Авторы хотели бы выразить признательность детей и взрослых доноров плазмы и персонал в Папуа-Новая Гвинея Института медицинских исследований. Авторы хотели бы поблагодарить Амандин B Carmagnac, Кэтрин Q Nie, Дэнни W Уилсон, Иво Мюллер и Диана S Хансен за их вклад в развитие этой техники, и поблагодарить Австралийский Красный Крест для крови и сыворотки упаковках. Эта работа стала возможной благодаря викторианской правительства штата операционной инфраструктуры поддержки и правительства Австралии NHMRC IRIISS. Эта работа была поддержана Национальным здравоохранения и медицинского исследовательского совета предоставляет # 1031212 и # 637406, и Национальные институты здравоохранения грант # AI089686.

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Для измерения мерозоитов фагоцитоз, знание двух методов требуется: очистку мерозоитов и ТНР-1 фагоцитоза анализа. Наиболее важные шаги для объединения этих двух методов являются: 1) Высоко синхронизированные паразиты; 2) Добавление E64 в нужное время, получая мембранные закрытых мерозоиты; 3) Удаление hemozoin чтобы избежать агрегатов; 4) Точная подсчета с помощью проточной цитометрии мерозоитам; 5) разбавление плазмы используется; и 6) поддержание низкой плотности клеток и проход количество клеток ТНР-1. Тщательное рассмотрение этих ключевых аспектов обеспечит наблюдаются устойчивые ответы фагоцитоз. Хотя описанная здесь является получение мерозоитов для оценки фагоцитоз, методика может быть использована для широкого диапазона приложений. Независимо от вниз методологии потока, оптимальные препараты мерозоитам зависит от правильно ремень E64 дополнение в целях получения мерозоиты. Способ E64 описано здесь было показано, что уIELD инвазивных мерозоиты для использования в микроскопия высокого разрешения инвазионных событий и анализов чувствительности наркотиков 15-20. В то время как мерозоитов жизнеспособность не является необходимым для фагоцитоза, целостность мерозоитов поверхности покрытия не требуется. Поэтому метод, описанный здесь E64 позволяет высокое качество мерозоитов быть произведены для оценки реакции антител на поверхности покрытия. Как указано на рисунке 1, если E64 добавляется слишком рано или слишком поздно мембранные заключенные мерозоиты не образуются. По этой причине, очень синхронные культуры паразита требуется. Здесь, использование сорбита и гепарина лечения, чтобы плотно синхронизировать D10-GFP паразитов культур к окну 2 ч описано. Гепарин может способствовать gametocytogenesis в других лаборатория изолирует, и, следовательно, следует использовать осторожно. Альтернативные способы синхронизации, такие как аланин также может быть использован при условии, что плотно синхронизированные паразиты получают 29. Если E64 добавляется в асинхронных паразитов, низшую пропortion мембранных закрытой мерозоитов будут выпускаться и остальные паразит-инфицированных РБК либо разрыв обычно или развивать аномальную морфологию. Наличие паразитов, которые не превратились в мембранных заключены мерозоитов приведет к засорению фильтра и значительно уменьшить выход мерозоитов полученное. В процессе фильтрации мембранных закрытой мерозоитов, hemozoin освобождается от пищеварительных вакуолей и присутствует в виде свободных кристаллов в растворе. Hemozoin весьма провоспалительные и, как сообщалось, модулировать моноцитов и фагоцитоз макрофагов ответов 30, 31. В дополнение к модуляции фагоцитоз, как показано на рисунке 2, hemozoin могут образовывать агрегаты с мерозоитов в растворе. Как клетки ТНР-1 может фагоцитируют эти агрегаты, это может быть одним из основных confounder для решения опосредованной антителами фагоцитоза. Таким образом, удаление hemozoin необходимо в этом анализе А. В.подъязычная дополнительная сложность hemozoin на фагоцитов биологии. Кроме того, отказ удалить hemozoin может также вредно при использовании этого метода для создания свободной мерозоиты для других приложений, особенно там, где требуется мерозоитам количественное. Как указано на рисунке 4, количество мерозоитов добавлен в анализе могут влиять на степень фагоцитоза клеток ТНР-1. Хотя проточной цитометрии позволяет перечисления концентрации мерозоитам, тщательного пипетки и повторить подсчет мерозоитов необходимы для повышения точности. Это особенно важно, если несколько строк паразитов должны быть проверены бок-о-бок. Ранее было показано, что плазма от полу-иммунных детей из PNG может быть значительно ослаблены перед ответы снижаться 23. Описанный здесь является оптимальным разбавление плазмы (1/120, 000 Конечное разведение плазмы) для когорты 5 - 12-летними детьми PNG, которая привела к большой диапазон phagocyt. ответы Осис, описанные на рисунке 5 Этот диапазон позволило стратификации ответов на четыре группы (0 - 19%, 20 - 39%, 40 - 59% и 60 - 79% фагоцитоза), и регрессионное моделирование показало, что opsonizing ответы были связаны с защита от клинической картины заболевания и высокой плотности паразитемией 10 Для различных групповых исследований это может быть необходимо отрегулировать разбавление плазмы для обеспечения фагоцитоз клеток ТНР-1 не насыщен или ниже уровня обнаружения. Проточной цитометрии позволяет быстро и количественно фагоцитоз с повышенной точностью по микроскопии. Этот протокол является высокая пропускная способность, плиты на основе и автоматизированных приобретение 96-луночные планшеты для изучения естественно приобретенный гуморальный иммунитет. Метод требует окрашивания мерозоитов с этидийбромидом, однако альтернативные пятна ДНК, такие как SYBRgreen, DAPI и пропидия йода, мембранных пятен или белковых пятен могут быть использованы. Этот анализ будет поддаются Primarу моноциты или нейтрофилы, и могут быть адаптированы, если фагоцитов или FcR биология представляет интерес. Первичные элементы или ТНР-1 клетки, дифференцированные в пробирке с PMA может быть использован для изучения фагоцитоза в малярии и других патогенов 12, 32-34. Однако с помощью первичных клеток может оказаться непростой задачей, поскольку эти клетки являются приверженцем а также отображать не-антитела опосредованной фагоцитоз 35. Кроме того, различия в чистоте, жизнеспособности и функциональности некоторые ключевые ограничения к применению первичных фагоцитов. Рецепторы Fc, участвующие в мерозоитам фагоцитоза остаются неохарактеризованной, и, следовательно, с помощью блокирующих антител к конкретным Fc рецепторов может выяснить вклад каждого Fc рецептора к мерозоитам фагоцитоз. Как ТНР-1 фагоцитоз FcR зависит, это позволяет простой интерпретации фагоцитоза наблюдается. Этот анализ также поддается решению антигенную специфичность opsonizing антитела, которые могут быть достигнуты с помощью UtilИзинга нокаут-паразитов для мерозоитов поверхностных антигенов, или с использованием аффинно-очищенные человеческие антитела к мерозоитам поверхностные белки. Кроме того, в глубине исследования реакций цитокинов следующие мерозоитов фагоцитоза отсутствуют, и может быть достигнуто с помощью этого теста. Эти две технологии являются значительные успехи в изучение функциональных antimerozoite антител. Очистку высококачественных мерозоитов выгодно используя криоконсервированных мерозоиты, или флуоресцентные микросферы, покрытые мерозоитов антигенов. Хотя этот анализ был использован в качестве инструмента для оценки естественно приобретенный иммунитет, это может оказаться важным инструментом для решения о приобретении иммунитета в ответ на вакцинацию. В то время как это было недавно показано, что фагоцитоз или opsonised мерозоиты связано с защитой от клинической малярии, это не возможно, чтобы привлечь прямые выводы из в пробирке ТНР-1 фагоцитоза в естественных условиях phagocytoлиз мерозоитов, как фагоцитоз в этом анализе происходит в статических условиях и в отсутствие конкурирующих эритроциты. Потенциальные адаптации этого анализа могут таким образом обеспечивают универсальный инструмент для дальнейшего понимания малярии и мерозоитам фагоцитоза.

Важность антител для иммунитета к Plasmodium тропической малярии был показан 40 лет назад, когда иммуноглобулина от гипериммунных взрослых пассивно переданы детям, страдающим от тяжелой малярии в результате облегчено болезни 1. Следовательно, значительные усилия стремились определить цели защитного малярийного иммунитета, в основном за счет измерения титров антител к пептидам или бактериально выраженных белков по ELISA. На основе ИФА серологические также доказала сильно варьирует в разных исследованиях, и не затрагивает функциональность антител 2. Многие антигены малярии вызвать cytophilic IgG1 и профиль антител IgG3, в частности мерозоитам поверхностные антигены 3. Это смещение подкласс предполагает, что антитело-Fc-рецептор (FcR) взаимодействие с фагоцитами важны для эффекторных функций антител opsonizing antimerozoite 4. Несколько вакцин мерозоитам антиген в стадии разработки предназначены длявыявить фагоцитов эффекторные функции 5, 6 и несмотря на значительный доказательства важности антитело-FcR взаимодействий в моделях грызунов малярией существует 7-9, и несколько последних исследований подтверждают важность функциональных антител и функций фагоцитов эффекторных для иммунитета к малярии у человека 10, 11, эта область остается слабо изученным. Исследование в мерозоитов конкретных opsonizing антител был ограничен двумя факторами; трудность в выделении хорошего качества мерозоиты; и переменные ответы фагоцитоз из первичных клеток. До недавнего времени высокоскоростного центрифугирования или плотности Перколла градиенты не были использованы для выделения мерозоитов из культуральных супернатантов разрыва шизонт культур. Эти мерозоиты редко жизнеспособным, и часто дальнейшие манипуляции плотности центрифугирования и несколько мыть шаги 12, или криоконсервации 11 перед использованием в анализах. Это процессные процессы потенциально отсоединить много периферии, связанные белки с поверхности мерозоитам, белки, известные как антигенные мишени малярийного иммунитета 13. Недавно ингибитор протеазы цистеина транс-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-гуанидино) бутан (E64) был использован для создания жизнеспособных мерозоитов. E64 предотвращает разрыв шизонт, генерируя мембранные закрытый мерозоитов 14, которые могут быть разрушены путем фильтрации, чтобы освободить жизнеспособных мерозоитов 15, 16. Этот метод приводит к пространственным разрешением многочисленных белков во эритроцитов вторжения 15, 17-19 и прояснил этап специфическое воздействие нескольких противомалярийных препаратов 16, 20. Тем не менее, образование жизнеспособных мерозоитов остается технически сложной задачей. Для помощи в распространении этой методики и применения к функциональных анализов иммунитета, подробного протокола для жизнеспособного очистки мерозоитам и их использование встандартизированный функциональный анализ антител: сотовые сотрудничество в опсонизации и фагоцитоза описан здесь. Этот метод демонстрирует значительный шаг вперед по сравнению с предыдущими анализами в пробирке мерозоитам опсонизации, таких как нейтрофилов дыхательного взрыва, антитело-зависимой клеточной ингибирования (ADCI), а также альтернативные мерозоитам фагоцитоза анализов. Эти анализы плохо воспроизводимым вследствие изменения паразита входов и деятельности первичных фагоцитов 11, 21. Заражение hemozoin также может глубоко затронуть функции 22 фагоцитов. Недавно сообщили надежные и воспроизводимые мерозоитам фагоцитоз анализ 23 использует promonocytic клеточной линии THP-1 24. Это идеальный тип клеток для высокой пропускной проточной цитометрии анализа как он не является сторонником и, в частности выполняет Fc-рецептор опосредованного фагоцитоза 25, 26. Дополнительная сложность в то время исследоваtigating фагоцитоз является то, что степень фагоцитоза зависит от количества мерозоитов по отношению к ТНР-1 клеток и концентрации в плазме. Для обеспечения воспроизводимости между экспериментов, мерозоиты должны быть пронумерованы и используется данная концентрация. Из-за их небольшого размера, проточной цитометрии количественное требуется. Описанная здесь процедура удаляет hemozoin и генерирует жизнеспособных мерозоиты, и описывает применение этих мерозоитов для проточной цитометрии перечисления мерозоитов с последующим опсонизации и фагоцитоза. Хотя технически сложных, методы, описанные может оказаться полезным для выяснения вклада конкретных ответов антител мерозоитам поверхностных естественно приобрел и вакцинального иммунитета.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Малярийного плазмодия мерозоитам антигены находятся в стадии разработки в качестве потенциальных вакцин против малярии. Одним из аспектов иммунитета против малярии является удаление свободных мерозоитов из крови фагоцитов. Однако оценки функциональной эффективности мерозоитов конкретных opsonizing антител является сложной задачей в связи с коротким периодом полураспада мерозоитов и изменчивости первичных фагоцитов. Описанный здесь подробно представляет собой способ получения жизнеспособных мерозоитов с использованием ингибитора протеазы E64, и по результатам анализа мерозоитов опсонин-зависимый фагоцитоз с помощью про-клеточной линии моноцитов ТНР-1. E64 предотвращает шизонт разрыв, позволяя развитие мерозоитов, которые выделяются путем фильтрации обработанных шизонтов. Этидий бромид меченые мерозоитов опсонизированным с образцами плазмы человека и добавляли к ТНР-1 клеток. Фагоцитоз оценивается стандартизованного протокола высокой пропускной способности. Жизнеспособные мерозоиты являются ценным ресурсом для оценки НумерOUS аспекты P. тропической биологии, в том числе оценки иммунной функции. Уровень антител, измеренные этом анализе связаны с клинической иммунитета к малярии в естественно облученных лиц. Анализ может также быть полезен для оценки антитела вакцины индуцированных.

Период созревания паразитов до начала лечения E64 имеет решающее значение для создания мембранных закрытой мерозоиты. Рисунок 1AI показывает соответствующий этап созревания шизонтов для добавления E64. Паразиты должны быть большими и почти заполнить эритроцит. Пятнистый появление Гимза показывает мерогонии началось, и E64 следует добавить, чтобы получить мембранные закрытой мерозоиты (Рисунок 1Aii). Если E64 добавляется ранее трофозоита стадии паразитов, мембранные, заключенные мерозоиты не создаются даже после 12 часов от E64. Вместо паразиты взять на аномальную морфологию, таких как расширения пищеварительной вакуоли (рис. 1Bi и 1Bii) и мерозоитов не образуются. Если E64 позже будет добавлен к шизонтов, мембранные закрытой мерозоиты не создаются как разрыв шизонт является раскованный (рис. 1CI и 1Cii). Высокий уровень паразита синхронности требуется, другоймудрый выбор всех трех результатов, описанных будет видно после лечения E64. Удаление hemozoin является еще одним важным шагом для очистки мерозоитов. Если мерозоитов не очищен от hemozoin затем мерозоитов-hemozoin кластеры образуют которые не могут быть смещены с помощью пипетки. Эти агрегаты работают на цитометр как единичных событий, хотя и с разными прямого рассеяния и боковые разброс характеристик, чем отдельные мерозоитов, в результате неточной подсчета мерозоитам с помощью проточной цитометрии (рис. 2А). Как клетки ТНР-1 также может фагоцитируют hemozoin эти мерозоитам-hemozoin кластеры могут быть также фагоцитированы (рис. 2б). Эти агрегаты обладают высокой EtBr флуоресцентный как они содержат несколько мерозоитов. Фагоцитоз агрегатов приводит к ТНР-1 Профиль флуоресценции EtBr эквивалентной что наблюдается для фагоцитоза нескольких отдельных мерозоитов. Следовательно, если hemozoin не удаляется, EtBr флуоресценции клеток ТНР-1 будет оverestimate из opsonizing потенциала для плазмы проходит испытания. Hemozoin Также сообщается, существенно изменить функцию фагоцитов. GFP положительные мерозоиты счетчик окрашивали EtBr увеличить визуализацию мерозоитов фагоцитированы клеток ТНР-1. Использование условий, описанных в этом протоколе, все GFP положительные мерозоиты контрастно с EtBr который имеет более яркий интенсивности флуоресценции (рис. 3А). Оценка Фагоцитоз по флуоресценции EtBr обеспечивает исключительную разрешение мерозоитам фагоцитоза, чем GFP флуоресценции (рис. 3В). Количество мерозоитов, добавленных в анализе будет модулировать количество фагоцитоза наблюдалось. По этой причине точный подсчет с помощью проточной цитометрии имеет решающее значение. Увеличение соотношения мерозоитов: ТНР-1 приведет к увеличению адгезии мерозоитов к ТНР-1 клеток в отсутствие плазмы (фиг.4А). Увеличение мерозоитов: ТНР-1 коэффициенты также приводит к увеличению телответы agocytosis когда мерозоиты опсонизированным (рис. 4В). 4:01 мерозоитам: ТНР-1 отношение рекомендуется для надежных фагоцитарных ответов. Используя этот коэффициент, и разбавление плазмы указанного, этот анализ способен решить низкие, промежуточные и высокие уровни opsonizing антител. Между 0 и 78 процентов ответов фагоцитоз наблюдались с помощью образцов плазмы PNG и другие условия, описанные. Такие ответы были недавно показаны связать с естественным приобретенного клинической иммунитета к малярии 10. Рисунок 5 показывает примеры 4 квартили фагоцитоза ответов PNG лиц. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Рисунок 1. Сроки E64 дополнение имеет решающее значение для создания мембранных закрытой мерозоиты. (А) Подходит maturatio. п этап паразитов я) до начала лечения E64, и б) мембранные закрытой мерозоиты произведенные после 6 часов лечения E64 (B) мембранные заключенные мерозоиты не создаются, если E64 добавляется незрелых паразитов; я) поздней стадии трофозоиты и II) после 12 часов от E64 (С) шизонт разрыв не препятствует, если E64 добавляется поздно сегментирован шизонты.; я) поздней стадии шизонты, и б) после 6 часов от E64. Шкала бар составляет 10 мкм. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2. Удаление Hemozoin имеет решающее значение для создания одноклеточных мерозоитов подвески. Мерозоитов-hemozoin агрегаты форме после фильтрации мембранных закрытых мерозоитов, если hemozoin не магнитно отделена от мерозоитов. (А) прямого рассеяния и боковые разброс участков мерозоитов с hemozoin удаленыи hemozoin сохраняется. (B) Hemozoin-мерозоитов агрегаты могут быть фагоцитированы ТНР-1 клеток. Разница-Быстрый окрашенные цито-спиновые слайды ТНР-1 клеток, инкубированных с PNG опсонизированным плазмой мерозоитам препараты с или без hemozoin. Шкала бар составляет 10 мкм. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3. Окрашивание этидийбромида позволяет для превосходной разрешением мерозоитам фагоцитоза. D10-GFP очищенные мерозоиты контрастно с EtBr улучшить интенсивность флуоресценции. (А) методом проточной цитометрии histrogram очищенных мерозоитов с стробирования на GFP положительных мерозоитов, и дот-блот показывая EtBr флуоресценции в этом закрытом GFP положительного населения. (В) вперед разброс по сравнению с GFP и вперед разброс по сравнению с EtBr из клеток ТНР-1 следующим фагоцитоза GFP и EtBr двойных люминесцентных мерозоитов. Гейтс были г<html> Rawn на основе клеток ТНР-1 с мерозоитов без контроля плазмы. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Рисунок 4 мерозоитов. THP-1 соотношение влияет на степень фагоцитоза наблюдалось. (A) Пять мерозоитов: ТНР-1 изображены показатели; 50:1, 20:1, 10:1, 4:1, 1:1. Клетки только контроль указывает фоновой флуоресценции из-за ТНР-1 клеток. THP-1 EtBr флуоресценции для каждого соотношения показан для мерозоитов опсонированных с пулом PNG плазмы или с неиммунной австралийской плазме (B) средней интенсивности флуоресценции из THP-1 клеток для различных мерозоитов. ТНР-1 коэффициентов, и опсонизация с бассейном из PNG плазме или неиммунной Австралии плазме (в среднем + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> ove_content &quot;FO: держать-together.within-странице =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Рисунок 5. Большой диапазон opsonizing антител могут быть измерены. Мерозоитов опсонизированным плазмой из PNG лиц и инкубировали с ТНР-1 клеток. Четыре представительные ответы фагоцитоз показаны. Гейтс были сделаны на основе клеток ТНР-1 с мерозоитов без контроля плазмы, и цифры обозначают% фагоцитоз после вычитания клеток ТНР-1 с неиммунной контроля плазмы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Измерение функции антител является ключом к пониманию иммунитет к Plasmodium тропической малярии. Этот способ описывает очистку жизнеспособных мерозоитов, и измерение опсонизации зависит от фагоцитоза методом проточной цитометрии.

Высокая доходность Очистка<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Мерозоиты для использования в Opsonizing антитела анализы

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.8K Views.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Измерение функции антител является ключом к пониманию иммунитет к Plasmodium тропической малярии. Этот способ описывает очистку жизнеспособных мерозоитов, и измерение опсонизации зависит от фагоцитоза методом проточной цитометрии. 

Video: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания<em&gt; Малярийного плазмодия</em&gt;-Инфицированных эритроцитов в условиях ограниченных ресурсов Настройка

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Разделение<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Поздняя стадия-инфицированных эритроцитов магнитных средств

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Методы по расследованию регулирующей роли малых РНК и рибосомного размещения в<em&gt; Малярийного плазмодия</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Измерения гриппа, нейтрализуя антитело ответы на A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки, Microneutralization Assays клетки с помощью MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence анализов для человека островок аутоантител

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Очистка высокой урожайности Внеклеточных Препаратов Весикл вдали от вируса

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...