Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 AI088209 (zu KAH) unterstützt. Wir danken auch der University of Minnesota Durchflusszytometrie Ressource.

In dieser Studie Erwachsenen - wurden (6 8 Wochen) weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet. Mäuse wurden von der National Cancer Institute gekauft und unter spezifischen Pathogen freien Bedingungen gehalten. Die Universität von Minnesota Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt alle Tierversuche. 1. Vorbereitung der Instrumente und Puffer <ol><li> Vorbereitung Enzymlösung (RPMI1640-Medium mit 0,05% [w / v] von Liberase TH und 100 U / ml DNase I), Albumin-reichen Puffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem] mit 0,5% Rinderserum Albumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]), FACS-Puffer (1 × PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 1% fötales Rinderserum [FBS] und 0,02% NaN 3), FACS Sortierpuffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 2% FBS) und RP10 Medium (RPMI-1640-Medium mit 10% FBS zugeführt wird). </li><li> Bereiten Sie 10 Panning-Platten. Vorbereitung 40 ml Beschichtungslösung (0,01 mg / ml GHafer anti-Rat IgG in 0,1 M NaHCO 3-Puffer) und 4 ml Beschichtungslösung in jede 100 x 15 mm-Platte, Wirbel und Inkubation bei 4 ° CO / N. Abgießen Antikörperlösung und spülen Sie die Platte mit 5 ml 1x PBS für 2-fache, wirbeln kräftig zwischen Spülungen. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten bei 4 ° C. </li></ol> 2. Ernte des Thymus Tissue <ol><li> Einschläfern Maus in einem CO 2 Kammer. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Matte Dissektion, stecken Sie die Füße auf der Matte und nass das Fell durch Besprühen mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt durch die Haut, ausgehend von dem oben Harnröhrenöffnung gerade nach oben, um den Unterkiefer mit Schere und erweitern den Schnitt nach unten bis zu den Knien auf beiden Seiten. Der Schnitt sieht aus wie ein umgedrehtes &quot;Y&quot;. Ziehen Sie die lose Haut wieder an den Seiten, und stecken Sie es in die Dissektion Matte. </li><li> Punktion der Membran von dem Schwertfortsatz, schneiden Sie die Rippen auf jeder Seite bis zu dem Schlüsselbein, dann heben Sie die Rippen mitPinzette und stecken Sie es in die Dissektion Matte. Der Thymus ist nur unter den Rippen, und sieht aus wie zwei dünnen weißen Lappen, die über dem Herzen (Abbildung 1). Trennen Bindegewebe rund um den Thymus, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das Paar Thymus Lappen mit gebogenen Pinzette Wellenschliff. Ort Thymus Lappen in eine 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI-1640. </li></ol> 3. Vorbereitung der Thymusstroma Cells <ol><li> Trim umgebenden Fett-und Bindegewebe und übertragen Sie die Thymus Lappen zu einem neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml frisch zubereiten Enzymlösung. Machen kleine Schnitte in den Thymus Lappen mit einer feinen Schere, und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Vorsichtig pipettieren verdauen Thymusgewebes oben und unten 2 - 3 mal mit 5 ml Pipette für Gewebedissoziation. Sammeln Standsfraktion in einer 50-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem albuminreichen Puffer, Enzyme zu neutralisieren. Halten Sie den Sammelröhrchen auf Eis. 2.5 hinzufügenml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Führen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und 18 G-Nadel, um Aggregate aufzubrechen. Pool Überstand in das Sammelrohr. Hinzufügen von 2,5 ml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Wiederholen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel, und Inkubation der Platte zusätzliche 5 - 10 min. </li><li> Nach der vollständigen Verdauung, bündeln den Überstand in das Sammelrohr. Zentrifuge wird das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 8 Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Flüssigkeit und die pelletierten Zellen in 10 ml auszusetzen Albumin-reiche Puffer und Filter die Probe durch 100 mm Maschen. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Führen Sie dann Fluss cytometic Analyse (Abschnitt 4) oder TEC Bereicherung (§ 5). </li></ol> 4. Identifizierung von TEC mittels Durchflusszytometrie </p&gt; <ol><li> Vorbereitung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 4 x 10 6 Zellen pro 100 ul in FACS-Puffer für die Färbung in einer 96-Well-Rundboden-Testplatte und halten die Platte auf Eis. Mit 20 ul Fc Blocklösung (anti-CD16 / CD32-Antikörper bei 10 ug / ml in FACS-Puffer) zu den Zellen und Inkubieren der Zellen für 10 min auf Eis. Drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Verwerfen Flüssigkeit aus Brunnen durch Schwenken der Platte nach unten in ein Waschbecken. </li><li> Suspendieren die pelletierten Zellen in 100 ul Antikörper-Cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC Klasse II, und -Ly51 Antikörper und die UEA-1-Lektin mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen an Hersteller gekennzeichnet empfohlen oder getestet optimalen Konzentrationen jedes Antikörpers in FACS-Puffer ) und Inkubation der Zellen auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Zur Kompensation Fleck 1 x 10 6 Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom. </li><li> 100 l FACS-Puffer in jede Vertiefung und drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie den Waschschritt einZeit, und dann Zellen in 100 ul FACS-Puffer. Übertragung der Zellen auf eine 12 x 15 mm-Rund FACS-Röhrchen mit 300 ul FACS-Puffer gefüllt. Erwerben Proben auf Durchflusszytometer und Daten mit Hilfe der FACS-Analyse-Software zu analysieren. TEC Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt. </li></ol> 5. Anreicherung von TEC durch Schwenken <ol><li> Spin-Down der Thymus-Zellen (in Abschnitt 3 hergestellt) bei 400 g, 4 ° C für 5 min. Aspirieren der Flüssigkeit und der pelletierten Zellen in FACS-Sortierpuffer auszusetzen bei einer Konzentration von 2 x 10 8 Zellen pro ml in einem 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Anti CD90.2-Antikörpers (Klon 30-H12) (oder anti-CD45) bei einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml Zellsuspension und inkubieren Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen mit einer 5 - 10-fach Volumen von RP10 Medium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen inRP10-Medium bei einer Konzentration von 1 x 10 7 pro ml. 5 ml Zellsuspension auf jeden beschichteten Schwenkplatte (in Schritt 1.3 vorbereitet), Wirbel und Inkubation für 30 min bei RT. Wirbeln kräftig; die Überstände wurden in einem konischen Rohr. Spülen Sie die Platte zweimal mit RP10 Medium und den Pool des Überstände in das Sammelrohr. </li><li> Zentrifugieren Sie das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 5 min. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen in 5 ml Medium RP10. Fügen Sie die Zellsuspension auf eine neue Platte Panning, schwenken und Inkubation für 30 min bei RT. Sammeln die Zellen spülen Sie die Platte und bündeln sie zu einem konischen Rohr. Sobald TEC angereichert sind, Spin-Down der Zellen bei 400 g, 4 ° C für 5 min und Suspend-Zellen in 5 ml FACS-Sortierpuffer. </li></ol> 6. Reinigung von TEC durch Zellsortierung <ol><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten Zellsuspension mit einer Konzentration von 4 x 10 7 Zellen in FACS-Sortierpuffers. Antikörper des hinzufügencribed in Abschnitt 4.4 in Zell-Lösung und Inkubation Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Färbung, Wäsche und Zellen zu suspendieren, um eine Konzentration von 10 x 10 6 Zellen pro ml FACS-Sortierpuffers. </li><li> Sortier TEC Teilmengen durch ein 100 uM Düse mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Sortiert Zelle werden in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640) gesammelt. Sobald Zellsortierung wird, Zentrifuge Zellen durchgeführt bei 400 g, 4 ° C für 5 min und die Vorbereitungen für Downstream-Analyse. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In dem Protokoll sind wichtige Schritte der Zubereitung des Thymus Stromazellen (Abschnitt 3) und die Anreicherung von TEC (Abschnitt 4). Es wird empfohlen, dass frische Enzymlösung wird jeweils hergestellt, und das Gewebe wird so bald wie möglich behandelt. Für gepoolt Thymi Optimierung des Volumens der Enzymlösung wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Thymi erforderlich. Wenn eine Gewebereste nach der Verarbeitung zurückbleiben, zu Hinzufügen von mehr Enzymlösung und Verlängerung der Inkubationszeit Zellaus...

Frühen T-Zell-Entwicklung werden Knochenmark hämatopoetische Stammzellen abgeleiteten multipotenten Vorläuferzellen an der Rinde des Thymus rekrutiert zogen Engagement der T-Linie und zu T-Zell-Vorläufer 1. In der Rinde, T-Zell-Vorläufer-CD4 und CD8 doppelt negative (DN) Thymozyten erweitern und differenzieren sich in unreifen CD4 und CD8 doppelt positiven (DP) Thymozyten, bilden einen großen Pool von Vorläuferzellen mit sehr unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren 1. Nur eine ausgewählte MHC-beschränkten Teilmenge von DP-Zellen werden CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) Thymozyten zu werden, wandern in der Medulla des Thymus und differenzieren sich in funktional zuständigen reifen T-Zellen, eine Veranstaltung, die als positive Selektion bezeichnet wird 2 6. Im Gegensatz dazu Klone von autoreaktiven Thymozyten zogen negative Selektion und über Apoptose entfernt, um regulatorische T-Zellen, die für Selbst-Toleranz umgewandelt oder intraepitheliale Lymphozyten für Zwecke, die nicht klar sind, abgeleitet 3,7-10. Im Thymus Thymus-Stromazellen bilden eine einzigartige Mikroumgebung, die Signale für die verschiedenen T-Zell-Entwicklung Schicksale 5,11,12. Einschließlich Rinden TECs (CTEC) und Mark TECs (mTEZ), dendritische Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Neuralleiste stamm Perizyten und anderen mesenchymalen Zellen 13-15 - Thymus-Stroma-Zellen von Thymus-Epithelzellen (TECs) besteht. Unter diesen sind TECs entscheidend auf den verschiedenen Stufen der T-Zell-Entwicklung 1,2,16,17. Allerdings hat noch kein robuster Weg zu isolieren TEC ein umfassendes Verständnis ihrer Funktionen 16 behindert. Insbesondere CTEC, die eine dreidimensionale Netzwerk umgebenden Vorläuferzellen im Cortex zu bilden, sind für die positive Selektion 13,18,19 aus Gründen, die nicht klar sind. Frühere Studien lieferten Hinweise auf die Heterogenität und die Rolle der TEC, meist unter Berufung auf morphologische und histologische Werkzeuge 13 </sup&gt;. Vor kurzem hat die einzigartige Rolle der TEC Teilmengen wurden durch genetische Ansätze in Mausmodellen 12,20 gerichtet. Eine robuste und reproduzierbare Weise zu isolieren TEC ist von grundlegender Bedeutung, um unvoreingenommene Charakterisierung von TEC Teilmengen, quantitative und qualitative Bewertung der TEC-Funktionen, und die Klärung der Mechanismen zu erreichen, wie CTEC unterstützt positive Selektion. Aufgrund der Seltenheit von TECs im Thymus und den engen Wechselwirkungen sie im intakten Organ zu bilden, die Isolierung von TECs wurde schwierig. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf früheren Entdeckungen, die derzeit erhältlichen Reagenzien, Techniken und Kenntnisse der Thymus Struktur und Stromazellen Zusammensetzung. Vor fast zwei Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren berichtet, Thymus Gewebe 21-27, in denen verschiedene Enzyme wurden während der Verdauung verwendet werden, einschließlich Trypsin, Collagenase und Dispase aufzuschlüsseln. Gray et al. verglichen diese Enzyme in ihrer precedure 28 und berichtet eine verbesserte Method mit einem mehrstufigen Verdauung von Enzym-Cocktails, die 29 wurde weit verbreitet 20,30. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren eine lange Vorbereitungszeit und komplexe Schritte Verdauung und führt variable endgültige Zellzahlen und Mengenverhältnisse der TECs sogar in der gleichen Maus-Kohorte 29,30. Vor einigen Jahren Liberase Research Grade Enzym enthält hoch gereinigte Kollagenase und neutraler Protease begonnen, in Thymus Gewebedissoziation 30 verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Liberase Verdauung-basiertes Protokoll, mit optimierten mechanischen Trennverfahren, die eine hohe Anzahl von lebensfähigen TEC aus Maus-Thymus Gewebe ergibt. . Dissoziiert Stromazellen zu bereichern, haben frühere Studien entweder Dichtegradienten oder Magnetkügelchen Trennung 21,29 eingesetzt. , Verursachen jedoch beide Methoden schweren verloren bestimmter Populationen von Thymusstroma Zellen, insbesondere der Bevölkerung von 29 CTEC. Zytotoxische Eliminierung und Panning-Techniken <sbis&gt; 31,32 sind weithin zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Lymphozyten in dem immunologischen Gebiet 12,31 verwendet. Nach dem Vergleich dieser Techniken haben wir die aktuellen Panning-Protokoll zur Anreicherung von TEC. Die sanfte Zustand während der Anreicherungsverfahren führt zu weniger Zelltod und unvoreingenommene und erhöhte TEC Erholung. Die in Abschnitt 3 beschriebenen isolierten Thymus Zellsuspension kann direkt angewendet werden, um durchflusszytometrische Analyse fließen zur Identifizierung und Charakterisierung von TEC Teilmengen und dendritischen Zellen. Abschnitt 4 beschreibt eine einfache und nützliche Methode, um Untergruppen mit TEC Multi Durchflusszytometer zu identifizieren. Für Experimente, die gereinigt oder CTEC mTEZ, TEC Bereicherung und Zellsortierverfahren zu erhalten suchen, finden Sie in Kapitel 5 und 6 zu finden.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

Der Thymus ist ein wichtiges Organ für die T-Lymphozyten-Entwicklung. Von Thymus-Stromazellen sind Thymus-Epithelzellen (TEC) besonders wichtig in mehreren Stufen von T-Zell-Entwicklung: T-Zell-Engagement, positive und negative Selektionsauswahl. Allerdings bleibt die Funktion der TEC in der Thymusdrüse unvollständig verstanden. In dem Artikel wird ein Verfahren zur TEC Teilmengen aus frischen Maus Thymus mit einer Kombination von mechanischen Störungen und enzymatische Verdauung zu isolieren. Das Verfahren ermöglicht Thymus-Stroma-Zellen und Thymozyten effizient von Zell-Zell-und Zell-extrazellulären Matrix-Verbindungen freigesetzt werden, und um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Verwendung der isolierten Zellen können Multi Durchflusszytometrie, um die Identifizierung und Charakterisierung von TECs und dendritischen Zellen verwendet werden. Da TEC sind eine seltene Zellpopulation im Thymus, wir beschreiben auch eine effektive Möglichkeit zu bereichern und zu reinigen TEC durch abbau Thymozyten, die am häufigsten vorkommende Zelltyp im Thymus. FolloFlügel die Anreicherung, Zellsortierzeit kann verringert werden, so dass der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen kann während der Reinigung von TEC minimiert werden. Gereinigten Zellen sind für verschiedene Downstream-Analysen wie Echtzeit-PCR, Western-Blot-und Gen-Expressionsprofilen. Das Protokoll wird die Forschung von TEC-Funktion und so gut wie die Entwicklung von in-vitro-T-Zell-Rekonstitution zu fördern.

Mit diesem Protokoll wurde ein Thymus Organ von einer erwachsenen Maus (Abschnitt 2) und einer Thymus-Zellsuspension entfernt wurde, wie in Abschnitt 3 skizzierten Die erhaltene Zellsuspension bestand aus Thymozyten hämatopoetischen abgeleiteten Stromazellen und nicht-hämatopoetischen Stromazellen. CD45 ist ein hämatopoetischer pan-Marker exprimiert auf beiden Thymozyten und hämatopoetische stromale Zellen, wie Makrophagen und dendritischen Zellen. Im Gegensatz dazu sind TECs nicht hämatopoetischen Ursprungs und ni...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K Aufrufe.  University of Minnesota.  Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden. 

Serie: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologie

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Optimierung der Isolierung von Stromazellen aus Thymus und Knochenmark

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der hämatopoetischen Forschung mit Stromazellisolierung für die Einzelzellsequenzierung

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis