وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI088209 (إلى KAH). كما نشكر جامعة مينيسوتا التدفق الخلوي الموارد.

في هذه الدراسة، والكبار - استخدمت (6 8 أسابيع) أنثى C57BL / 6 الفئران. تم شراء الفئران من المعهد الوطني للسرطان والحفاظ عليها في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. وافقت جامعة جنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مينيسوتا (IACUC) جميع التجارب على الحيوانات. 1. إعداد أدوات والمخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول أنزيم (RPMI1640 المتوسطة مع 0.05٪ [ث / ت] من Liberase TH و 100 U / مل من الدناز I)، عازلة الألبومين الغني (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] مع 0.5٪ المصل البقري الزلال و 2 ملي حمض الإيثيلنديامين Tetraacetic [EDTA])، FACS العازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 0.02٪ نان 3)، FACS فرز عازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] تحتوي على 2٪ FBS)، وRP10 المتوسطة (متوسطة RPMI-1640 توفيره مع 10٪ FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات 10 بالغسل. تحضير 40 مل من محلول طلاء (0.01 ملغ / مل Gالشوفان مكافحة فأر مفتش في 0.1 M NaHCO 3 العازلة)، وإضافة 4 مل من محلول طلاء في كل 100 × 15 مم لوحة، دوامة واحتضان عند 4 درجات CO / N. تخلصي حل الأجسام المضادة وشطف لوحة باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 مرات، دوامة بقوة بين يشطف. تخزين مستعدة لوحات في 4 درجة مئوية. </li></ol> 2. حصاد الأنسجة الغدة الصعترية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في غرفة CO 2. وضع الحيوان على ظهره على حصيرة تشريح، دبوس القدمين على حصيرة والرطب الفراء عن طريق الرش مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط من خلال الجلد، بدءا من فوق فتح مجرى البول مباشرة الى الفك السفلي مع مقص وتوسيع شق أسفل إلى الركبتين على كلا الجانبين. شق يشبه رأسا على عقب &quot;Y&quot;. سحب الجلد فضفاضة مرة أخرى على الجانبين، ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب الحجاب الحاجز من الخنجري، وقطع أضلاعه على كل جانب تصل إلى نحو الترقوة، ثم رفع الأضلاع معملقط ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. الغدة الصعترية هي فقط تحت الأضلاع، وتبدو مثل اثنين من فصوص بيضاء رقيقة تغمر القلب (الشكل 1). النسيج الضام المحيطة بفصل الغدة الصعترية، وسحب بلطف وإزالة زوج من فصوص الغدة الصعترية مع ملقط مسنن منحنية. مكان فصوص الغدة الصعترية في لوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل RPMI-1640. </li></ol> 3. إعداد خلايا التوتة اللحمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم أي الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة ونقل فصوص الغدة الصعترية لبئر جديد للوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل يعد حديثا حل الانزيم. جعل شقوق صغيرة في الفص الصعترية مع مقص غرامة، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف هضم الغدة الصعترية تصل الأنسجة وهبوطا 2 - 3 مرات باستخدام 5 مل ماصة للتفكك الأنسجة. جمع جزء طاف في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل الباردة العازلة الزلال الغنية لتحييد الانزيمات. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد. إضافة 2.5مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الانفعالات الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 18 إبرة G لتفريق المجاميع. تجمع طاف في أنبوب جمع. إضافة 2.5 مل حل انزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الإثارة الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 25 إبرة G، واحتضان لوحة إضافي من 5 - 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم الكامل، بركة طاف في أنبوب جمع. الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لجمع الخلايا. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في 10 مل الألبومين الغنية العازلة وتصفية العينة 100 مم من خلال شبكة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ثم نفذ تحليل تدفق cytometic (القسم 4) أو TECS تخصيب (القسم 5). </li></ol> 4. تحديد TECS بواسطة التدفق الخلوي </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا لتركيز النهائي من 4 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر في المخزن FACS لتلطيخ في 96 ذهابا وأسفل جيدا لوحة الاختبار والحفاظ على لوحة على الجليد. إضافة 20 ميكرولتر التيسير حل كتلة (مكافحة CD16 / CD32 الأجسام المضادة في 10 ميكروغرام / مل في المخزن FACS) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد. تدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. تجاهل السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة جهه لأسفل في الحوض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا مكعبات في 100 ميكرولتر كوكتيل الأجسام المضادة (مكافحة CD45، -EpCAM، -MHC الدرجة الثانية، و-Ly51 الأجسام المضادة، وكتين UEA-1 المسمى مع fluorochromes مختلفة في الشركة المصنعة أوصى أو اختبار تركيزات المثلى من كل الأجسام المضادة في المخزن FACS )، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. للتعويض، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا تألقي مع كل فرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بئر وتدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. كرر الخطوة غسل واحدالوقت، وresuspend ثم الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة. نقل الخلايا إلى 12 × 15 مم الجولة القاع أنبوب FACS مليئة 300 ميكرولتر FACS العازلة. الحصول على العينات على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات باستخدام برامج التحليل FACS. يظهر استراتيجية النابضة المجلس التنفيذي الانتقالي في الشكل 2. </li></ol> 5. إثراء TECS بواسطة بالغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار خلايا الغدة الصعترية (المعد في القسم 3) في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في FACS عازلة فرز بتركيز 2 × 10 8 خلايا لكل مل في 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي. إضافة الأضداد المضادة للCD90.2 (استنساخ 30-H12) (أو مكافحة CD45) في تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل من تعليق خلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، ويغسل مع 5 - حجم 10X من RP10 المتوسط ​​وأنبوب الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات فيRP10 المتوسطة بتركيز 1 × 10 7 لكل مل. إضافة 5 مل تعليق خلية إلى كل لوحة المغلفة بالغسل (المعد في الخطوة 1.3)، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. دوامة بقوة. نقل supernatants في أنبوب مخروطي. شطف لوحة مرتين باستخدام RP10 المتوسطة وتجميع supernatants في أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات في 5 مل RP10 المتوسطة. إضافة تعليق الخلية إلى لوحة بالغسل جديدة، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. جمع الخلايا شطف لوحة وبركة لهم في أنبوب مخروطي. مرة واحدة يتم إثراء TECS، وتدور أسفل الخلايا في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعليق الخلايا في 5 مل FACS فرز العازلة. </li></ol> 6. تنقية TECS بواسطة الفرز الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد تعليق الخلية بتركيز 4 × 10 7 الخلايا في عازلة FACS الفرز. إضافة الأجسام المضادة ديcribed في القسم 4.4 إلى حل الخلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ، وغسل وتعليق الخلايا إلى تركيز 10 × 10 6 خلايا لكل مل من FACS العازلة الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي من خلال فوهة 100 ميكرومتر باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز. يتم جمع الخلايا مرتبة في 30٪ (V / V) FBS في RPMI-1640). مرة واحدة يتم فرز الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتحضير لتحليل المصب. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li><li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+epithelial+cells:+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection.">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta5t-containing+thymoproteasome:+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8.">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li><li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes.">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li><li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+cells,+life+history,+and+diversity.">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).</li><li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection.">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li><li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus.">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+tolerance:+central+and+peripheral.">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li><li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance.">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li><li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection.">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li><li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li><li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development.">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation.">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li><li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells.">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+CD8++T+cells+need+diversity+when+growing+up.">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li><li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc.">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD8++T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes.">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li><li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection.">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li><li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells.">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li><li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro.">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).</li><li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells.">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li><li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes.">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li><li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen.">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li><li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker,+Ly110.">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li><li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry.">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+analysis,+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells.">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations:+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury.">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li><li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+T+cell+subpopulations.">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li><li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques.">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li><li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses:+morphological+and+serological+characterization.">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li><li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus:+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells.">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes.">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li><li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis.">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

في البروتوكول، الخطوات الحاسمة هي إعداد خلايا انسجة الغدة الصعترية (القسم 3) وإثراء TECS (القسم 4). ويوصى بشدة أن يتم تحضير محلول أنزيم جديد في كل مرة ويتم التعامل مع الأنسجة في أقرب وقت ممكن. لالتوتة المجمعة، وتحسين حجم محلول أنزيم مطلوب تبعا لعدد من التوتة. إذا تم ترك أي ...

في تطور الخلايا T في وقت مبكر، يتم تجنيد نخاع العظام الجذعية المكونة للدم المشتقة من خلية الأسلاف متعدد القدرات لقشرة الغدة الصعترية، والخضوع الالتزام T النسب وتصبح الخلايا التائية السلائف 1. في القشرة، T خلايا CD4 و CD8 السلائف النفي المزدوج (DN) thymocytes توسيع وتفرق في غير ناضج CD4 و CD8 إيجابية المزدوج (DP) thymocytes، وتشكيل مجموعة كبيرة من الأسلاف مع T متغير بدرجة كبيرة مستقبلات الخلايا 1. فقط اختر فرعية MHC المقيدة الخلايا موانئ دبي ستصبح CD4 أو CD8 إيجابية احد (SP) thymocytes، الهجرة إلى النخاع من الغدة الصعترية، وتفرق في الخلايا T الناضجة المختصة وظيفيا، وهو الحدث الذي يشار إليه اختيار إيجابية 2- 6. في المقابل، استنساخ thymocytes لصناعة السيارات في رد الفعل السلبية والخضوع الاختيار تتم إزالة عن طريق موت الخلايا المبرمج، وتحويلها إلى خلايا T التنظيمية للتسامح الذاتي، أو تحويلها إلى الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري لأغراض غير واضحة بعد 3،7-10. في الغدة الصعترية، خلايا انسجة الغدة الصعترية تشكل المكروية فريدة توفير إشارات لهذه مصائر مختلف T تطوير خلية 5،11،12. وتتكون خلايا انسجة الغدة الصعترية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) - بما في ذلك TECS القشرية (cTECs) وTECS النخاع (mTECs)، والخلايا الجذعية، الضامة، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، pericytes المستمدة قمة العصبية والخلايا الوسيطة الأخرى 13-15. من بين هؤلاء، TECS حاسمة في مراحل مختلفة من تطوير خلايا T 1،2،16،17. ومع ذلك، عدم وجود وسيلة قوية لعزل TECS أعاق فهم شامل لمهامهم 16. على وجه الخصوص، cTECs، والتي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها الأسلاف في القشرة، ضرورية لاختيار إيجابية 13،18،19 لأسباب غير واضحة حتى الان. قدمت دراسات سابقة أدلة إلى عدم التجانس ودور TECS، وتعتمد في الغالب على الأدوات الشكلية والنسيجية 13 </suع&gt;. مؤخرا تم تناول أدوار فريدة من مجموعات فرعية من قبل المجلس التنفيذي الانتقالي النهج الوراثية في نماذج الماوس 12،20. وهناك طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل TECS أمر أساسي لتحقيق توصيف غير متحيز من مجموعات فرعية TEC، التقييم الكمي والنوعي للوظائف TEC، وتوضيح آليات دعم cTECs كيفية اختيار إيجابية. نظرا لندرة TECS في الغدة الصعترية والتفاعلات ضيقة أنها تشكل في الجهاز سليمة، وقد تم عزل TECS تحديا. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على الاكتشافات السابقة، الكواشف المتاحة حاليا، والتقنيات، ومعرفة هيكل وتكوين انسجة الغدة الصعترية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، تم الإبلاغ عن عدة إجراءات لتفصيل أنسجة الغدة الصعترية 21-27، والتي كانت تستخدم أنزيمات مختلفة أثناء عملية الهضم، بما في ذلك التربسين، كولاجيناز وDispase. الرمادي وآخرون. مقارنة تلك الانزيمات في precedure من 28 عاما، وذكرت تحسن المنهجياتالتطوير التنظيمي مع الهضم متعددة الخطوات من الكوكتيلات انزيم 29 التي أصبحت تستخدم على نطاق واسع 20،30. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي على الوقت اللازم لإعداد طويل وخطوات عملية الهضم المعقدة والنتائج في أعداد الخلايا ونسب TECS متغير نهائي حتى في نفس الفوج الفئران 29،30. قبل عدة سنوات، Liberase انزيم الصف البحوث، والتي تحتوي على تنقية عالية كولاجيناز والتي البروتيني محايد لاستخدامها في أنسجة الغدة الصعترية التفكك 30. هنا، نحن تصف القائمة على بروتوكول الهضم Liberase، مع إجراءات الفصل الميكانيكي الأمثل، ويمكن أن ينتج عددا كبيرا من TECS قابلة للحياة من الأنسجة الماوس الغدة الصعترية. . لإثراء خلايا انسجة فصلها، استخدمت الدراسات السابقة إما التدرجات كثافة المغناطيسي أو حبة فصل 21،29. ومع ذلك، كل الطرق تؤدي شديدة فقدت السكان معين من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة سكان cTECs 29. القضاء السامة للخلايا والتقنيات بالغسل <sتصل&gt; 31،32 وقد استخدمت على نطاق واسع للنضوب أو فصل الخلايا الليمفاوية في مجال المناعية 12،31. بعد المقارنة بين هذه التقنيات، أنشأنا بروتوكول بالغسل الحالي للتخصيب TECS. الشرط طيف أثناء إجراء تخصيب يؤدي إلى موت الخلايا أقل وغير متحيزة وزيادة الانتعاش TEC. تعليق خلية الغدة الصعترية معزولة وصفها في القسم 3 يمكن تطبيقها مباشرة في التدفق تحليل cytometric لتحديد وتوصيف فرعية TEC والخلايا الجذعية. يصف القسم 4 طريقة بسيطة ومفيدة لتحديد مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي باستخدام تدفق عداد الكريات multiparameter. يمكن للتجارب التي تسعى للحصول على cTECs تنقيته أو mTECs، والإثراء TEC وخلية فرز الإجراءات يمكن العثور عليها في القسم 5 و 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:487px;">Anti-mouse EpCAM</td>
			<td style="width:153px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">XX-5791-YY*</td>
			<td style="width:163px;">Clone G8.8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse MHC II</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5321-YY*</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse Ly51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5891-YY*</td>
			<td>Clone 6C3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UEA-1</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>FL-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td>TreeStar - Flowjo</td>
			<td>FlowJo v7/9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

الغدة الصعترية هي جهاز حيوي لتنمية الخلايا اللمفاوية T. خلايا انسجة الغدة الصعترية، الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (TECS) هي الحاسمة ولا سيما في مراحل متعددة من تطوير خلايا T: التزام الخلايا T، واختيار الإيجابية والسلبية الاختيار. ومع ذلك، يبقى فهم وظيفة TECS في الغدة الصعترية غير كامل. في المقالة، ونحن نقدم طريقة لعزل مجموعات فرعية من المجلس التنفيذي الانتقالي الغدة الصعترية الماوس جديدة باستخدام مزيج من اضطراب الميكانيكية والهضم الأنزيمي. طريقة تمكن خلايا انسجة الغدة الصعترية وthymocytes أن أفرجت كفاءة من خلية خلية والاتصالات مصفوفة خارج الخلية وخلايا لتشكيل تعليق خلية واحدة. باستخدام الخلايا المعزولة، multiparameter التدفق الخلوي يمكن تطبيقها على تحديد وتوصيف TECS والخلايا الجذعية. لأن TECS هي السكان الخلية نادر في الغدة الصعترية، ونحن أيضا وصف وسيلة فعالة لإثراء وتنقية TECS بواسطة المستنفدة thymocytes، نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الغدة الصعترية. فولوجناح التخصيب خلية فرز الوقت يمكن انخفضت حتى يمكن التقليل من تلك الخسارة من بقاء الخلية خلال تنقية TECS. تنقية الخلايا هي مناسبة لمختلف التحليلات المصب مثل الوقت الحقيقي-PCR، لطخة غربية والتنميط التعبير الجيني. سوف بروتوكول تعزيز البحوث المتعلقة بالوظيفة TEC وكذلك تطوير في المختبر إعادة الخلايا التائية.

باستخدام هذا البروتوكول، تمت إزالة جهاز الغدة الصعترية من الماوس الكبار (القسم 2) وتعليق خلية الغدة الصعترية تم إعداده على النحو المبين في القسم 3. تألف تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من thymocytes، وخلايا انسجة المكونة للدم والمشتقة من خلايا انسجة غير المكونة للدم. يتم...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells at JoVE.com

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.7K Views.  University of Minnesota.  نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية. 

Video: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.