وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI088209 (إلى KAH). كما نشكر جامعة مينيسوتا التدفق الخلوي الموارد.

في هذه الدراسة، والكبار - استخدمت (6 8 أسابيع) أنثى C57BL / 6 الفئران. تم شراء الفئران من المعهد الوطني للسرطان والحفاظ عليها في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. وافقت جامعة جنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مينيسوتا (IACUC) جميع التجارب على الحيوانات. 1. إعداد أدوات والمخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول أنزيم (RPMI1640 المتوسطة مع 0.05٪ [ث / ت] من Liberase TH و 100 U / مل من الدناز I)، عازلة الألبومين الغني (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] مع 0.5٪ المصل البقري الزلال و 2 ملي حمض الإيثيلنديامين Tetraacetic [EDTA])، FACS العازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 0.02٪ نان 3)، FACS فرز عازلة (1X PBS [كا 2+ / المغنيسيوم 2+ خالية] تحتوي على 2٪ FBS)، وRP10 المتوسطة (متوسطة RPMI-1640 توفيره مع 10٪ FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات 10 بالغسل. تحضير 40 مل من محلول طلاء (0.01 ملغ / مل Gالشوفان مكافحة فأر مفتش في 0.1 M NaHCO 3 العازلة)، وإضافة 4 مل من محلول طلاء في كل 100 × 15 مم لوحة، دوامة واحتضان عند 4 درجات CO / N. تخلصي حل الأجسام المضادة وشطف لوحة باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لمدة 2 مرات، دوامة بقوة بين يشطف. تخزين مستعدة لوحات في 4 درجة مئوية. </li></ol> 2. حصاد الأنسجة الغدة الصعترية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في غرفة CO 2. وضع الحيوان على ظهره على حصيرة تشريح، دبوس القدمين على حصيرة والرطب الفراء عن طريق الرش مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط من خلال الجلد، بدءا من فوق فتح مجرى البول مباشرة الى الفك السفلي مع مقص وتوسيع شق أسفل إلى الركبتين على كلا الجانبين. شق يشبه رأسا على عقب &quot;Y&quot;. سحب الجلد فضفاضة مرة أخرى على الجانبين، ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب الحجاب الحاجز من الخنجري، وقطع أضلاعه على كل جانب تصل إلى نحو الترقوة، ثم رفع الأضلاع معملقط ويعلقون عليه إلى حصيرة تشريح. الغدة الصعترية هي فقط تحت الأضلاع، وتبدو مثل اثنين من فصوص بيضاء رقيقة تغمر القلب (الشكل 1). النسيج الضام المحيطة بفصل الغدة الصعترية، وسحب بلطف وإزالة زوج من فصوص الغدة الصعترية مع ملقط مسنن منحنية. مكان فصوص الغدة الصعترية في لوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل RPMI-1640. </li></ol> 3. إعداد خلايا التوتة اللحمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم أي الأنسجة الدهنية والضامة المحيطة ونقل فصوص الغدة الصعترية لبئر جديد للوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل يعد حديثا حل الانزيم. جعل شقوق صغيرة في الفص الصعترية مع مقص غرامة، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف هضم الغدة الصعترية تصل الأنسجة وهبوطا 2 - 3 مرات باستخدام 5 مل ماصة للتفكك الأنسجة. جمع جزء طاف في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل الباردة العازلة الزلال الغنية لتحييد الانزيمات. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد. إضافة 2.5مل من محلول الإنزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الانفعالات الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 18 إبرة G لتفريق المجاميع. تجمع طاف في أنبوب جمع. إضافة 2.5 مل حل انزيم إلى الأنسجة المتبقية واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الإثارة الميكانيكية لطيف مع حقنة 3 مل و 25 إبرة G، واحتضان لوحة إضافي من 5 - 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم الكامل، بركة طاف في أنبوب جمع. الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لجمع الخلايا. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في 10 مل الألبومين الغنية العازلة وتصفية العينة 100 مم من خلال شبكة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ثم نفذ تحليل تدفق cytometic (القسم 4) أو TECS تخصيب (القسم 5). </li></ol> 4. تحديد TECS بواسطة التدفق الخلوي </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا لتركيز النهائي من 4 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر في المخزن FACS لتلطيخ في 96 ذهابا وأسفل جيدا لوحة الاختبار والحفاظ على لوحة على الجليد. إضافة 20 ميكرولتر التيسير حل كتلة (مكافحة CD16 / CD32 الأجسام المضادة في 10 ميكروغرام / مل في المخزن FACS) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد. تدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. تجاهل السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة جهه لأسفل في الحوض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا مكعبات في 100 ميكرولتر كوكتيل الأجسام المضادة (مكافحة CD45، -EpCAM، -MHC الدرجة الثانية، و-Ly51 الأجسام المضادة، وكتين UEA-1 المسمى مع fluorochromes مختلفة في الشركة المصنعة أوصى أو اختبار تركيزات المثلى من كل الأجسام المضادة في المخزن FACS )، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. للتعويض، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا تألقي مع كل فرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بئر وتدور لوحة في 400 x ج، 4 ° C لمدة 3 دقائق. كرر الخطوة غسل واحدالوقت، وresuspend ثم الخلايا في 100 ميكرولتر FACS العازلة. نقل الخلايا إلى 12 × 15 مم الجولة القاع أنبوب FACS مليئة 300 ميكرولتر FACS العازلة. الحصول على العينات على تدفق عداد الكريات وتحليل البيانات باستخدام برامج التحليل FACS. يظهر استراتيجية النابضة المجلس التنفيذي الانتقالي في الشكل 2. </li></ol> 5. إثراء TECS بواسطة بالغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار خلايا الغدة الصعترية (المعد في القسم 3) في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وتعليق الخلايا مكعبات في FACS عازلة فرز بتركيز 2 × 10 8 خلايا لكل مل في 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي. إضافة الأضداد المضادة للCD90.2 (استنساخ 30-H12) (أو مكافحة CD45) في تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل من تعليق خلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، ويغسل مع 5 - حجم 10X من RP10 المتوسط ​​وأنبوب الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات فيRP10 المتوسطة بتركيز 1 × 10 7 لكل مل. إضافة 5 مل تعليق خلية إلى كل لوحة المغلفة بالغسل (المعد في الخطوة 1.3)، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. دوامة بقوة. نقل supernatants في أنبوب مخروطي. شطف لوحة مرتين باستخدام RP10 المتوسطة وتجميع supernatants في أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح السائل وresuspend الخلايا مكعبات في 5 مل RP10 المتوسطة. إضافة تعليق الخلية إلى لوحة بالغسل جديدة، دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. جمع الخلايا شطف لوحة وبركة لهم في أنبوب مخروطي. مرة واحدة يتم إثراء TECS، وتدور أسفل الخلايا في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعليق الخلايا في 5 مل FACS فرز العازلة. </li></ol> 6. تنقية TECS بواسطة الفرز الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد تعليق الخلية بتركيز 4 × 10 7 الخلايا في عازلة FACS الفرز. إضافة الأجسام المضادة ديcribed في القسم 4.4 إلى حل الخلية واحتضان خلايا بلطف على خلاط الدورية في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ، وغسل وتعليق الخلايا إلى تركيز 10 × 10 6 خلايا لكل مل من FACS العازلة الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي من خلال فوهة 100 ميكرومتر باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز. يتم جمع الخلايا مرتبة في 30٪ (V / V) FBS في RPMI-1640). مرة واحدة يتم فرز الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتحضير لتحليل المصب. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li><li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+epithelial+cells:+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection.">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta5t-containing+thymoproteasome:+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8.">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li><li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes.">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li><li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+cells,+life+history,+and+diversity.">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).</li><li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection.">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li><li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus.">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+tolerance:+central+and+peripheral.">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li><li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance.">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li><li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection.">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li><li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li><li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development.">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation.">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li><li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells.">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+CD8++T+cells+need+diversity+when+growing+up.">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li><li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc.">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD8++T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes.">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li><li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection.">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li><li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells.">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li><li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro.">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).</li><li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells.">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li><li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes.">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li><li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen.">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li><li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker,+Ly110.">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li><li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry.">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+analysis,+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells.">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations:+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury.">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li><li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+T+cell+subpopulations.">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li><li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques.">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li><li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses:+morphological+and+serological+characterization.">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li><li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus:+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells.">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes.">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li><li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis.">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

في البروتوكول، الخطوات الحاسمة هي إعداد خلايا انسجة الغدة الصعترية (القسم 3) وإثراء TECS (القسم 4). ويوصى بشدة أن يتم تحضير محلول أنزيم جديد في كل مرة ويتم التعامل مع الأنسجة في أقرب وقت ممكن. لالتوتة المجمعة، وتحسين حجم محلول أنزيم مطلوب تبعا لعدد من التوتة. إذا تم ترك أي ...

في تطور الخلايا T في وقت مبكر، يتم تجنيد نخاع العظام الجذعية المكونة للدم المشتقة من خلية الأسلاف متعدد القدرات لقشرة الغدة الصعترية، والخضوع الالتزام T النسب وتصبح الخلايا التائية السلائف 1. في القشرة، T خلايا CD4 و CD8 السلائف النفي المزدوج (DN) thymocytes توسيع وتفرق في غير ناضج CD4 و CD8 إيجابية المزدوج (DP) thymocytes، وتشكيل مجموعة كبيرة من الأسلاف مع T متغير بدرجة كبيرة مستقبلات الخلايا 1. فقط اختر فرعية MHC المقيدة الخلايا موانئ دبي ستصبح CD4 أو CD8 إيجابية احد (SP) thymocytes، الهجرة إلى النخاع من الغدة الصعترية، وتفرق في الخلايا T الناضجة المختصة وظيفيا، وهو الحدث الذي يشار إليه اختيار إيجابية 2- 6. في المقابل، استنساخ thymocytes لصناعة السيارات في رد الفعل السلبية والخضوع الاختيار تتم إزالة عن طريق موت الخلايا المبرمج، وتحويلها إلى خلايا T التنظيمية للتسامح الذاتي، أو تحويلها إلى الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري لأغراض غير واضحة بعد 3،7-10. في الغدة الصعترية، خلايا انسجة الغدة الصعترية تشكل المكروية فريدة توفير إشارات لهذه مصائر مختلف T تطوير خلية 5،11،12. وتتكون خلايا انسجة الغدة الصعترية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) - بما في ذلك TECS القشرية (cTECs) وTECS النخاع (mTECs)، والخلايا الجذعية، الضامة، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، pericytes المستمدة قمة العصبية والخلايا الوسيطة الأخرى 13-15. من بين هؤلاء، TECS حاسمة في مراحل مختلفة من تطوير خلايا T 1،2،16،17. ومع ذلك، عدم وجود وسيلة قوية لعزل TECS أعاق فهم شامل لمهامهم 16. على وجه الخصوص، cTECs، والتي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها الأسلاف في القشرة، ضرورية لاختيار إيجابية 13،18،19 لأسباب غير واضحة حتى الان. قدمت دراسات سابقة أدلة إلى عدم التجانس ودور TECS، وتعتمد في الغالب على الأدوات الشكلية والنسيجية 13 </suع&gt;. مؤخرا تم تناول أدوار فريدة من مجموعات فرعية من قبل المجلس التنفيذي الانتقالي النهج الوراثية في نماذج الماوس 12،20. وهناك طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل TECS أمر أساسي لتحقيق توصيف غير متحيز من مجموعات فرعية TEC، التقييم الكمي والنوعي للوظائف TEC، وتوضيح آليات دعم cTECs كيفية اختيار إيجابية. نظرا لندرة TECS في الغدة الصعترية والتفاعلات ضيقة أنها تشكل في الجهاز سليمة، وقد تم عزل TECS تحديا. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على الاكتشافات السابقة، الكواشف المتاحة حاليا، والتقنيات، ومعرفة هيكل وتكوين انسجة الغدة الصعترية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، تم الإبلاغ عن عدة إجراءات لتفصيل أنسجة الغدة الصعترية 21-27، والتي كانت تستخدم أنزيمات مختلفة أثناء عملية الهضم، بما في ذلك التربسين، كولاجيناز وDispase. الرمادي وآخرون. مقارنة تلك الانزيمات في precedure من 28 عاما، وذكرت تحسن المنهجياتالتطوير التنظيمي مع الهضم متعددة الخطوات من الكوكتيلات انزيم 29 التي أصبحت تستخدم على نطاق واسع 20،30. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي على الوقت اللازم لإعداد طويل وخطوات عملية الهضم المعقدة والنتائج في أعداد الخلايا ونسب TECS متغير نهائي حتى في نفس الفوج الفئران 29،30. قبل عدة سنوات، Liberase انزيم الصف البحوث، والتي تحتوي على تنقية عالية كولاجيناز والتي البروتيني محايد لاستخدامها في أنسجة الغدة الصعترية التفكك 30. هنا، نحن تصف القائمة على بروتوكول الهضم Liberase، مع إجراءات الفصل الميكانيكي الأمثل، ويمكن أن ينتج عددا كبيرا من TECS قابلة للحياة من الأنسجة الماوس الغدة الصعترية. . لإثراء خلايا انسجة فصلها، استخدمت الدراسات السابقة إما التدرجات كثافة المغناطيسي أو حبة فصل 21،29. ومع ذلك، كل الطرق تؤدي شديدة فقدت السكان معين من خلايا انسجة الغدة الصعترية، وخاصة سكان cTECs 29. القضاء السامة للخلايا والتقنيات بالغسل <sتصل&gt; 31،32 وقد استخدمت على نطاق واسع للنضوب أو فصل الخلايا الليمفاوية في مجال المناعية 12،31. بعد المقارنة بين هذه التقنيات، أنشأنا بروتوكول بالغسل الحالي للتخصيب TECS. الشرط طيف أثناء إجراء تخصيب يؤدي إلى موت الخلايا أقل وغير متحيزة وزيادة الانتعاش TEC. تعليق خلية الغدة الصعترية معزولة وصفها في القسم 3 يمكن تطبيقها مباشرة في التدفق تحليل cytometric لتحديد وتوصيف فرعية TEC والخلايا الجذعية. يصف القسم 4 طريقة بسيطة ومفيدة لتحديد مجموعات فرعية المجلس التنفيذي الانتقالي باستخدام تدفق عداد الكريات multiparameter. يمكن للتجارب التي تسعى للحصول على cTECs تنقيته أو mTECs، والإثراء TEC وخلية فرز الإجراءات يمكن العثور عليها في القسم 5 و 6.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

الغدة الصعترية هي جهاز حيوي لتنمية الخلايا اللمفاوية T. خلايا انسجة الغدة الصعترية، الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (TECS) هي الحاسمة ولا سيما في مراحل متعددة من تطوير خلايا T: التزام الخلايا T، واختيار الإيجابية والسلبية الاختيار. ومع ذلك، يبقى فهم وظيفة TECS في الغدة الصعترية غير كامل. في المقالة، ونحن نقدم طريقة لعزل مجموعات فرعية من المجلس التنفيذي الانتقالي الغدة الصعترية الماوس جديدة باستخدام مزيج من اضطراب الميكانيكية والهضم الأنزيمي. طريقة تمكن خلايا انسجة الغدة الصعترية وthymocytes أن أفرجت كفاءة من خلية خلية والاتصالات مصفوفة خارج الخلية وخلايا لتشكيل تعليق خلية واحدة. باستخدام الخلايا المعزولة، multiparameter التدفق الخلوي يمكن تطبيقها على تحديد وتوصيف TECS والخلايا الجذعية. لأن TECS هي السكان الخلية نادر في الغدة الصعترية، ونحن أيضا وصف وسيلة فعالة لإثراء وتنقية TECS بواسطة المستنفدة thymocytes، نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الغدة الصعترية. فولوجناح التخصيب خلية فرز الوقت يمكن انخفضت حتى يمكن التقليل من تلك الخسارة من بقاء الخلية خلال تنقية TECS. تنقية الخلايا هي مناسبة لمختلف التحليلات المصب مثل الوقت الحقيقي-PCR، لطخة غربية والتنميط التعبير الجيني. سوف بروتوكول تعزيز البحوث المتعلقة بالوظيفة TEC وكذلك تطوير في المختبر إعادة الخلايا التائية.

باستخدام هذا البروتوكول، تمت إزالة جهاز الغدة الصعترية من الماوس الكبار (القسم 2) وتعليق خلية الغدة الصعترية تم إعداده على النحو المبين في القسم 3. تألف تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من thymocytes، وخلايا انسجة المكونة للدم والمشتقة من خلايا انسجة غير المكونة للدم. يتم...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells at JoVE.com

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.9K Views.  University of Minnesota.  نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل، وتحديد، وتنقية الخلايا الظهارية الماوس الغدة الصعترية (TECS). ويمكن استخدام بروتوكول للدراسات وظيفة الغدة الصعترية التطور الطبيعي للخلايا T، خلل الغدة الصعترية، وإعادة الخلايا التائية. 

Video: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Developmental Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biology

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

تحسين عزل الخلايا اللحمية من الغدة الصعترية ونخاع العظام

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث المكونة للدم باستخدام عزل الخلايا اللحمية لتسلسل الخلية المفردة

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis