Os autores gostariam de reconhecer as crianças e os dadores de plasma de adultos, e os funcionários da Papua Nova Guiné Instituto de Pesquisa Médica. Os autores gostariam de agradecer a Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller e Diana S Hansen por sua contribuição para o desenvolvimento desta técnica, e agradecer o australiano da cruz vermelha por pacotes de sangue e soro. Este trabalho foi possível graças vitoriana Governo do Estado Operacional de Apoio Infra-estrutura e Australian Government NHMRC IRIISS. Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council concede # 1031212 e # 637406, e os Institutos Nacionais de Saúde concessão # AI089686.

Nota: Todos os passos de, para além da centrifugação e a citometria de fluxo, deve ser realizada dentro de uma câmara de fluxo laminar, para manter a esterilidade. Assegurar as devidas precauções sejam tomadas em relação a manipulação de amostras humanas. O ensaio é muito sensível para pequenas quantidades de plasma. As diluições fornecidas são ideais para a resolução de respostas que vão 5-78% com plasma de crianças semi-imunes de Papua Nova Guiné (PNG). A diluição ideal pode variar com aparelhos de plasma a ser testado e, portanto, recomenda-se que o plasma ser titulada para determinar as condições experimentais para cada aplicação. Garantir a inclusão de dois controles negativos células THP-1 com merozoites na ausência de plasma; e células THP-1 com merozoites opsonizadas com um pool de plasma de malária indivíduos ingênuos. Isto irá permitir um controlo para a adesão dos merozoítos para células THP-1 e para permitir rigorosa gating citometria de fluxo de eventos de fagocitose. O uso de amostras de plasma foi PNGaprovado pelo Comitê Consultivo de Pesquisa Médica, Papua Nova Guiné Ministério da Saúde, o Walter e Eliza Hall Institute Comitê de Ética em Pesquisa Humana (número do projeto 04/04). Foi obtido consentimento escrito dos pais / encarregados de educação de todos os participantes. 1. THP-1 Cultura <ol><li> Manter a linha celular monocitica humana THP-1 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 médio) e a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 umidificada. </li><li> Manter as células a uma densidade inferior a 5 x 10 5 células / ml. NOTA: Supercrescimento irá resultar em diferenciação em células aderentes e infra-regulação de receptores Fc. Uma vez que as células foram passadas a aproximadamente 10 vezes, descongelar um frasco novo para manter o fenótipo da célula. </li></ol> 2. Preparação de Amostras de anticorpos e de diluição <ol><li> Calor plasma inativar a ser testado e plasma controle da malária ingênuo por incubação a 56 °; C durante 30 min </li><li> Diluir em série de amostras de plasma a 1/2, 000, em células THP-1 de gama média. </li><li> Plasma loja diluída a -20 ° C. </li></ol> 3. Cultura de Altamente Sincronizado P. falciparum NOTA: A linha parasita expressando GFP-D10-PfPHG 27 foi utilizado devido ao seu ciclo de vida de 48 horas, que auxilia a sincronização de parasitas eo momento controlada de E64 disso. Além disso, porque esta linha expressa GFP no citosol, esta linha permite a detecção de parasitemia e merozoitos livres por citometria de fluxo, detecção de GFP. No entanto, a intensidade de fluorescência da GFP não é suficiente para proporcionar a visualização no interior de células THP-1, e, portanto, os merozoítos são contrastadas com brometo de etídio (EtBr). Outras estirpes do parasita podem ser utilizados, desde que a sincronia apertado é realizável. Sincronizar parasitas utilizando uma combinação de tratamento de sorbitol para lisar as formas maduras de 28 e heparina para inibir a invasão 15 </sup&gt;. <ol><li> Manter P. falciparum parasitas em O + eritrócitos humanos (RBC) em 3% de hematócrito em meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 10% de soro humano, 2 mg / bicarbonato de sódio ml, e 20 ug / ml de gentamicina (meio parasita). Adicionam-se 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloreto ao meio de cultura para seleccionar para GFP + parasitas. </li><li> Incubar as culturas em caixas estanques ou frascos de cultura, alternativamente dupla selados a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2. </li><li> Prepare esfregaço finas, fixar em 100% de metanol durante 10 segundos, e a mancha com uma solução de 10% de Giemsa em 6,7 mM (pH 7,1), tampão fosfato (solução de Giemsa) durante 10 minutos para monitorar a parasitemia. Após a coloração, lavar com água e ar seco. Avaliar a parasitemia usando uma lente de imersão em óleo de 100X. </li><li> Manter culturas de parasitas em uma parasitemia abaixo de 5% RBC infectado dividindo culturas e adicionando não infectadoRBC, conforme necessário. </li><li> Para sincronizar com heparina, adicionar 20 UI / ml de heparina de grau médico para tocar em estágio culturas. </li><li> Quando a maioria dos parasitas estão na fase de esquizonte, células de pelotas a 300 xg durante 5 min, remove-contendo heparina de médio e ressuspender em meio de parasita para permitir a ruptura esquizonte e merozóito invasão. </li><li> Depois de 4 horas, adicionar 20 UI / ml de heparina de volta para as culturas, bloqueando qualquer outra invasão merozoite. NOTA: Vários ciclos de sorbitol e de tratamento de heparina pode ser necessária antes de parasitas são suficientemente sincronizada. Para gerar números adequados de merozoítos, preparar 150 ml de cultura parasita a 3 - 5% parasitemia. </li></ol> 4. Isolamento de Final Stage P. falciparum Trofozoítos <ol><li> Trinta e seis horas após o retorno da heparina para culturas, sedimentar as células cultivadas a 300 xg durante 5 min, e ressuspender em meio de pelota do parasita a 25% hematócrito. </li><li> Anexar uma grande coluna magnética (volume de matriz de 6,3ml) para um íman, e equilibrar a coluna com meio de parasita, certificando-se de que todas as bolhas de ar são removidas. </li><li> Adicionar o P. ressuspensas cultura falciparum para a coluna, e ajustar a taxa de fluxo de uma gota por segundo. </li><li> Uma vez que a cultura foi passado através da coluna, lava-se a coluna com meio parasita até que o fluxo de passagem corre claro. </li><li> Eluir parasitas a partir da coluna em 30 ml de 37 ° C meio parasita. </li><li> Preparar um esfregaço fino de parasitas, fixar em 100% de metanol por 10 segundos, e manchar com solução Giemsa por 3 min. Examine a lâmina sob o microscópio, e garantir que os parasitas quase encher o glóbulo vermelho, e parece estar em estágios iniciais esquizontes. Se os parasitas não tenham atingido a fase de maturação apropriado, retornar parasitas purificados para uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 1% de O2, 4% de CO2 e 95% de N2 até desenvolvido adequadamente. NOTA: pureza superior a 90% de células vermelhas do sangue infectados é necessária para assegurar a RBCs não contaminam preparações merozoite. </li><li> Tratar esquizontes isolado com 10 uM E64 (epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) para 6-10 h NOTA:. Tempos de incubação mais longos com E64 é possível, no entanto, os merozoítos produzidos deixará de ser invasivo. </li></ol> 5. Isolamento de P. falciparum Merozoítos <ol><li> Após a incubação com E64, esfregaço parasitas, fixar as células em 100% de metanol, e a mancha com solução Giemsa para avaliar a formação de merozoítos fechado por uma membrana. NOTA: Um bom rendimento de merozoites será obtida se for maior que 50% dos parasitas formaram membrana merozoites fechados. </li><li> Pellet E64 tratados esquizontes a 1.900 xg por 8 min. Lava-se com 50 ml de RT meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sódio, e 20 ug / ml de gentamicina (meio de lavagem) para remover o restante do soro humano . </li><li> Ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de lavagem. NOTA: Usando FCS contendo meio THP-1 vai produzir espuma durante a filtração. </li><li> Filtrar os 2 ml de ressuspensos E64-esquizontes através de um filtro de seringa de 1,2 mm μm/32. Recolhe-se o filtrado em um tubo de 10 ml. NOTA: O filtrado contém merozoites e cristais hemozoína, com esquizontes rompeu-un e detritos coletados no filtro. </li><li> Coloque uma pequena coluna magnético de um ímã, e equilibrar com 500 mL THP-1 médio. </li><li> Passa-se o filtrado sobre a coluna magnética. Recolhe-se o fluxo de passagem. NOTA: hemozoin ligarão à coluna, enquanto merozoítos vai passar. </li><li> Passar o fluxo de passagem através da coluna mais duas vezes para remover hemozoína, recolhendo o fluxo através de cada vez. </li><li> Lavar a coluna com 2 ml de RT THP-1 médio de recolher quaisquer merozoites restantes. </li><li> Adicionar EtBr em 10 ug / ml (concentração final) e mancha durante 30 min à temperatura ambiente. Proteger da luz para evitar a fotodegradação. Nota: Certifique-se que todo o líquido e p EtBr contaminadoresíduos lastic é descartado de forma adequada para produtos químicos citotóxicos. Merozoítos já não são invasivos seguir a esta incubação. </li><li> Girar merozoites a 4.000 g durante 10 min. </li><li> Elimine o sobrenadante para um recipiente adequado de lixo. </li><li> Ressuspender merozoite sedimento em 4 ml de THP-1 médio, e girar para baixo a 4.000 g durante 10 min. </li><li> Adicionar THP-1 médio até um volume de 15 ml, e proteger da luz. </li></ol> 6. Quantificação Merozoito Concentração por Citometria de Fluxo <ol><li> Traga contando grânulos para a TA. </li><li> Prepare PBS com 0,5% de BSA para diluir merozoites. </li><li> Contagem merozóitos em 3 diluições; 1 em 100; 1 em 50 e 1 em 25. Preparar tubos de FACS com 3 940, 930 e 910 ul de PBS, 0,5% de BSA, respectivamente. Adiciona-se 10, 20 e 40 ul de merozoítos purificados por tubo, respectivamente. </li><li> Pérolas de contagem Vortex durante 30 segundos, e adicionar 50 ul de esferas por tubo de FACS contendo merozoítos diluído. </li><li> Execute o três dilamostras merozoite buído num citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Definir um portão rigorosas para merozoítos baseados em EtBr e a fluorescência de GFP dupla fluorescência, e os grânulos de contagem de porta por meio de fluorescência de um canal separado. Adquirir eventos até 2.000 contas são coletados. Nota: Estas instruções referem-se a contagem de GFP + merozoites que foram contra-corados com EtBr. Se não utilizando GFP expressando parasitas então fixados portões merozoite com base em dispersão lateral e EtBr fluorescência. </li><li> Determinar a proporção de merozoítos: grânulos, dividindo o número de eventos de merozoítos por contagem dos 2.000 eventos talão, calcular uma proporção para cada diluição. Utilize as especificações de lote contagem de contas para determinar o número de contas na década de 50 mL de contas adicionadas por tubo. </li><li> Multiplique o número de contas em 50 ul pelo fator de diluição e pelo merozoite: relação talão para que o fator de diluição. Este número é igual à concentração de merozoítos por ml. Realize ªese de passos para cada diluição. </li><li> Calcular a média dos concentrações merozoite medidos nas três diluições. NOTA: Os desvios padrão acima de 10% para as concentrações determinadas para 1 em 100, 1 em 50 e 1 em 25 diluições indicam imprecisões técnicas na preparação de amostras de contagem. </li><li> Ressuspender merozóitos em 8 x 10 6 / ml em merozóitos de THP-1, meio para assegurar uma razão final de quatro merozoítos por THP-1 celular. Nota: Outras merozoite para THP-1 índices podem ser usados, e as concentrações devem ser alterados em conformidade. </li></ol> 7. Fagocitose Ensaio <ol><li> Adicionar 200 mL de calor FCS inativos por poço de placas de 96 poços de fundo em U, e deixar à temperatura ambiente O / N para bloquear placas. Após a incubação, remove FCS e lavar os poços duas vezes com 200 ul de PBS estéril. Remover PBS e armazenar as placas a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Calcular o número de células THP-1 necessários para a análise de amostras de plasma e controlos, permitindo poços em triplicado por amostra a 1 x 10 <sup&gt; 5 células THP-1 por poço. </li><li> Determinar a concentração de THP-1 de cultura através do carregamento de 10 uL de cultura em que um slide de hemocitómetro. Contar o número de células presente em 4 conjuntos de 16 esquinas do hemocitómetro sob um microscópio, em seguida, calcular a média das contagens. Multiplicar a contagem média de 10.000 para calcular o número de células por ml. </li><li> Girar o número necessário de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, e ressuspender em 6,7 x 10 5 células / ml em meio de THP-1. </li><li> Adicionar 150 ul de células THP-1 em células THP-1 por meio de um poço de FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U, o que resulta em 10 5 células / poço. Preparar 3 poços por exemplo que irá ser testada. Retornar placa para incubadora até que esteja pronto para adicionar merozoites. </li><li> Adicionar 150 ul de preparação de merozoíto de 8 x 10 6 / ml por poço para uma FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U separados. Prepare um bem por amostra testada </li><li> Adicionar 10 pi de amostras de plasma diluídas preparadas por poço, para tele placa que contém os merozoítos, e misture bem para garantir a solução homogénea. </li><li> Remova a placa de células THP-1 a partir do incubador, e adicionar 50 ul da solução de merozoítos / plasma por poço contendo células THP-1, com cavidades triplicadas por amostra de plasma. </li><li> Misturar bem e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2, incubadora humidificada, durante 40 min. Cubra com papel alumínio para proteger da luz. </li><li> Após 40 min, as amostras de centrifugação por 5 minutos a 500 xg de um pré-arrefecido a 4 ° C centrífuga para prender a fagocitose. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes em PBS gelado 0,5% BSA EDTA 2 mM (tampão FACS). NOTA: EDTA vai facilitar a manutenção de uma suspensão de células individuais por citometria de fluxo. </li><li> Fix células em 90 ul de 2% de paraformaldeído (PFA) em PBS +0,5% de BSA EDTA 2 mM (FACS fixador). Deixar em gelo até à aquisição, protegido da luz. </li></ol> 8. Citometria de Fluxo <ol><li> Adquirir amostras usando um citômetro de fluxo wi equipadoth um laser de 488 nm e alta taxa de transferência de anexo leitor de placas. NOTA: Este vai permitir que até 400 amostras de plasma para ser testada de uma preparação de merozóito. As células também podem ser transferidas para os tubos de amostra manual de carregamento. </li><li> Portão viáveis ​​células THP-1 de frente e dispersão lateral. </li><li> Defina o portão positivo EtBr com base nos &#39;células THP-1 com merozoites e sem plasma&#39; controle. </li><li> Adquirir um mínimo de 10.000 eventos por amostra. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Analisar dados por citometria de fluxo de software de análise e defina portões rigorosos para eventos positivos EtBr. </li><li> Calcule a porcentagem de fagocitose para cada amostra: a% de células ETBR + para a amostra menos as células positivas% com plasma não imune. </li><li> Os resultados médios em todo triplicatas. NOTA: Os desvios padrão para a triplicado em excesso de 10% indicam imprecisões experimentais. Alguns fundo eventos EtBr positivos podem ser observados como resultado de merozoite a adesão à superfície de células THP-1, mas deve ser consistente entre todas as amostras contendo os merozoítos. Definir a porta com base nos &#39;células THP-1 com e sem plasma merozoites&#39; controle e, em seguida subtraindo qualquer fundo das &quot;células THP-1 com os não-imune plasma&quot; controle resultará em fagocitose% que reflete a fluorescência devido a internalizada / fagocitado apenas merozoites. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. 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E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para medir merozoite fagocitose, a proficiência em duas técnicas é necessária: Purificação de merozoítos e THP-1 ensaio fagocitose. Os passos mais críticos para combinar estas duas técnicas são: 1) parasitas altamente sincronizadas; 2) Adicionando E64 no tempo correto para produzir membranas merozoites fechados; 3) A remoção hemozoin para evitar agregados; 4) contagem merozoite precisa por citometria de fluxo; 5) a diluição de plasma utilizado; e 6) mantendo baixa densidade celular e o número de passagem das células THP-1. Uma análise cuidadosa desses aspectos-chave irá garantir respostas fagocitose robustos são observados. Embora, aqui descrita é a preparação de merozoítos para avaliar a fagocitose, a técnica pode ser utilizada para uma vasta gama de aplicações. Independentemente da metodologia de fluxo baixo, preparações merozoite ideais dependem de cronometrar corretamente E64 disso, a fim de gerar merozoites. O método descrito aqui E64 demonstrou yield merozoites invasivos para uso em microscopia de alta resolução de ocorrências de invasão e ensaios de sensibilidade a drogas 15-20. Enquanto viabilidade merozoíta não é essencial para a fagocitose, é necessária a integridade do revestimento de superfície do merozoito. Portanto, o método descrito aqui E64 permite merozoites alta qualidade a ser produzido para avaliar as respostas de anticorpos ao revestimento de superfície. Conforme descrito na Figura 1, se E64 é adicionado demasiado cedo ou membrana merozoítos fechados demasiado tarde não são formados. Por esta razão, as culturas de parasitas altamente síncronos são necessários. Aqui, a utilização de tratamentos de sorbitol e de heparina para sincronizar firmemente D10-GFP culturas de parasitas para uma janela de 2 horas é descrita. A heparina pode promover gametocytogenesis em outro laboratório isola, e, portanto, deve ser usado com cuidado. Também podem ser utilizados métodos alternativos de sincronização, tais como alanina, desde que os parasitas fortemente sincronizadas são produzidos 29. Se E64 é adicionado parasitas assíncronos, um suporte inferiorortion de merozoites fechado à membrana será produzido e restante parasita-infectados RBC será ou ruptura normalmente ou desenvolver morfologia anormal. A presença de parasitas que não foram desenvolvidos em membrana fechada merozoítos irá resultar em entupimento do filtro e reduzir significativamente o rendimento do merozoito obtido. Durante a filtração de merozoites fechado por uma membrana, hemozoin é liberada dos vacúolos digestivos e está presente como cristais livres em solução. Hemozoína é altamente pró-inflamatória e tem sido relatado para modular monócitos e macrófagos fagocitose respostas 30, 31. Além disso a modulação da fagocitose, como mostrado na Figura 2, hemozoína pode formar agregados com merozóitos em solução. Como células THP-1 pode fagocitar estes agregados, este pode ser um importante confundindo a resolução de fagocitose mediada por anticorpo. Portanto, a remoção de hemozoína é necessário neste ensaio para avcomplexidade adicional oid de hemozoin sobre a biologia dos fagócitos. Além disso, a incapacidade de remover hemozoína também pode ser prejudicial ao utilizar esta técnica para gerar merozoitos livres para outras aplicações, especialmente, onde é necessária uma quantificação merozóito. Conforme descrito na Figura 4, o número de merozoítos adicionado ao ensaio pode influenciar o grau de fagocitose por células THP-1. Apesar de citometria de fluxo permite a enumeração de concentração merozoite, pipetagem cuidadosa e replicar acusações de merozoítos são necessárias para melhorar a precisão. Isto é especialmente crítico se várias linhas de parasitas devem ser testados side-by-side. Foi previamente demonstrado que o plasma de crianças semi-imunes de PNG pode ser diluída antes de respostas significativamente diminuir 23. Aqui descrita é a diluição óptima de plasma (1/120, 000 da diluição final do plasma) para um grupo de 5 - 12 anos de idade crianças PNG que produziu a grande gama de phagocyt. respostas Osis descritos na Figura 5 Este intervalo permitido para a estratificação de respostas em quatro grupos (0 - 19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% de fagocitose) e modelagem de regressão revelou que as respostas foram associadas com opsonizantes protecção contra a doença clínica e a parasitemia de alta densidade 10 Para coorte diferentes estudos pode ser necessário ajustar a diluição de plasma para garantir que a fagocitose por células THP-1 não está saturado ou abaixo do nível de detecção. A citometria de fluxo permite a fagocitose rápido e quantificável com maior precisão sobre microscopia. Este protocolo é uma alta taxa de transferência, placa de base e aquisição de placas de 96 poços para estudar a imunidade humoral adquirida naturalmente automatizado. O método requer a coloração de merozoítos com brometo de etídio, corantes de ADN entretanto alternativos tais como SYBRgreen, DAPI e propídio iodo, manchas ou nódoas de proteínas de membrana pode ser utilizado. Este ensaio seria passível de primarmonócitos ou neutrófilos y, e poderia ser adaptada se fagócitos ou biologia FcR era de interesse. As células primárias ou células THP-1 diferenciadas com PMA in vitro podem ser usadas para estudar a fagocitose em malária e outros agentes patogénicos 12, 32-34. No entanto, utilizando células primárias pode ser um desafio uma vez que estas células são aderentes e também exibir não mediada por anticorpos fagocitose 35. Além disso, a variabilidade em pureza, viabilidade e a funcionalidade de algumas limitações importantes para a utilização de células fagocíticas primárias. Os receptores Fc envolvidos na fagocitose merozoite permanecer descaracterizados e, portanto, usando anticorpos bloqueadores de receptores Fc específicos poderiam elucidar a contribuição de cada Fc Receptor para merozoite fagocitose. Como THP-1 fagocitose é FcR dependente, o que permite a interpretação direta da fagocitose observado. Este ensaio também se presta a abordar a especificidade do antígeno opsonizante anticorpos que podem ser atingidos por utilnalizar parasitas knock-out para antígenos de superfície merozoite, ou utilizando anticorpos humanos purificados de afinidade para merozoite proteínas de superfície. Além disso, em estudos aprofundados de respostas de citocinas seguintes merozoíta fagocitose está ausente, e pode ser alcançada com este ensaio. Estas duas técnicas constituem avanços consideráveis ​​para o estudo de anticorpos antimerozoite funcionais. A purificação dos merozoitos alta qualidade é vantajoso utilizar merozoítos criopreservado, ou microesferas fluorescentes revestidas com os antigénios merozoite. Embora este ensaio tem sido usado como uma ferramenta para avaliar a imunidade adquirida naturalmente, pode ser uma ferramenta importante para tratar a aquisição de imunidade em resposta à vacinação. Embora tenha sido recentemente demonstrado que a fagocitose ou merozoitos opsonizado está relacionado com a protecção contra a malária clínica, não é possível tirar conclusões a partir directas in vitro de THP-1 para a fagocitose in vivo phagocytosis de merozoítos como fagocitose no ensaio ocorre sob condições estáticas e na ausência de células vermelhas do sangue competem. Os possíveis adaptações deste ensaio podem, assim, proporcionar uma ferramenta versátil para uma maior compreensão da malária e merozoite fagocitose.

A importância de anticorpos para a imunidade ao Plasmodium falciparum da malária foi mostrado há 40 anos, quando imunoglobulina dos adultos hiperimunes foi passivamente transferidos para crianças que sofrem de malária grave, resultando em doença aliviada 1. Consequentemente, um esforço considerável tem procurado identificar alvos de imunidade protetora da malária, principalmente por meio de realização da sorologia para peptídeos ou proteínas expressas por bactérias ELISA. Sorologia ELISA baseado também provou altamente variável entre os estudos, e não trata a funcionalidade do anticorpo 2. Muitos antigénios de malária induzir uma IgG1 e IgG3 citofílico perfil de anticorpos, particularmente antigénios de superfície merozoite 3. Esse viés subclasse sugere que-Fc-receptor de anticorpos (CA) interações com os fagócitos são importantes para as funções efetoras da opsonizante anticorpos antimerozoite 4. Várias vacinas antígeno merozoite em desenvolvimento são projetados paraprovocar funções efetoras fagócitos 5, 6 e embora exista evidência significativa para a importância das interações anticorpo-TFR em modelos de roedores malária 7-9, e alguns estudos recentes reforçam a importância de anticorpos funcionais e funções dos fagócitos efetoras de imunidade à malária em seres humanos 10, 11, esta área continua a ser pouco estudado. Estudo em anticorpos opsonizantes específicos merozoite tem sido limitada por dois factores; a dificuldade de isolar merozóitos de boa qualidade; e respostas fagocitose variáveis ​​de células primárias. Até recentemente, a centrifugação de alta velocidade ou de densidade de Percoll gradientes foram utilizados para isolar a partir de sobrenadantes de cultura de merozóitos de ruptura culturas esquizontes. Estes merozóitos eram raramente viável, e muitas vezes ainda manipulados por centrifugação de densidade e de lavagem múltiplos passos 12, 11 ou criopreservação antes da utilização em ensaios. Estes proccessos potencialmente separar muitas proteínas associadas perifericamente a partir da superfície do merozoíto, proteínas conhecidas para ser alvos antigénicos de imunidade malárico 13. Recentemente, o inibidor de protease de cisteína trans-epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) foi usado para gerar merozoítos viáveis. E64 impede ruptura esquizonte, os merozoítos gerando membrana fechada 14, que pode ser interrompido por meio de filtração para libertar merozoítos viáveis ​​15, 16. Esta técnica levou à resolução espacial de numerosas proteínas durante a invasão de eritrócitos 15, 17-19 e esclareceu o efeito específico palco de vários medicamentos antimaláricos 16, 20. No entanto, a geração de merozoítos viáveis ​​permanece um desafio técnico. Para ajudar na divulgação desta técnica e aplicação de testes funcionais da imunidade, um protocolo detalhado para a purificação merozoite viável e seu uso em umensaio funcional padronizado de anticorpo: cooperação celular em opsonização e fagocitose é descrito aqui. Esta técnica demonstra um avanço significativo sobre os ensaios anteriores in vitro de merozoíto opsonização, como a explosão respiratória dos neutrófilos, Antibody Dependent Cellular Inibição (ADCI), e ensaios de fagocitose de merozoítos alternativos. Estes ensaios são pouco reprodutível devido à variação dos insumos do parasita ea atividade das células fagocíticas primários 11, 21. Contaminando hemozoin também pode afetar profundamente a função fagocitária 22. Um ensaio de merozoítos fagocitose robusto e reprodutível recentemente relatado 23 utiliza a linha de células promonocíticas THP-1 24. Este é um tipo de célula ideais para ensaios de citometria de fluxo de alto rendimento, uma vez que é não-aderente e, especificamente, realiza Fc-Receptor fagocitose mediada por 25, 26. Uma complexidade adicional, enquanto investidorestigating fagocitose é que o grau de fagocitose está dependente do número de merozoítos relativos a células THP-1 e de concentração de plasma. Para garantir a reprodutibilidade entre experimentos, merozoites devem ser enumeradas e uma concentração definida usado. Devido ao seu pequeno tamanho, por citometria de fluxo de quantificação é necessária. O procedimento aqui descrito remove hemozoína e gera merozoítos viáveis, e descreve a aplicação desses merozoítos por citometria de fluxo de enumeração de merozoítos seguido por opsonização e fagocitose. Embora tecnicamente exigente, as técnicas descritas podem ser úteis para elucidar a contribuição de respostas de anticorpos específicos de superfície merozoite a adquirida naturalmente e vacina induziu imunidade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Antígenos merozoite Plasmodium falciparum estão em desenvolvimento como potenciais vacinas contra a malária. Um aspecto da imunidade contra a malária é a remoção de merozoitos livres do sangue pelas células fagocíticas. No entanto a avaliação da eficácia funcional dos anticorpos opsonizantes específicos merozoite é difícil, devido à meia-vida curta de merozoítos e a variabilidade de células fagocíticas primárias. Aqui descrito em pormenor um método para a geração de merozoítos viáveis ​​utilizando o inibidor de protease E64, e um ensaio de fagocitose dos merozoítos opsonina-dependente utilizando a linha de células pró-monocítica THP-1. E64 impede ruptura esquizonte, permitindo o desenvolvimento de merozoítos que são liberados por filtração de esquizontes tratados. Merozoítos brometo de etídio marcadas são opsonizadas com amostras de plasma humano e adicionados a células THP-1. A fagocitose é avaliada por um protocolo de alto rendimento padronizado. Merozoites viáveis ​​são um recurso valioso para a avaliação numeraspectos ous de P. biologia falciparum, incluindo a avaliação da função imunológica. Os níveis de anticorpos medidos por este ensaio estão associados com a imunidade à malária clínica em indivíduos naturalmente expostos. O ensaio pode também ser usado para avaliar a vacina induziu anticorpos.

O estádio de maturação dos parasitas antes do tratamento E64 é fundamental para a geração de merozoítos fechado à membrana. 1ai Figura mostra o estágio de maturação adequado de esquizontes para adicionar E64. Os parasitas devem ser grandes e quase encher o glóbulo vermelho. Um aspecto manchado de Giemsa indica merogonia tenha iniciado, e E64 deve ser adicionada para se obter merozoítos fechado por uma membrana (Figura 1Aii). Se E64 é adicionado anteriormente para trofozoíto parasitas palco, membrana merozoites fechados não são gerados, mesmo depois de 12 horas de E64. Em vez parasitas assumir morfologia anormal, tal como o alargamento do vacúolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoitos não são formados. Se E64 é adicionado mais tarde para esquizontes, merozoites fechado à membrana não são gerados como ruptura esquizonte é desinibida (Figura 1CI e 1Cii). É necessário um alto nível de parasita sincronia, outrosábio uma gama de todos os três resultados descritos será visto após o tratamento E64. Remoção de hemozoin é mais um passo crítico para merozoites de purificação. Se não merozoítos são purificados a partir hemozoína seguida aglomerados merozoite-hemozoína formar o que não pode ser desalojado por pipetagem. Estes agregados executado no citômetro como eventos isolados, embora com características diferentes para a frente-de dispersão e de lado de dispersão do que merozoites individuais, resultando em contagem merozoite imprecisa por citometria de fluxo (Figura 2A). Como células THP-1, também podem fagocitar hemozoína, estes aglomerados de merozoítos-hemozoin também pode ser fagocitado (Figura 2B). Estes agregados são fluorescentes altamente EtBr, pois contêm vários merozoítos. A fagocitose dos agregados resulta em células THP-1 de perfil EtBr fluorescência equivalente à observada para a fagocitose de múltiplos merozoítos individuais. Assim, se hemozoína não for removido, a fluorescência do EtBr células THP-1 será um overestimate do potencial de opsonização do plasma testada. Hemozoína também é relatado para alterar significativamente a função dos fagócitos. GFP positivas merozoítos são contra-coradas com EtBr para aumentar a visualização dos merozoítos fagocitose por células THP-1. Usando as condições descritas no presente protocolo, todos os merozoítos GFP positivas são contrastadas com EtBr, que tem uma intensidade de fluorescência mais brilhante (Figura 3A). Avaliação de fagocitose por EtBr fluorescência permite uma resolução superior de merozoíto fagocitose de fluorescência da GFP (Figura 3B). O número de merozoítos adicionadas ao ensaio irá modular a quantidade de fagocitose observada. Por esta razão, uma contagem precisa por citometria de fluxo é crítica. Aumentando rácios de merozoítos: THP-1 vai resultar num aumento da adesão de merozoítos para células THP-1 na ausência de plasma (Figura 4A). Aumentar merozoite: THP-1 índices também resulta em aumento do pHrespostas agocytosis quando merozoítas opsonizado (Figura 4B). Um 04:01 merozoíta: THP-1 rácio é recomendado para respostas fagocíticas robustos. Usando esta relação, e a diluição de plasma indicado, este ensaio é capaz de resolver baixas, intermediárias e níveis elevados de anticorpos opsonizantes. Entre 0 e 78 por cento de fagocitose respostas foram observadas em amostras de plasma PNG e as outras condições descritas. Tais respostas foram recentemente mostrado a associar com imunidade clínica adquirida naturalmente à malária 10. Figura 5 mostra exemplos dos quatro quartis de respostas fagocitose de indivíduos PNG. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Sincronismo de E64 disso é crítico para a geração de merozoítos fechado por uma membrana. (A) maturatio Apropriada. fase de parasitas n i) antes do tratamento E64, e ii) merozoites fechado à membrana produzidos após 6 horas de tratamento E64 (B) membrana merozoites fechados não são gerados se E64 é adicionado parasitas imaturos; i) trofozoítos fase tardia, e ii) após 12 horas de E64 (C) esquizontes ruptura não é inibido se E64 é adicionado ao final segmentado esquizontes.; i) esquizontes fase tardia, e ii) após 6 horas de E64. A barra de escala representa 10 um. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Remoção hemozoin Figura 2. Crítico é para gerar uma suspensão de uma única célula de merozoíto. Agregados Merozoito-hemozoin formulário seguinte de filtração de membrana merozoítos fechados, a menos que hemozoína está magneticamente separada do merozoitos. (A) de avanço-dispersão e de lado de dispersão de parcelas com merozoítos hemozoin removidoe hemozoína retido. (B) agregados hemozoin-merozóito podem ser fagocitados pelas células THP-1. Coradas Diff-Quick lâminas cito-rotação de células THP-1 foram incubadas com plasma opsonizado PNG preparações merozoite com ou sem hemozoína. A barra de escala representa 10 um. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Coloração de brometo de etídio permite a resolução superior de merozoite fagocitose. D10-GFP merozoítos purificadas são contrastado com EtBr para melhorar a intensidade de fluorescência. (A) A citometria de fluxo histograma de merozoítos purificadas com gating em GFP merozoites positivos e um dot blot mostrando EtBr fluorescência dentro desta população positiva GFP fechado. (B) dispersão para a frente contra a GFP e dispersão para a frente contra EtBr de células THP-1 na sequência de fagocitose de GFP e EtBr merozoítos fluorescentes duplas. Portões foram d<html> rawn com base nas células THP-1 com merozoítos e sem controlo de plasma. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> A Figura 4 A merozoíta:. THP-1 rácio influencia o grau de fagocitose observada. (A) Cinco merozoite: THP-1 índices são retratados; 50:1, 20:1, 10:1, 04:01, 01:01. Células único controle indica fluorescência de fundo devido a células THP-1. THP-1 de fluorescência EtBr para cada relação é indicado para merozoítos opsonizadas com um pool de plasma PNG ou com plasma australiano não imune (B) Média da intensidade de fluorescência de células THP-1 para merozoíta diferente:. THP-1, as proporções, e opsonização com uma piscina de plasma PNG ou plasma australiano não imune (média + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Uma grande variedade de anticorpos opsonizantes pode ser medido. Merozoítos foram opsonizado com plasma de indivíduos PNG e incubadas com células THP-1. Quatro respostas fagocitose representativos são mostrados. Portões foram desenhadas com base nas células THP-1 com merozoites e sem controle de plasma, e os números indicam a fagocitose% após subtracção das células THP-1 com controle de plasma não imune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.8K visualizações.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo. 

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrócitos&gt; infectados em uma configuração com poucos recursos

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...