الكتاب نود أن نعترف الأطفال والجهات المانحة البلازما الكبار، والموظفين في بابوا غينيا الجديدة معهد للأبحاث الطبية. فإن الكتاب أود أن أشكر أماندين B Carmagnac، كاثرين س نيه، داني ويلسون W، ايفو مولر وديانا S هانسن لمساهمتهم في تطوير هذه التقنية، وأشكر الصليب الأحمر الأسترالي لحزم الدم والمصل. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال الفيكتوري حكومة الولاية التنفيذية البنية التحتية ودعم الحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS. وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ويمنح # 1031212 # 637406 و، والمعاهد الوطنية للصحة منح AI089686 #.

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

لقياس أقسومة البلعمة، والكفاءة في اثنين من التقنيات المطلوبة: تنقية merozoites وTHP-1 البلعمة الفحص. أهم الخطوات الحاسمة لدمج هذه التقنيات هما: 1) الطفيليات متزامنة للغاية؛ 2) إضافة E64 في الوقت الصحيح لانتاج الغشاء merozoites المغلقة؛ 3) إزالة هيموزوين لتجنب الركام؛ 4) عد أقسومة دقة من قبل التدفق الخلوي؛ 5) التخفيف من البلازما المستخدمة؛ و6) الحفاظ على كثافة خلايا انخفاض عدد ومرور THP-1 الخلايا. ودراسة متأنية لهذه الجوانب الرئيسية لوحظ ضمان استجابات قوية البلعمة. وعلى الرغم من وصفها هنا هو إعداد merozoites لتقييم البلعمة، ويمكن استخدام هذه التقنية لمجموعة واسعة من التطبيقات. بغض النظر عن منهجية تيار أسفل، الاستعدادات أقسومة الأمثل تعتمد على توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك بشكل صحيح من أجل توليد merozoites. وقد تبين طريقة E64 الموصوفة هنا إلى ذدرع merozoites الغازية للاستخدام في ارتفاع القرار المجهري للأحداث الغزو وفحوصات الحساسية المخدرات 15-20. بينما الجدوى أقسومة ليست ضرورية لالبلعمة، مطلوب سلامة معطف سطح أقسومة. وبالتالي فإن أسلوب E64 الموصوفة هنا يسمح merozoites عالية الجودة التي يتم إنتاجها لتقييم استجابات الأجسام المضادة إلى معطف السطح. كما هو مبين في الشكل 1، إذا تم إضافة E64 في وقت مبكر جدا أو لا تتشكل بعد فوات الأوان غشاء merozoites المغلقة. لهذا السبب، هناك حاجة الثقافات الطفيلي متزامن للغاية. هنا، واستخدام العلاجات السوربيتول والهيبارين لبإحكام مزامنة D10-GFP الثقافات الطفيلي إلى نافذة من 2 ساعة يوصف. الهيبارين يمكن أن تعزز gametocytogenesis في مختبر أخرى يعزل، وبالتالي يجب أن تستخدم بعناية. طرق تزامن البديلة مثل ألانين يمكن أن تستخدم أيضا، شريطة أن الطفيليات متزامنة بإحكام ويتم إنتاج 29. إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير متزامنة، دعامة أقلوسيتم إنتاج ortion من merozoites المغلقة الغشاء وإصابة الطفيلي المتبقية سوف RBC إما تمزق عادة أو تطوير التشكل غير طبيعي. فإن وجود الطفيليات التي لم تتطور في الغشاء المغلقة merozoites يؤدي إلى انسداد الفلتر والحد بشكل كبير من العائد أقسومة الحصول عليها. خلال الترشيح من merozoites المغلقة الغشاء، هيموزوين يتحرر من فجوات الهضمي وبوصفها بلورات الحرة في الحل. هيموزوين هو proinflammatory للغاية وتم الإبلاغ لتعديل الوحيدات البلاعم والبلعمة الردود 30 و 31. بالإضافة إلى تحوير البلعمة، كما هو مبين في الشكل 2، ويمكن تشكيل المجاميع هيموزوين مع merozoites في الحل. كما THP-1 الخلايا يمكن يبلعم هذه المجاميع، وهذا يمكن أن يكون المحير الرئيسية لقرار من الأجسام المضادة بوساطة البلعمة. لذلك، إزالة هيموزوين ضروري في هذا الاختبار لAVتعقيد إضافي OID من هيموزوين على بلعمية علم الأحياء. بالإضافة إلى ذلك، عدم إزالة هيموزوين قد تكون ضارة أيضا عند استخدام هذه التقنية لتوليد merozoites الحرة لتطبيقات أخرى، وخاصة التي تتطلب أقسومة الكمي. كما هو مبين في الشكل (4)، وأضاف أن عدد merozoites إلى مقايسة يمكن أن تؤثر على درجة من البلعمة من قبل THP-1 الخلايا. على الرغم من التدفق الخلوي يسمح لتعداد تركيز أقسومة، pipetting لدقيق وتكرار التهم من merozoites ضرورية لتحسين الدقة. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا إذا الطفيلي خطوط متعددة هي لفحصها جنبا إلى جنب. وقد سبق أن ثبت أن البلازما من نصف الأطفال في مأمن من PNG يمكن أن تضعف بشكل كبير قبل الانخفاض الردود 23. الموصوفة هنا هو التخفيف الأمثل من البلازما (1/120، 000 التخفيف النهائي من البلازما) لفيف من 5 - الأطفال PNG من العمر 12 سنة التي أنتجت مجموعة كبيرة من phagocyt. ردود عمليات التفتيش الموقعي هو موضح في الشكل 5 هذا النطاق المسموح به لالطبقية من الردود إلى أربع مجموعات (0-19٪، 20 - 39٪، 40-59٪ و60-79٪ البلعمة)، وكشفت النمذجة الانحدار أن الاستجابات opsonizing ارتبطت الحماية من المرض السريري وجود الطفيليات في الدم عالية الكثافة 10 للفوج يدرس مختلفة قد يكون من الضروري لضبط التخفيف البلازما لضمان البلعمة من قبل THP-1 الخلايا لا غير المشبعة أو دون مستوى الكشف. التدفق الخلوي يسمح البلعمة سريعة وقابلة للقياس الكمي مع تحسين دقة أكثر المجهري. هذا البروتوكول هو إنتاجية عالية، لوحة ومقرها الآلي اقتناء 96 لوحات جيدة لدراسة المكتسبة طبيعيا الحصانة الخلطية. يتطلب أسلوب تلطيخ مع بروميد إيثيديوم merozoites والبقع الحمض النووي ولكن البديلة مثل SYBRgreen، دابي وpropidium اليود والبقع أو البقع غشاء البروتين يمكن الاستفادة منها. سيكون هذا الاختبار تكون قابلة للPRIMARذ حيدات أو العدلات، ويمكن تكييفها إذا كان بلعمية أو FCR بيولوجيا الفائدة. الخلايا الأولية أو THP-1 خلايا متباينة في المختبر مع سلطة النقد الفلسطينية يمكن استخدامها لدراسة البلعمة في الملاريا ومسببات الأمراض الأخرى 12، 32-34. ومع ذلك باستخدام الخلايا الأولية قد تكون صعبة حيث أن هذه الخلايا هي ملتصقة وعرض غير الأجسام المضادة بوساطة البلعمة 35 أيضا. بالإضافة إلى ذلك، تقلب في الطهارة، والسلامة وظائف بعض القيود الرئيسية لاستخدام الخلايا البلعمية الأولية. المستقبلات التيسير المشاركة في أقسومة البلعمة تبقى uncharacterized، وبالتالي يمكن منع استخدام الأجسام المضادة لمستقبلات محددة التيسير توضيح مساهمة كل التيسير مستقبلات لأقسومة البلعمة. كما THP-1 البلعمة هو FCR تعتمد، وهذا يتيح تفسير واضحة من البلعمة ملاحظتها. هذا الاختبار يفسح المجال أيضا لمعالجة خصوصية المستضد من الأجسام المضادة التي opsonizing يمكن تحقيقه عن طريق UTILizing الطفيليات خروج المغلوب لمستضدات سطح أقسومة، أو باستخدام تقارب الأجسام المضادة البشرية النقية لأقسومة البروتينات السطحية. علاوة على ذلك، دراسات متعمقة الردود خلوى التالية أقسومة البلعمة تعاني من نقص، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام هذا الاختبار. هذه التقنيات اثنين تشكل تقدما كبيرا لدراسة الأجسام المضادة antimerozoite الوظيفية. تنقية merozoites جودة عالية هو مفيد لاستخدام merozoites cryopreserved، أو المجهرية الفلورسنت المغلفة مع مستضدات أقسومة. على الرغم من أن هذا الاختبار قد تم استخدامه كأداة لتقييم المناعة المكتسبة طبيعيا، فإنه قد يثبت أداة هامة لمعالجة اكتساب الحصانة ردا على التطعيم. في حين أنه ثبت مؤخرا أن البلعمة أو merozoites opsonised يرتبط مع حماية من الملاريا السريرية، وأنه ليس من الممكن التوصل إلى استنتاجات مباشرة من في المختبر THP-1 البلعمة لفي الجسم الحي phagocytoجهاز الأمن والمخابرات من merozoites كما البلعمة في هذا الاختبار يحدث في ظل ظروف ثابتة وغياب خلايا الدم الحمراء المتنافسة. وبالتالي قد التعديلات المحتملة لهذا الاختبار توفير أداة مرنة لمزيد من فهم الملاريا وأقسومة البلعمة.

وقد تبين أهمية الأجسام المضادة للمناعة ضد الملاريا المنجلية قبل 40 عاما، عندما المناعي من البالغين مفرط المناعة نقلت بشكل سلبي على الأطفال الذين يعانون من الملاريا الحادة مما أدى إلى التخفيف من حدة المرض 1. بالتالي، سعت جهدا كبيرا لتحديد أهداف الحصانة ملاريا وقائية، معظمها من خلال قياس الأجسام المضادة لالتتر الببتيدات أو البروتينات أعرب البكتريا بواسطة ELISA. وقد ثبت الأمصال ELISA يستند أيضا متغير بدرجة كبيرة بين الدراسات، ولا يتناول وظيفة الأجسام المضادة 2. العديد من المستضدات الملاريا لحث على IgG1 أليف الخلايا والأجسام المضادة IgG3 الشخصي، وخاصة المستضدات السطحية أقسومة 3. يوحي هذا التحيز فرعية أن الأجسام المضادة مستقبلات FC-(FCR) التفاعلات مع البالعات مهمة لوظائف المستجيب من opsonizing الأجسام المضادة antimerozoite 4. صممت عدة لقاحات أقسومة مستضد قيد التطوير لانتزاع ظائف المستجيب بلعمية 5 و 6 و على الرغم من الأدلة الهامة لأهمية التفاعلات الأجسام المضادة FCR في نماذج من القوارض الملاريا موجود 7-9، ودعم عدد قليل من الدراسات التي أجريت مؤخرا على أهمية الأجسام المضادة وظيفية وظائف بلعمية المستجيب للحصانة لالملاريا في البشر 10، 11، لا تزال هذه المنطقة المدروسة على نحو رديء. وقد تم دراسة الأجسام المضادة في opsonizing محددة أقسومة محدودة من قبل اثنين من العوامل؛ صعوبة في عزل merozoites نوعية جيدة؛ والاستجابات البلعمة متغير من الخلايا الأولية. حتى وقت قريب، واستخدمت الطرد المركزي عالية السرعة أو الكثافة Percoll تدرجات لعزل merozoites من supernatants ثقافة تمزق الثقافات المتقسمة. كانت هذه merozoites نادرا ما قابلة للحياة، وغالبا ما تتلاعب مزيدا من الكثافة الطرد المركزي ويغسل متعددة الخطوات من 12، أو 11 الحفظ بالتبريد قبل استخدامها في المقايسات. هذه بروكesses يحتمل فصل العديد من البروتينات المرتبطة محيطيا من سطح أقسومة والبروتينات المعروف أن أهداف الأنتيجين الحصانة ملاريا 13. مؤخرا السيستين مثبط البروتياز عبر Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 الغوانيدينو) البوتان (E64) وقد استخدمت لتوليد merozoites قابلة للحياة. E64 يمنع تمزق المتقسمة، وتوليد غشاء المغلقة merozoites 14، والتي يمكن أن تتعطل عن طريق الترشيح لتحرير merozoites قابلة للحياة 15 و 16. وقد تؤدي هذه التقنية إلى القرار المكانية من خلال العديد من البروتينات كرات الدم الحمراء الغزو 15، 17-19، وتوضيح تأثير مرحلة معينة من الأدوية المضادة للملاريا عدة 16 و 20. ومع ذلك، فإن جيل من merozoites قابلة للحياة لا يزال تحديا تقنيا. للمساعدة في نشر هذه التقنية وتطبيقها لالمقايسات الفنية الحصانة، بروتوكول مفصلة لتنقية أقسومة قابلة للحياة واستخدامها فييوصف التعاون الخلوية في طهاية والبلعمة هنا: مقايسة وظيفية موحدة من الأجسام المضادة. يوضح هذه التقنية تقدما كبيرا خلال فحوصات في المختبر السابقة من أقسومة طهاية، مثل انفجار العدلات الجهاز التنفسي، والأجسام المضادة التابعة الخلوية تثبيط (ADCI)، وفحوصات أقسومة البلعمة البديلة. هذه هي المقايسات استنساخه سيئة بسبب التباين في مدخلات الطفيلي ونشاط الخلايا البلعمية الابتدائي 11، 21. قد تلويث هيموزوين أيضا تؤثر تأثيرا عميقا بلعمية وظيفة 22. وذكرت مؤخرا قوية وقابلة للتكرار أقسومة البلعمة مقايسة 23 يستخدم خط الخلية promonocytic THP-1 24. هذا هو نوع من الخلايا مثالية لفحوصات التدفق الخلوي إنتاجية عالية كما هو غير ملتصقة ويؤدي FC-مستقبلات بوساطة البلعمة 25 و 26 على وجه التحديد. على تعقيد إضافي بينما التحرياتtigating البلعمة هو أن درجة البلعمة يعتمد على عدد من merozoites نسبة إلى THP-1 الخلايا وتركيز البلازما. لضمان استنساخ التجارب بين، merozoites يجب أن يكون تعداد وتركيز المعرفة المستخدمة. نظرا لصغر حجمها، وتدفق مطلوب الكمي cytometric. الإجراء الموضح هنا يزيل هيموزوين ويولد merozoites قابلة للحياة، ويصف تطبيق هذه merozoites لتدفق cytometric تعداد merozoites تليها طهاية والبلعمة. على الرغم من أن تطلبا من الناحية الفنية، والأساليب المذكورة قد تكون مفيدة في توضيح مساهمة استجابات الأجسام المضادة المحددة لسطح أقسومة المكتسبة طبيعيا واللقاح بفعل الحصانة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

المتصورة المنجلية مستضدات أقسومة قيد التطوير لقاحات الملاريا المحتملة. جانب واحد من الحصانة ضد الملاريا هو إزالة merozoites خالية من الدم من قبل خلايا البلعمة. ومع ذلك تقييم فعالية وظيفية معينة من الأجسام المضادة opsonizing أقسومة يمثل تحديا بسبب القصير نصف عمر merozoites وتباين الخلايا البلعمية الأولية. وصفت بالتفصيل في هذه الوثيقة هو وسيلة لتوليد merozoites قابلة للحياة باستخدام مثبط البروتياز E64، ومقايسة من أقسومة تعتمد طاهية-البلعمة باستخدام خط خلية موالية للالوحيدات THP-1. E64 يمنع تمزق المتقسمة بينما يسمح للتطوير merozoites التي تم إصدارها عن طريق الترشيح من schizonts المعالجة. وopsonized merozoites بروميد إيثيديوم المسمى مع عينات البلازما البشرية، وأضاف إلى THP-1 الخلايا. ويتم تقييم البلعمة بواسطة بروتوكول إنتاجية عالية موحدة. merozoites قابلة للحياة هي موردا قيما لتقييم NUMERجوانب من الأوس P. البيولوجيا المنجلية، بما في ذلك تقييم الوظيفة المناعية. وترتبط مستويات الأجسام المضادة يقاس هذا الاختبار مع الحصانة السريرية لمرض الملاريا في الأفراد المعرضين بشكل طبيعي. قد يكون الفحص أيضا من استخدام الأجسام المضادة لتقييم اللقاح التي يسببها.

مرحلة نضوج الطفيليات قبل العلاج E64 هو أمر حاسم لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. يبين الشكل 1Ai مرحلة النضج المناسبة من schizonts لإضافة E64. يجب أن تكون الطفيليات الكبيرة وملء ما يقرب من خلايا الدم الحمراء. A مظهر أرقط من بالغيمزا صمة عار يشير بدأت نماء جزئي، وينبغي أن يضاف E64 لانتاج merozoites المغلقة غشاء (الشكل 1Aii). إذا تم إضافة E64 في وقت سابق إلى أتروفة الطفيليات المرحلة، لا يتم إنشاء غشاء merozoites المغلقة حتى بعد 12 ساعة من E64. بدلا الطفيليات تأخذ على التشكل غير طبيعية مثل توسيع فجوة في الجهاز الهضمي (الشكل 1Bi و1Bii)، وليس تتشكل merozoites. إذا تم إضافة E64 في وقت لاحق إلى schizonts، لا يتم إنشاء merozoites المغلقة الغشاء كما هو يحتاطون المتقسمة تمزق (الشكل 1Ci و1Cii). مطلوب مستوى عال من الطفيليات التزامن، وغيرهاسيتبين الحكمة مجموعة من جميع النتائج الثلاث المذكورة بعد العلاج E64. إزالة هيموزوين هو خطوة حاسمة أخرى لتنقية merozoites. إذا لم يتم تنقيته من merozoites هيموزوين ثم تشكيل مجموعات-أقسومة هيموزوين التي لا يمكن فكها من قبل pipetting. هذه المجاميع تعمل على عداد الكريات كأحداث واحد، وإن كان ذلك مع مختلف الأمام ومبعثر والجانب مبعثر من الخصائص merozoites واحد، مما أدى إلى عد أقسومة غير دقيقة من قبل التدفق الخلوي (الشكل 2A). كما THP-1 الخلايا يمكن أيضا يبلعم هيموزوين، هذه المجموعات أقسومة-هيموزوين يمكن أيضا المبتلعة (الشكل 2B). هذه المجاميع هي الفلورسنت EtBr للغاية لأنها تحتوي على merozoites متعددة. البلعمة من نتائج المجاميع في THP-1 الشخصي EtBr مضان يعادل ذلك الذي لوحظ لالبلعمة من merozoites فردية متعددة. وبالتالي، إذا لم يتم إزالة هيموزوين، فإن مضان EtBr من THP-1 الخلايا يكون سverestimate من إمكانات لopsonizing البلازما التي يجري اختبارها. وتفيد التقارير أيضا إلى هيموزوين يغير كثيرا ظيفة بلعمية. هي ملطخة merozoites إيجابية GFP مواجهة مع EtBr لزيادة التصور من merozoites المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. باستخدام الظروف الموصوفة في هذا البروتوكول، وcounterstained جميع merozoites GFP إيجابية مع EtBr التي لديها كثافة مضان أكثر إشراقا (الشكل 3A). تقييم البلعمة من قبل EtBr مضان يتيح دقة فائقة من أقسومة البلعمة من GFP مضان (الشكل 3B). فإن عدد merozoites تضاف إلى فحص تعدل كمية البلعمة ملاحظتها. لهذا السبب، العد دقيقة بواسطة التدفق الخلوي أمر بالغ الأهمية. زيادة نسب merozoites: سوف THP-1 يؤدي إلى زيادة التزام merozoites لTHP-1 الخلايا في غياب البلازما (الشكل 4A). زيادة أقسومة: THP-1 نسب النتائج أيضا إلى زيادة درجة الحموضةردود agocytosis عندما يتم opsonized merozoites (الشكل 4B). 4:1 أقسومة: ينصح THP-1 نسبة للاستجابات أكلة قوية. باستخدام هذه النسبة، والتخفيف من البلازما المشار إليها، هذا الاختبار هو قادرة على حل مستويات منخفضة ومتوسطة وعالية من الأجسام المضادة opsonizing. وقد لوحظت بين 0 و 78 في المئة الردود البلعمة باستخدام PNG عينات البلازما وغيرها من الشروط وصفها. وتظهر هذه الاستجابات مؤخرا لاقترانه المكتسبة طبيعيا الحصانة السريرية لمرض الملاريا 10. ويبين الشكل 5 أمثلة من 4 الربعية الردود البلعمة من الأفراد PNG. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. توقيت E64 بالإضافة إلى ذلك أمر بالغ الأهمية لتوليد merozoites المغلقة الغشاء. (A) maturatio المناسبةلا يتم إنشاء ن مرحلة من الطفيليات ط) قبل العلاج E64، والثاني) merozoites المغلقة غشاء إنتاجها بعد 6 ساعة من العلاج E64 (B) غشاء merozoites المغلقة إذا تم إضافة E64 للطفيليات غير ناضجة؛ ط) النواشط المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 12 ساعة من E64 (لا تحول دون C) المتقسمة تمزق إذا تم إضافة E64 إلى أواخر schizonts مجزأة؛ ط) schizonts المرحلة المتأخرة، والثاني) بعد 6 ساعة من E64. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. إزالة هيموزوين أمر بالغ الأهمية لتوليد تعليق أقسومة وحيدة الخلية. الشكل المجاميع أقسومة-هيموزوين التالية الترشيح من الغشاء merozoites المغلقة، ما لم يتم فصل هيموزوين مغناطيسيا من merozoites. (A) إلى الأمام، مبعثر والجانبية مبعثر المؤامرات من merozoites مع هيموزوين إزالةواحتفظ هيموزوين. (B) المجاميع هيموزوين أقسومة يمكن المبتلعة من قبل THP-1 الخلايا. ملطخة فرق-خيارات الشرائح خلوي تدور من THP-1 الخلايا المحتضنة مع بابوا نيو غينيا البلازما opsonized الاستعدادات أقسومة مع أو بدون هيموزوين. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. يسمح إيثيديوم بروميد تلطيخ لدقة فائقة من أقسومة البلعمة. يتم counterstained D10-GFP merozoites المنقى مع EtBr لتحسين كثافة مضان (أ) التدفق الخلوي histrogram من merozoites المنقى مع تبوب على merozoites إيجابية GFP، وصمة عار نقطة تظهر EtBr مضان GFP في هذا مسور السكان إيجابية. (B) مبعثر إلى الأمام مقابل GFP ومبعثر إلى الأمام مقابل EtBr من THP-1 خلايا البلعمة التالية من GFP وEtBr merozoites الفلورسنت مزدوجة. ود بوابات<html> rawn استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4 أقسومة: THP-1 نسبة يؤثر على درجة من البلعمة ملاحظتها. (أ) خمسة أقسومة: وصفت THP-1 النسب؛ 50:1، 20:01، 10:01، 04:01، 1:1. الخلايا السيطرة فقط يشير مضان الخلفية بسبب THP-1 الخلايا. يشار THP-1 EtBr مضان لكل نسبة لmerozoites opsonized مع مجموعة من PNG البلازما أو البلازما مع الاسترالي nonimmune (B) متوسط ​​كثافة مضان THP-1 للخلايا أقسومة مختلفة:. THP-1 النسب، و opsonization مع بركة من PNG البلازما أو البلازما الاسترالية nonimmune (يعني + ووزارة شؤون المرأة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. هناك مجموعة كبيرة من الأجسام المضادة opsonizing يمكن قياسها. تم opsonized Merozoites مع البلازما من الأفراد PNG وحضنت مع THP-1 الخلايا. يتم عرض أربعة ردود البلعمة ممثل. ووضعت بوابات استنادا إلى خلايا THP-1 مع merozoites وأي سيطرة البلازما، والأرقام تشير إلى البلعمة٪ بعد الطرح من الخلايا THP-1 مع التحكم في البلازما غير المناعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

قياس وظيفة الأجسام المضادة هو المفتاح لفهم حصانة لالملاريا المنجلية. يصف هذا الأسلوب تنقية merozoites قابلة للحياة، وقياس تعتمد على طهاية البلعمة من قبل التدفق الخلوي.

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.8K Views.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  قياس وظيفة الأجسام المضادة هو المفتاح لفهم حصانة لالملاريا المنجلية. يصف هذا الأسلوب تنقية merozoites قابلة للحياة، وقياس تعتمد على طهاية البلعمة من قبل التدفق الخلوي. 

Video: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...