المؤلفين أشكر رينيه Scriwanek للمساعدة في إعداد الشكل. ويدعم FR بواسطة ECHO (700.59.003)، برنامج ALW المفتوحة (821.02.017 و822.02.014)، والتعاون DFG-NWO (DN82-303) وZonMW VICI (016.130.606) المنح.

1. إعداد الكوراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها الخميرة في 30 درجة مئوية في 10 مل من المتوسط ​​مناسب يحدده تصميم التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اليوم، وقياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) باستخدام مضواء، تمييع الخلايا في نفس الثقافة المتوسطة إلى OD 600 من 0.2-0.4 وتنمو منها إلى مرحلة النمو المتسارع إلا إذا كان تصميم التجربة يتطلب حالة مختلفة. الخلايا في مرحلة الأسي عندما الثقافة لديه OD 600 من 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 OD 600 حكمه من الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق في أنبوب 50 مل. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 5 مل من 100 ملي أنابيب (الرقم الهيدروجيني 9.6)، 10 ملي dithiothreitol والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا طن 5 مل من المتوسط ​​(التي يحددها تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول و 5 ملغ من انزيم التحللي، واحتضان الخليط عند 30 درجة مئوية مع الهز لطيف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق لجمع جزء بيليه، والتي تتطابق مع spheroplasts. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وspheroplasts في 960 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجليد الباردة (تحديد المتوسط ​​عن طريق تصميم التجربة) التي تحتوي على 1 M السوربيتول ونقل الخليط في البرد الجليدي 2 مل أنبوب microcentrifuge. </li></ol> 2. Nanogold امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، مزيج بلطف الكوراء مع 4 نانومول من جزيئات موجبة الشحنة nanogold معلق في 40 ميكرولتر من الماء. الحجم النهائي من الخليط يجب أن يكون من 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق في درجة حرارة الغرفة واحتضان ذلك للفترة الزمنية المطلوبة للسماح nanogold الداخلي عن طريق البريدndocytosis. ملاحظة: سوف امتصاص 5 دقائق تؤدي أساسا إلى وضع العلامات من الحويصلات التقامي ومقصورات endosomal في وقت مبكر، في حين أن امتصاص 15 دقيقة سيسمح للاحتفال نظام endosomal كامل (أوائل وأواخر الإندوسومات). وسوف يعد مرات الحضانة (أكثر من 30 دقيقة) تسمح أيضا لتسمية فجوة. ملاحظة: لا يمكن إجراء نبض مطاردة التجارب وضع العلامات مع هذا الأسلوب. لذلك، عندما وصفها لتحليل جنيه، كما سيتم العثور nanogold في وINEE PM. </li></ol> 3. تثبيت وباجتزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف امتصاص nanogold بإضافة 1 مل من ضعف قوة تثبيتي [بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، 0.4٪ غلوتارالدهيد (GA) في 0.1 م العازلة PHEM (20 ملم أنابيب، و 50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 6.9، 20 ملي EGTA، 4 ملي MgCl 2)] تحتوي على 1 M السوربيتول إلى تعليق الخلية. أبقى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بلطف يدويا أنابيب micocentrifuge عدة مرات خلال 30 دقيقة (وهذا سوف يسمح للحفاظ على spheroplasts فيالتعليق) ثم الطرد المركزي مرتين في 1،700 x ج لمدة 25 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال تثبيتي عن طريق التخلص من طاف وذلك بإضافة 1 مل من الطازجة قوة تثبيتي القياسية (2٪ PFA، 0.2٪ GA في 0.1 م العازلة PHEM) تحتوي على 1 M السوربيتول واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الخلايا للالبرد باجتزاء كما هو موضح سابقا 6. ملاحظة: للحصول على إجراءات تعزيز امتصاص nanogold والفضة، والعلاج حامض الدوري موضح في البروتوكول المشار إليه لم المراد تنفيذها. علاج حمض الدوري هو أفضل permeabilize جدار الخلية 26 ولكن تم القضاء على هذا الهيكل خلال جيل من spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض 50 نانومتر في cryosections رقيقة -120 درجة مئوية مع جفاف سكين الماس باستخدام مشراح مستدق UCT كما هو موضح سابقا 8 ووضعها على الكربون المغلفة Formvar 50 تنسجم شبكات النيكل. </li></ol> 4. تعزيز الفضية لNanogold الجسيمات Visualization ملاحظة: الإجراء لإعداد الخلائط رد فعل هو في الأساس واحدة أشارت من قبل الشركة المصنعة. التعديلات العملية باستخدام هذا البروتوكول، ويجعل الإجراء تعزيز الفضة فعالة وموثوق بها على cryosections. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عدة تعزيز الفضة من الفريزر وذوبان الجليد هو في الحاضنة 37 درجة مئوية أو حمام الماء. عند إذابة، ضع عدة في حاضنة 24 درجة مئوية وضعها في غرفة مظلمة حتى استخدام (انظر 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة التدفئة في غرفة مظلمة ودافئة لدرجة الحرارة النهائية من 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجزء العلوي من لوحة التدفئة مع حامي السطح، الجانب اللامع فوق، وضمان الحصول عليها مع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع Parafilm على Benchkote وبمناسبة حواف مع علامة سوداء ليكون قادرا على رؤية الحواف Parafilm في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميزان حرارة الشريط على الجزء العلوي من Benchkote لرصد درجات الحرارة من لوحة التدفئة. ضبط درجة الحرارة تدريجيا إذا لم 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيش التحرير الشعبى الصينىCE أنبوب 50 مل بالماء المقطر المزدوج وطقم تعزيز الفضة في الداخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أطباق بتري صغيرة مع الماء المقطر المزدوج، استعد مسبقا عند 37 درجة مئوية. وضع شبكات في الماء، عينة الجانب السلبي، لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوة 4.7 مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكات في صندوق تخزين وتقديمهم إلى غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكات مرة أخرى عن طريق تمرير لهم (مع الجانب عينة لأسفل) على عدة قطرات من الماء المقطر مزدوجة في 24 ° C وضعت على Parafilm التي تم إصلاح على لوحة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن 9 مزدوجة قطرات الماء المقطر إضافية مستعدون على Parafilm، لالشطف بعد رد الفعل تعزيز الفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل ضوء قبالة والتأكد من أن جميع الأنوار مطفأة. بدوره الضوء الأحمر على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج ألف وباء حلول من عدة تعزيز الفضة من الحاضنة 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ووضع قطرات 6 الأولى من الحل A ثم 6 قطرات من محلول B في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتخلط جيدا مع ماصة باستير الزجاج تجنب جعل فقاعات. الحل هو سميكة جدا ولها إلى أن تكون مختلطة يدويا مع ماصة قبل vortexing لفترة وجيزة في نهاية الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلول A و B مرة أخرى في الحاضنة 24 درجة مئوية، واخراج الحل C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 قطرات من الحل C إلى المزيج A / B. ثم تخلط مرة أخرى الأول مع ماصة باستور ومن ثم من قبل vortexing، وتجنب الوقوع في فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدامها على الفور الخليط النهائي عن طريق وضع قطرات (~ 20 ميكرولتر / قطرة) على Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملاقط نظيفة، ومكافحة المغناطيسي، ووضع شبكات على الخليط (على سبيل المثال، الفضة تعزيز رد فعل) لمدة 6 to15 دقيقة تبعا للتعزيز (أي. حجم جزيئات الذهب) يرغب في الحصول عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شبكات من الخليط وتمريرها على سطح الماء المقطر المزدوج قطرات في 24 درجة مئوية لمدة يغسل. أولا، استخدم في خلافة بسرعة 6 قطرات ثم 3 قطرات مع 7 دقيقة فترة حضانة من كل قطرة ماء، قبل ان يتحول الأضواء على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الخطوة التالية، إما وضع العلامات المناعية الذهب أو غشاء تلطيخ 27 من أجل تصور نتيجة لإجراء تحقيق EM. </li></ol>

<ol>
	<li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocytic+pathway:+a+mosaic+of+domains.">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li><li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes:+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks.">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li><li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes:+fusion+and+function.">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li><li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+imagination:+understanding+the+endo-lysosomal+system.">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li><li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li><li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure.">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li><li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT-III:+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting.">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li><li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li><li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes.">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li><li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway.">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li><li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fab1p+PtdIns(3)P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body.">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li><li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells.">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li><li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry.">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li><li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin.">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li><li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues.">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li><li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering.">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li><li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+contact+site+complex,+a+determinant+of+mitochondrial+architecture.">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li><li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy.">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li><li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li><li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p.">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li><li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis.">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li><li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis.">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li><li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li><li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting.">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li><li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase,+hexokinase,+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level.">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li><li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway.">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li><li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+frontiers+in+gold+labeling.">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

المناعية الإلكترون المجهري هو الاسلوب الذي يسمح الجمع بين توطين البروتينات مع قرار التركيبية من الناقلين والعضيات حيث تتواجد هذه البروتينات. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند دراسة نظام الخميرة endosomal لأن حجرات لها تظهر هياكل نقط كما في مضان المجهري. وبالتالي فإنه من...

نظام endosomal هو جهاز الفرز غشاء الرئيسية التي تلعب أدوارا متعددة الخلوية حاسمة بما في ذلك الاتجار انزيم الليزوزومية مستقبلات الفرز وإعادة التدوير من غشاء البلازما (بعد الظهر) مستقبلات 1،2. وتنقسم الإندوسومات في ثلاث مقصورات مختلفة، مثال. والإندوسومات في وقت مبكر (EE)، والإندوسومات الراحل (LE) والإندوسومات إعادة التدوير. ويستند هذا التصنيف على الوقت الذي يستغرقه للمواد endocytosed للوصول إليهم، على بروتينات محددة وعلامة على التشكل. يمكن أن تكون إما تسليمها الأغشية، أي البروتين والدهون طبقات ثنائية، المنضوية من PM إلى الجسيمات الحالة عبر الإندوسومات للتدهور أو إعادة تدويرها مرة أخرى. ويتم نقل الأغشية أيضا الإندوسومات من جولجي وبالمثل، إما الاستمرار في الجسيمات الحالة أو يتم استردادها مرة أخرى إلى جولجي. وعلاوة على ذلك، والبروتينات يمكن أن تخزن في الحويصلات اللمعية في مهدها الداخل من endosomal الحد الغشاء، وهي العملية التي تؤدي إلى تشكيلفئة فرعية من جنيه، والهيئات عديد الحويصلات. نظام endosomal الخميرة هو نسبيا أقل تعقيدا من واحدة من الخلايا حقيقية النواة عالية. وتنقسم الإندوسومات الخميرة في وEE جنيه. وعلى النقيض من خلايا الثدييات أنها لا تحتوي على الإندوسومات إعادة التدوير ولكن أيضا العضيات ذات الصلة يحلول الأنسجة محددة. وبالتالي لديهم شبكة أقل تعقيدا من طرق الاتجار endosomal 3،4. ولذلك فقد الخميرة مثلت ولا تزال تمثل النظام التجريبي مفيد لدراسة بعض المبادئ الأساسية في حركة غشاء نظام endosomal. وأكد هذه الميزة من حقيقة أن العديد من الجينات المعنية في مسارات endosomal تم عزلها في البداية مع شاشات الوراثية في الخميرة 5. في حين أن النظام endosomal الخميرة في النوع البري وخلايا متحولة وقد درس على نطاق واسع باستخدام نهج المجهري البيوكيميائية ومضان، تحقيقاتها على مستوى التركيبية كان فقطالحد الأدنى. التحليلات المورفولوجية هي ذات أهمية خاصة في الخميرة لأن يتم الكشف عن معظم العضيات endosomal عن الهياكل نقط بواسطة المجهر مضان، والتي تجعل من الصعب تحديد لا لبس فيه 6. للأسف سوى عدد محدود من أمصال مضادة الاعتراف علامات البروتين الخميرة endosomal تعمل في المناعية الإلكترون المجهري (IEM) الاستعدادات 7-10. بالنسبة لبعض البروتينات، وقد تم التحايل على هذه المشكلة عن طريق وضع علامات الذاتية من الجينات في المصالح واستخدام الأجسام المضادة الاعتراف علامة على الكشف عن 7،11،12. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عنها بواسطة البروتينات هي IEM بسبب انخفاض مستويات التعبير الخاصة بهم. من overexpression ليست حلا لأن هذا النهج يمكن أن تحدث سوء تعريب و / أو تغييرات في التشكل عضية / وظائف. وبالتالي فإن وضع العلامات من مقصورات التقامي مع لجنة التحقيق كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني EM هو خيار فعالة. هذا هو الحل الأمثل وخاصة إذا كان العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية تدخل الطريق التقامي بطريقة تعتمد على الوقت، والذي يسمح لمعرفة متى سيكون علامة على عضية محددة 6. وقد تم بنجاح استخدام امتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts الخميرة (أي. الخميرة حيث تمت إزالة جدار الخلية إنزيمي) لتحديد endosomal الخميرة المقصورات 10. هذه الجسيمات يرتبط بقوة إلى الدهون سالبة الشحنة تتكون الأغشية البيولوجية. وبالتالي الزميلة nanogold موجبة مع رئيس الوزراء، تخترق الخلية عن طريق الإلتقام ويمر عبر EE جنيه وقبل أن يصل إلى فجوة. هذه الجسيمات صغيرة من الذهب، ومع ذلك، لم يكن لديك الحجم المناسب أن ينظر إليها من قبل EM. لجعلها مرئية، حجمها يمكن توسيعها عن طريق التفاعلات الكيميائية التي تؤدي إلى ترسب الفضة أو الذهب حول التحقيق الذهب 13-15. قمنا بتطوير وتطبيق هذا النهج بنجاح IEM على أساس أسلوب Tokuyasu لأداء التحت خلويةيدرس توطين 8،16. يسمح هذا الأسلوب أداء immunogold وضع العلامات على الاستعدادات الخميرة مع قرار ممتاز من التشكل 8،17-24. أنشأنا أيضا إجراء الجمع بين هذا البروتوكول IEM مع وضع العلامات nanogold النظام الخميرة endosomal المقصورات 6. باستخدام هذا النهج الذي اتسمت شكليا فرعية مختلفة من الإندوسومات وultrastructurally فحص المسوخ مع الاتجار endosomal عيب 6،25. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن هذا الوسم nanogold يمكن دمجها مع labelings immunogold توفير إمكانية لاستكشاف توزيع بروتين من الفائدة على مجموعات سكانية فرعية مختلفة جسيم داخلي. هنا نقدم كيف يتم تنفيذ وسم النظام الخميرة endosomal مع nanogold موجبة عمليا.

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged Nanogold</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HQ-silver&amp;trade; enhancement kit</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM grade</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Lytic enzyme</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-immuno diamond knife 35&amp;deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Switzerland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotome&amp;nbsp;</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 resine</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Grids storage box</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur capillary pipettes 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote surface protector</td><td>Whatman, Maidstone, United Kingdom&amp;nbsp;</td><td>1159201</td><td></td></tr></tbody></table>

nanogold labeling of the yeast endosomal system for ultrastructural analyses

الإندوسومات هي واحدة من كبرى غشاء الفرز نقاط التفتيش في الخلايا حقيقية النواة والتي تنظم إعادة تدوير أو تدمير معظمها من البروتينات الغشاء البلازمي وجولجي. ونتيجة لذلك النظام endosomal يلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية، والطفرات في جينات المنتمين إلى هذه الشبكة من العضيات مترابطة بواسطة وسائل النقل الحويصلي، يسبب أمراض خطيرة بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية. لذا من الأهمية رئيس هو لفهم الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي وتنظيم نظام endosomal. كان الخباز الخباز الخميرة محوريا في هذه المهمة. لتسمية تحديدا وتحليل على مستوى التركيبية النظام endosomal هذا النموذج الحي، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لامتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts تليها التصور من هذه الجسيمات من خلال تعزيز التفاعل الفضة. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة للغايةل لفحص الصرفي من المسوخ مع عيوب في الاتجار endosomal. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس فقط ينطبق على الامتحانات التركيبية لكنها يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع labelings immunogold للتحقيقات البروتين التعريب.

ويبين وفقا لبروتوكول المقدمة، مورفولوجية النظام الخميرة جسيم داخلي يمكن أن يكون وصول EM الإرسال. الشكل 1 أنواع مختلفة من المقصورات endosomal التي تم التوصل إليها، وبالتالي المسمى مع nanogold. وnanogold محسنة الفضة يمكن رؤيتها بوضوح كما الإلكترون جسيمات كثيفة. الإعدادات ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses at JoVE.com

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية.

Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية. 

Video: Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Neuroscience

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Immunology and Infection

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Biochemistry

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...