף ושכפול. כלים אלה שימושים לגילוי נגיפים, מחקרים של האינטראקציה מארח וירוס, וביו אבולוציוניתמשעמם.

כדוגמא לשימוש האופייני של הווירוסים הללו, וירוס הקרינה-כתב המשולש שימש להשוות את הנקודה של עיכוב של כמה מעכבי poxvirus מוגדרים היטב. תאי הלה היו מצופים ברקמת תרבות מטופלים בעלי קירות שחורות ברור צלחות 96 היטב שטוחות תחתונה וטופחו במש?...

Watch this Scientific Journal Video about Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression at JoVE.com

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Views.  Boston University School of Medicine.  אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקול?...

Video: Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג&#39;ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...