We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. النسخ في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي pCS2-H2A.F / Z-EGFP و / أو ناقلات pCS2-mCherry-CAAX من تقييد نوتي هضم انزيم 31. باستخدام الحمض النووي الريبي في عدة نسخ في المختبر، وتوليد 5 &quot;المنتجات مرنا توج من كل قالب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية مرنا توج باستخدام طقم تنقية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة. أزل مع ريبونوكلياز خالية H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف. (OD 260 س تخفيف × 40 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف الحمض النووي الريبي إلى 100 ​​نانوغرام / ميكرولتر لكل H H2A.F / Z-EGFP وmCherry-CAAX مع ريبونوكلياز خالية من 2 O. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفض جدا، سوف تتضاءل مضان أو غائبة. سوف عينات أكثر إشراقا يقلل من المخاوف بشأن الضيائية وphotobleaching من. من ناحية أخرى، يمكن أن الكثير من RNA أن تكون سامة و / أو يسبب من آثار الهدف. ملاحظة: تخزين المتبقيةمرنا تنقيته في الثلاجة -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. تربية اسماك الزرد، وجمع الأجنة، ومرنا حقن 36-38 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الدبابات تربية بحاجز لفصل خزان إلى منطقتين وملء كل خزان تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية المستخدمة في منشأة الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل منع تكاثر في وقت غير مناسب، ووضع اثنين من ذكور السمك على جانب واحد من الجدار وسمكتين الإناث على الجانب الآخر الليل قبل التزاوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ذوبان الجليد الخليط مرنا معدة مسبقا على الجليد. استبدال المياه في خزانات تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية العذبة وإزالة الحواجز. على الفور بعد سحب الحواجز، الحارة لحقن القالب إلى 28.5 درجة مئوية، وإعداد المعدات ل microinjection. ملاحظة: للحصول على معلومات حول قوالب حقن، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض كل 10 - 15 دقيقة باستخدام مصفاة الشاي وشطف البيض إلى 100 × 15 ملم طبق بيتري نظيفة مع البريد3 الأزرق (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4، 10 -5٪ الميثيلين الأزرق). يستخدم E3 الأزرق لمنع نمو الفطريات وضمان التنمية السليمة للأسماك اليرقات. لمزيد من المعلومات عن التزاوج وجمع الأجنة، راجع غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين نظمت خلية واحدة الأجنة في قالب حقن حرارة وحقن الحمض النووي الريبي في صفار البيض في المبلغ المطلوب من الأجنة (الشكل 1A). حساب للموت الجنين الطبيعي والأجنة غير مخصبة عن طريق إجراء الحقن الجنينية على 15٪ أكثر الأجنة من اللازم للتجربة. للحصول على تفاصيل إضافية عن Microinjection من الأجنة الزرد، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski. ملاحظة: للحصول على الاستخدام لأول مرة من مرنا، إجراء تحليل للجرعة منحنى لتحديد الجرعة المثالية لمضان وقدرتها على البقاء (كما هو موضح أي عيوب التنموية الإجمالية تصل إلى 5 DPF) قبل إجراء التصوير 5D. 150 - 200 نانوغرام / ميكرولترتحقن الأجنة في كثير من الأحيان على تركيز الأمثل، وبالتالي فإنه هو نقطة انطلاق جيدة لتركيز النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج بعناية الأجنة المحقونة من القالب باستخدام المعدلة 9 &quot;زجاج باستور ماصة. لتعديل ماصة، تذوب نهاية باستخدام موقد بنسن حتى تشكل الكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة المحقونة في طبق بيتري 100 × 15 ملم في E3 الأزرق ومنزل في 28.5 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستة ساعة بعد الحقن، وإزالة أي أجنة ميتة أو غير مخصبة من لوحات وإضافة نظيفة E3 الأزرق. منزل الأجنة في 28.5 درجة مئوية. </li></ol> 3. إعداد والتضمين من لايف الزرد الأجنة للتصوير (الشكل 1B) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين من ساعة قبل التصوير، وشاشة الأجنة حقن لGFP باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح. وضع الأجنة، معربا عن GFP الخضراء الزاهية في جديد 100 × 15 ملم طبق بيتري مع E3 الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي حل سهم من 1٪ انخفاض الاغاروز تذوب بإضافة 1 غرام من ذوبان منخفضة الاغاروز إلى 100 مل من E3 الأزرق. بعد استخدام الاغاروز، تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم. يبقى الحل الأسهم مفيد لمدة تصل إلى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 3 مل من آغار ذاب في أنبوب ثقافة 17 × 100 ملم. إبقاء الحارة الاغاروز عن طريق وضع أنبوب الثقافة في 42 ° C حمام الماء لتصبح جاهزة للاستخدام. يعد حل 15 ملم تريكين في الماء منزوع الأيونات لتخدير الأجنة الزرد 36. ملاحظة: إذا كان المطلوب تصوير في نقطة زمنية سابقة، يمكن انخفض تركيز أجار ما يصل الى 0.3٪ 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم 15 ملي تريكين والأجنة فرزهم، وانخفاض الاغاروز ذوبان، E3 الأزرق، و35 ملم الزجاج ساترة طبق ثقافة أسفل إلى مجهر الضوء تشريح. إزالة بعناية المشيماء الجنين مع # 5 ملاقط. هل هذا لمدة ثلاثة أجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة dechorionated في وعاء منفصل ليتم تخدير. وكثيرا ما يستخدم غطاء الطبق ساترة القاع لهذا الغرض. باستخدام ماصة نقل، إضافة ثلاث قطرات (حوالي 150 ميكرولتر)من 15 ملي تريكين على طبق من 5 مل E3 الأزرق (في حالة استخدام غطاء ساترة طبق السفلي) أو حتى الأجنة تم تخدير بما فيه الكفاية. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 3-4 قطرات (حوالي 150 - 200 ميكرولتر) من 15 ملي حل تريكين إلى 1٪ أنبوب الاغاروز ذاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P200 مع 1 سم من طرف ماصة قطع. نقل الأجنة تخدير على طبق القاع ساترة. إزالة أي E3 الأزرق الزائد: حل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء إضافة 5-10 ميكرولتر من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز: حل تريكين على الأجنة، والحفاظ على كل قطرة منفصل لضمان الأجنة لا ينجرف عن طريق الخطأ بالقرب من بعضها البعض. تحذير: إذا كان الاغاروز دافئة جدا، فإنه سوف يضر الجنين. درجة حرارة جيدة للحفاظ على أجار في غير 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 21 G 1 ½ إبرة، توجيه بلطف الجنين في الاغاروز إلى الموضع المطلوب. عند استخدام مجهر مقلوب للتصوير مرور الزمن، توجيه المنطقة ذات الاهتمام (ROI) أقرب إلى ساترة وقت possibجنيه. ملاحظة: لأغراض عامة، ومنطقة ذيل تقدم سهولة التوجيه وضوح بسبب رقيقة نسبيا الأنسجة (الشكل 1A). الأنسجة الأخرى، مثل الطبقة الظهارية المحيطة صفار البيض وزعنفة طيات، ويمكن استخدامها 28،29. هذه الأنسجة توفر وضوح، ولكن هذه المناطق ليست سوى عدد قليل من طبقات الخلايا سميكة. لغرض هذا البروتوكول، فإنه من المفيد لصورة المنطقة الذيل للحصول على أكبر عدد ممكن من انقسامات الخلية ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لدقائق قليلة لتجميد جزئي للأجار. استخدام إبرة لكسر بعيدا قطعة صغيرة من أجار لاختبار التصلب لها. عندما قطعة من أجار يمكن سحبها بعيدا عن الهبوط، انتقل إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية ساترة كامل مع انخفاض أجار ذوبان تشكيل القبة على الأجنة المضمنة. السماح للأجار ليصلب قبل أن ينتقل إلى صحن للتصوير متحد البؤر (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء عملية التصلب أجار (يأخذ حوالي 10 دقيقة)، وإعداد 3 مل سحل و E3 الأزرق مع خمس قطرات من (حوالي 250 ميكرولتر) 15 ملي تريكين لتوضع على الأجنة جزءا لا يتجزأ من خلال التصوير. </li></ol> 4. 5D متحد البؤر التصوير من لايف الزرد الأجنة 40،41 ملاحظة: انظر أريجا 40 و 41 اوبراين للحصول على تفاصيل حول كيفية تنفيذ 5D التصوير باستخدام أنظمة متحد البؤر الأخرى. لZ-الفاصلة، Z المكدس، Z-العمق، الفاصل الزمني، وتعريفات 5D انظر الشكل 1C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برامج التصوير وتعيين المجهر ل60X NA 1.4 عدسة الهدف. تطبيق زيت الغمر إلى عدسة موضوعية ووضع الطبق الثقافة في حامل الشرائح على المسرح المجهر. باستخدام وحدة تحكم محور ومركز جنين الفائدة فوق عدسة موضوعية وتقديم عدسة الهدف التصاعدي لتلبية الطبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أيقونة العين قطعة والتحول إلى مرشح GFP على المجهر. التركيز على العائد على الاستثمار. التركيز على الأنسجة الأقرب إلى ساترة وسffer أفضل نتائج التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التعشيق. اختيار القنوات GFP وmCherry (قبل مجموعة موجات في مجال البرمجيات) وتعيين خط الخيار إلى وضعها الطبيعي في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام &quot;التحكم عرض / شراء / A1 مسح منطقة&quot; الأمر لفتح أداة A1 مسح المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المسح الضوئي. باستخدام وحدة تحكم محور، وضع الجنين بحيث يتم تعبئة منطقة المسح الضوئي مع أكبر قدر من الزرد وقت ممكن. قوة الليزر ليست في حاجة إلى أن يكون الأمثل في هذه النقطة. خفض قوة الليزر لتجنب photobleaching من غير الضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام &quot;التحكم عرض / شراء / شراء ND&quot; الأمر لفتح لوحة التحكم اكتساب ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المسح الضوئي لتعيين المعلمات Z-المكدس. تعيين الحد الأعلى Z كومة إلى حيث الخلايا ليست في التركيز والحد الأدنى إلى حيث الخلايا لم تعد مرئية. السماح لمساحة 3 ميكرون فوق عينة للنمو وحركة الخلية، التي قد توسع في مجال التصوير. ض المكدس للالأرقام الواردة في هذا المواليةغطت tocol لZ-عمق 40 ميكرون في ذيل الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حجم الخطوة زي الفاصل إلى 2 ميكرون. في المتوسط، خلية هي 10 ميكرون في القطر. ول2 ميكرون سوف تنتج خمس فترات خلال تصوير البيانات ليتم تحليلها لكل خلية. ملاحظة: عمق للصورة التي يمكن الحصول عليها تعتمد على الفاصل الزمني Z. وضحى Z قرار للحصول على عمق الشامل في البعد Z من أجل صورة عن العديد من الخلايا التي تمر الانقسام ممكن (كبير Z-العمق). معكوس هو الصحيح، في ذلك، من خلال خفض حجم الخطوة، واكتسبت Z القرار، في حين يتم التضحية Z عمق (صغير Z-العمق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط قوة صورة ليزر، ذات الجهد العالي، ومستويات تعويض. لالتجارب أثبتت في هذا البروتوكول، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات المحددة على الصعيدين المقابلة، على التوالي، للقناة GFP تعويض. 2-5، 120-140، و-9 إلى -11. للقناة mCherry، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات، على التوالي تعويض. 3-6، 120-140، و-3 ل-8. مرة واحدة يتم تعيين المعلمات، اغلاق الفحص لمنع التعرض ليزر غير الضرورية التي قد تسبب الضيائية وphotobleaching من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد رمز المتوسط ​​خط 2X. &quot;لا المتوسط&quot; تنتج صورة مشوشة في حين أن &quot;خط 4X المتوسط&quot; يزيد بشكل كبير من وقت الفحص. استخدام المتوسط ​​خط 2X يوفر أفضل جودة الصورة ووقت أسرع المسح الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الفاصل الزمني والمدة الزمنية المناسبة اللازمة للتجربة. لالانقسامات من النوع البري، فترات زمنية لمدة دقيقتين لمدة 2 ساعة هو أفضل لتحديد مدة الإنقسامية (المستخدمة في أرقام 1، 2، 3A، و3B). الانقسامات التي تنشط حاجز الجمعية المغزل لمدة أطول من 30 دقيقة هي أكثر ملاءمة لمدة خمس فترات دقيقة لمدة أربعة ساعة من أجل الحفاظ على مضان كما هو موضح في الشكل 3C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علامة في المربع &quot;حفظ إلى ملف&quot; واسم الملف لحفظ الملف تلقائيا كما يتم الحصول عليه. الاختيار المزدوج جميع سنويايتم تعيين rameters بشكل صحيح وضرب &quot;بدء تشغيل&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الاستحواذ الكامل، لعرض ملف في شكل ثلاثي الأبعاد، انقر على أيقونة عتبة حجم. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

استخدام هذا الأسلوب يسمح احد لاستنتاج انهيار النووي المغلف، وتشكيل لوحة الطورية بواسطة إرفاق ملفات-أنيبيب الحيز الحركي، والفصل بين الصبغي الشقيقة لتشكيل لجنتين خلايا جديدة في الجسم الحي وبطريقة تعتمد على الوقت. القدرة على مراقبة الانقسام في الزرد هو مفيد على ?...

الانقسام هو الحاسم الخلوي ضروري عملية النمو، والتمايز، وتجديد في الكائن الحي. على إعداد دقيق وتكرار الحمض النووي في الطور البيني، وكانت سببا في الخلية للقسمة. وبدأت المرحلة الأولى من الانقسام، الطور، من خلال تفعيل السيكلين B / Cdk1. يتميز الطور الأول من التكثيف من مادة الكروماتين في الكروموسومات. يحدث المغلف انهيار النووي في الانتقال بين الطور الأول وطليعة الطور التالي. في طليعة الطور التالي، جسيم مركزي، ومركز نواة للتشكيل المغزل، والبدء في الهجرة إلى أقطاب المعاكس في حين تمتد الأنابيب الدقيقة بحثا عن التعلق الحيز الحركي. عند الإلحاق، والتحويلات لوضع حد على التعلق أنيبيب وقوات التوتر توجيه الكروموسومات تشكيل لوحة الطورية 1. إذا تعلق جميع الكروموسومات بشكل صحيح، اقتنعت حاجز الجمعية المغزل، والمشقوق حلقات cohesin عقد الصبغي شقيقة معا، والأنابيب الدقيقة تقصير لسحب الشقيقةالصبغي إلى أقطاب المعاكس خلال طور الصعود 2،3. المرحلة النهائية، الطور النهائي، ينطوي على استطالة الخلية وإعادة تشكيل الغلاف النووي حول اثنين من نواة جديدة. السيتوبلازمي يكمل عملية الانقسام من خلال فصل السيتوبلازم اثنين من الخلايا الوليدة الجديدة 4-6. تغيير مسارات رئيسية الإنقسامية (أي حاجز الجمعية المغزل، ازدواجية الجسيم المركزي، chromatid الشقيقة التماسك، الخ.) يمكن أن يؤدي إلى اعتقال الطورية، missegregation من الكروموسومات، وعدم الاستقرار الجيني 7-10. في نهاية المطاف، ويمكن عيوب في مسارات السيطرة على الانقسام يسبب اضطرابات النمو والسرطان، مما استلزم تصور الانقسام وعيوبه في العيش، والفقاريات، كائن متعدد الخلايا 10-16. الأجنة الزرد بمثابة كائن نموذج رائع للتصوير الحية ويرجع ذلك إلى نسيج شفاف، وسهولة حقن مكروي، والتطور السريع. باستخدام الزرد، والهدف العام من هذا المخطوط هووصف وسيلة 5D الحية (أبعاد X، Y، Z، والوقت، والطول الموجي) التصوير من الانقسام 17 (الشكل 1C). استخدام الزرد متحولة خلل في مسارات مختلفة الإنقسامية تدليل على ذلك من مثل هذه العيوب. لهذا البروتوكول، وقد تم اختيار أورورا باء وEsco2 المسوخ لتوضيح هذه العيوب. أورورا B هو كيناز الذي هو جزء من مجمع كروموسوم الركاب (CPC) تشارك في تشكيل المغزل والتعلق أنيبيب. مطلوب أيضا لتشكيل انشقاق ثلم في السيتوبلازمي 18،19. في الزرد، ونقص أورورا B يؤدي إلى عيوب في الحث ثلم، السيتوبلازمي، وكروموسوم الفصل 20. Esco2، من ناحية أخرى، هو أسيتيل التي لا غنى عنها لchromatid الشقيقة التماسك 21،22. ومن acetylates cohesin على الجزء SMC3 من الحلبة وبالتالي استقرار cohesin لضمان الفصل كروموسوم السليم في المرحلة الانتقالية الطورية طور الصعود 23. فقدان Esco2 في الزرد يؤدي إلى التشابترmissegregation romosome، من السابق لأوانه الفصل الكروماتيدات الشقيقة، عدم الاستقرار الجيني، والتي تعتمد على البروتين p53 وموت الخلايا المبرمج مستقلة 24،25. ونظرا لتوفر، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 الزرد متحولة (يشار إليها فيما aurB م / م وesco2 م / م، على التوالي) وسوف تستخدم لتوضيح هذه التقنية 25-27. وقد مكن اقتران متحد البؤر المجهري مع الآلات خلية فلوري الموسومة الباحثين إلى تصور لونين وغشاء الخلية ديناميات خلال الانقسام 25،28،29. تاريخيا استخدمت الهستونات الفلورسنت الموسومة إلى تصور لونين. الهستونات هي البروتينات النووية مكونة من أربعة أزواج مختلفة (H2A، H2B، H3، H4 و) التي هي المسؤولة عن هيكل جسيم نووي أن يؤلف الكروموسومات 30. في حين H2B يمكن القول إن هيستون الأكثر استخداما لالبروتينات الفلورية فيوقد ثبت الماوس وزراعة الخلايا، واستخدام هيستون 2A، Z الأسرة (H2A.F / Z) تماما للاستخدام في الزرد 31،32. كونكانافالين ألف والكازين كيناز 1-جاما على سبيل المثال، تعريب لغشاء الخلية، وقد أظهرت سابقا فعالا في تصور غشاء الخلية في قنافذ البحر وذبابة الفاكهة 33،34. وقد أظهرت دراسات أخرى أن CAAX بروتين فلوري الموسومة تسميات غشاء الخلية وكان ناجحا في الزرد 31. CAAX هو الحافز معترف بها من قبل الأنزيمات المعدلة بعد متعدية مثل farnesyltransferases وgeranylgeranyltransferases. تعديلات من قبل هذه الانزيمات تسبب البروتينات التي تساعدهن على غشاء المرتبطة بها، وبالتالي وصفها غشاء الخلية 35. بسبب الاستخدام السابق في الزرد، واختار هذا البروتوكول لاستخدام H2A.F / Z وCAAX لتسمية لونين وغشاء الخلية. وتطبيق هذه الطريقة تسمح للباحث لمراقبة الانقسام على مستوى الخلية الفردية لمراقبة كروموسوم فرديديناميكية، وكذلك في وقت واحد يراقب الانقسامات الخلوية المتعددة التي قد تؤثر على تمايز الأنسجة والتنمية. هذه المادة سوف تركز على تصوير ديناميات فصل الكروموسومات خلال الانقسام على مستوى الخلية الفردية. ضمن هذه المخطوطة، والقدرة على مراقبة عدة أقسام الإنقسامية، حساب الوقت الانقسام، وفك الظواهر الإنقسامية سيتم توضيح ومناقشتها. باستخدام هذه المعايير، من الناحية الفسيولوجية البيانات ذات الصلة يمكن جمعها وتطبيقها على عدة ولايات المرض تتأثر العيوب الإنقسامية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

الانقسام أمر بالغ الأهمية للنمو العضوي والتمايز. عملية ديناميكية للغاية ويتطلب أمرت الأحداث لتحقيق التكثيف السليم لونين، التعلق أنيبيب الحيز الحركي، العزل الصبغي، والانقسام السيتوبلازمي في فترة زمنية صغيرة. أخطاء في عملية حساسة يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان. الأساليب التقليدية التحقيق الحالات المرضية الإنقسامية الإنسان غالبا ما تعتمد على أنظمة زراعة الخلايا، التي تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الطبيعي والتنموي / السياق الأنسجة محددة المفيد عند دراسة الأمراض التي تصيب البشر. هذا البروتوكول يتغلب على العديد من العقبات من خلال توفير وسيلة لتصور، مع ارتفاع القرار، وديناميات كروموسوم في النظام الفقاريات، الزرد. هذا البروتوكول سوف بالتفصيل النهج التي يمكن استخدامها للحصول على صور ديناميكية تقسيم الخلايا، والتي تشمل: النسخ في المختبر، وتربية الزرد / جمع ودمج الجنين، والوقت الفاصل بين التصوير. تحسين وmodifيتم استكشاف أيضا ications من هذا البروتوكول. باستخدام H2A.F / Z-EGFP (تسميات لونين) وmCherry-CAAX (تسميات غشاء الخلية) الأجنة حقن الرنا المرسال، الانقسام في AB-النوع البري، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 هو تصور الزرد متحولة. عالية الدقة التصوير الحي في الزرد يسمح احد لمراقبة mitoses متعددة لقياس إحصائيا العيوب الإنقسامية وتوقيت تطور الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ مراقبة الجوانب النوعية التي تحدد العمليات غير لائقة الإنقسامية (أي عيوب congression، missegregation من الكروموسومات، الخ) ونتائج الكروموسومات غير لائق (أي عدم توازن الصبغيات، تعدد الصيغ الصبغية، النويات، وما إلى ذلك). هذا الاختبار يمكن تطبيقها على مراقبة الأنسجة التمايز / التنمية وغير قابلة للاستخدام الزرد متحولة وكلاء الدوائية. تصور كيف عيوب في الانقسام تؤدي إلى السرطان والتنموية اضطرابات سوف كثيراتعزيز التفاهم من التسبب في المرض.

<html> يوضح الشكل (2) القدرة على مراقبة العديد من الانقسامات الخلوية باستخدام طريقة عرض حقل واسع من AB البرية من نوع الذيل الزرد. يتم تصوير أكثر من سبع خلايا الإنقسامية في إطار زمني 14 دقيقة (فيلم 1). خلال العامين ساعة الوقت طبعا، تم القبض ?...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Molecular Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Unit 2

Cell Division

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

11.9K Views.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...