Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 AI088209 (zu KAH) unterstützt. Wir danken auch der University of Minnesota Durchflusszytometrie Ressource.

In dieser Studie Erwachsenen - wurden (6 8 Wochen) weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet. Mäuse wurden von der National Cancer Institute gekauft und unter spezifischen Pathogen freien Bedingungen gehalten. Die Universität von Minnesota Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt alle Tierversuche. 1. Vorbereitung der Instrumente und Puffer <ol><li> Vorbereitung Enzymlösung (RPMI1640-Medium mit 0,05% [w / v] von Liberase TH und 100 U / ml DNase I), Albumin-reichen Puffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem] mit 0,5% Rinderserum Albumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]), FACS-Puffer (1 × PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 1% fötales Rinderserum [FBS] und 0,02% NaN 3), FACS Sortierpuffer (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -freiem], enthaltend 2% FBS) und RP10 Medium (RPMI-1640-Medium mit 10% FBS zugeführt wird). </li><li> Bereiten Sie 10 Panning-Platten. Vorbereitung 40 ml Beschichtungslösung (0,01 mg / ml GHafer anti-Rat IgG in 0,1 M NaHCO 3-Puffer) und 4 ml Beschichtungslösung in jede 100 x 15 mm-Platte, Wirbel und Inkubation bei 4 ° CO / N. Abgießen Antikörperlösung und spülen Sie die Platte mit 5 ml 1x PBS für 2-fache, wirbeln kräftig zwischen Spülungen. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten bei 4 ° C. </li></ol> 2. Ernte des Thymus Tissue <ol><li> Einschläfern Maus in einem CO 2 Kammer. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Matte Dissektion, stecken Sie die Füße auf der Matte und nass das Fell durch Besprühen mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt durch die Haut, ausgehend von dem oben Harnröhrenöffnung gerade nach oben, um den Unterkiefer mit Schere und erweitern den Schnitt nach unten bis zu den Knien auf beiden Seiten. Der Schnitt sieht aus wie ein umgedrehtes &quot;Y&quot;. Ziehen Sie die lose Haut wieder an den Seiten, und stecken Sie es in die Dissektion Matte. </li><li> Punktion der Membran von dem Schwertfortsatz, schneiden Sie die Rippen auf jeder Seite bis zu dem Schlüsselbein, dann heben Sie die Rippen mitPinzette und stecken Sie es in die Dissektion Matte. Der Thymus ist nur unter den Rippen, und sieht aus wie zwei dünnen weißen Lappen, die über dem Herzen (Abbildung 1). Trennen Bindegewebe rund um den Thymus, ziehen Sie vorsichtig und entfernen Sie das Paar Thymus Lappen mit gebogenen Pinzette Wellenschliff. Ort Thymus Lappen in eine 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI-1640. </li></ol> 3. Vorbereitung der Thymusstroma Cells <ol><li> Trim umgebenden Fett-und Bindegewebe und übertragen Sie die Thymus Lappen zu einem neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml frisch zubereiten Enzymlösung. Machen kleine Schnitte in den Thymus Lappen mit einer feinen Schere, und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Vorsichtig pipettieren verdauen Thymusgewebes oben und unten 2 - 3 mal mit 5 ml Pipette für Gewebedissoziation. Sammeln Standsfraktion in einer 50-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem albuminreichen Puffer, Enzyme zu neutralisieren. Halten Sie den Sammelröhrchen auf Eis. 2.5 hinzufügenml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Führen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und 18 G-Nadel, um Aggregate aufzubrechen. Pool Überstand in das Sammelrohr. Hinzufügen von 2,5 ml Enzymlösung zu der verbleibenden Gewebes und Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Wiederholen sanfte mechanische Bewegung mit einem 3-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel, und Inkubation der Platte zusätzliche 5 - 10 min. </li><li> Nach der vollständigen Verdauung, bündeln den Überstand in das Sammelrohr. Zentrifuge wird das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 8 Minuten, um die Zellen zu sammeln. Saugen Sie die Flüssigkeit und die pelletierten Zellen in 10 ml auszusetzen Albumin-reiche Puffer und Filter die Probe durch 100 mm Maschen. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Führen Sie dann Fluss cytometic Analyse (Abschnitt 4) oder TEC Bereicherung (§ 5). </li></ol> 4. Identifizierung von TEC mittels Durchflusszytometrie </p&gt; <ol><li> Vorbereitung der Zellen bis zu einer Endkonzentration von 4 x 10 6 Zellen pro 100 ul in FACS-Puffer für die Färbung in einer 96-Well-Rundboden-Testplatte und halten die Platte auf Eis. Mit 20 ul Fc Blocklösung (anti-CD16 / CD32-Antikörper bei 10 ug / ml in FACS-Puffer) zu den Zellen und Inkubieren der Zellen für 10 min auf Eis. Drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Verwerfen Flüssigkeit aus Brunnen durch Schwenken der Platte nach unten in ein Waschbecken. </li><li> Suspendieren die pelletierten Zellen in 100 ul Antikörper-Cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC Klasse II, und -Ly51 Antikörper und die UEA-1-Lektin mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen an Hersteller gekennzeichnet empfohlen oder getestet optimalen Konzentrationen jedes Antikörpers in FACS-Puffer ) und Inkubation der Zellen auf Eis für 20 Minuten im Dunkeln. Zur Kompensation Fleck 1 x 10 6 Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom. </li><li> 100 l FACS-Puffer in jede Vertiefung und drehen Sie die Platte bei 400 g, 4 ° C für 3 min. Wiederholen Sie den Waschschritt einZeit, und dann Zellen in 100 ul FACS-Puffer. Übertragung der Zellen auf eine 12 x 15 mm-Rund FACS-Röhrchen mit 300 ul FACS-Puffer gefüllt. Erwerben Proben auf Durchflusszytometer und Daten mit Hilfe der FACS-Analyse-Software zu analysieren. TEC Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt. </li></ol> 5. Anreicherung von TEC durch Schwenken <ol><li> Spin-Down der Thymus-Zellen (in Abschnitt 3 hergestellt) bei 400 g, 4 ° C für 5 min. Aspirieren der Flüssigkeit und der pelletierten Zellen in FACS-Sortierpuffer auszusetzen bei einer Konzentration von 2 x 10 8 Zellen pro ml in einem 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Anti CD90.2-Antikörpers (Klon 30-H12) (oder anti-CD45) bei einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml Zellsuspension und inkubieren Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen mit einer 5 - 10-fach Volumen von RP10 Medium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen inRP10-Medium bei einer Konzentration von 1 x 10 7 pro ml. 5 ml Zellsuspension auf jeden beschichteten Schwenkplatte (in Schritt 1.3 vorbereitet), Wirbel und Inkubation für 30 min bei RT. Wirbeln kräftig; die Überstände wurden in einem konischen Rohr. Spülen Sie die Platte zweimal mit RP10 Medium und den Pool des Überstände in das Sammelrohr. </li><li> Zentrifugieren Sie das Sammelrohr bei 400 × g, 4 ° C für 5 min. Saugen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren pelletierten Zellen in 5 ml Medium RP10. Fügen Sie die Zellsuspension auf eine neue Platte Panning, schwenken und Inkubation für 30 min bei RT. Sammeln die Zellen spülen Sie die Platte und bündeln sie zu einem konischen Rohr. Sobald TEC angereichert sind, Spin-Down der Zellen bei 400 g, 4 ° C für 5 min und Suspend-Zellen in 5 ml FACS-Sortierpuffer. </li></ol> 6. Reinigung von TEC durch Zellsortierung <ol><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten Zellsuspension mit einer Konzentration von 4 x 10 7 Zellen in FACS-Sortierpuffers. Antikörper des hinzufügencribed in Abschnitt 4.4 in Zell-Lösung und Inkubation Zellen vorsichtig auf einem Rotationsmischer bei 4 ° C für 30 min. Nach der Färbung, Wäsche und Zellen zu suspendieren, um eine Konzentration von 10 x 10 6 Zellen pro ml FACS-Sortierpuffers. </li><li> Sortier TEC Teilmengen durch ein 100 uM Düse mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Sortiert Zelle werden in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640) gesammelt. Sobald Zellsortierung wird, Zentrifuge Zellen durchgeführt bei 400 g, 4 ° C für 5 min und die Vorbereitungen für Downstream-Analyse. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In dem Protokoll sind wichtige Schritte der Zubereitung des Thymus Stromazellen (Abschnitt 3) und die Anreicherung von TEC (Abschnitt 4). Es wird empfohlen, dass frische Enzymlösung wird jeweils hergestellt, und das Gewebe wird so bald wie möglich behandelt. Für gepoolt Thymi Optimierung des Volumens der Enzymlösung wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Thymi erforderlich. Wenn eine Gewebereste nach der Verarbeitung zurückbleiben, zu Hinzufügen von mehr Enzymlösung und Verlängerung der Inkubationszeit Zellaus...

Frühen T-Zell-Entwicklung werden Knochenmark hämatopoetische Stammzellen abgeleiteten multipotenten Vorläuferzellen an der Rinde des Thymus rekrutiert zogen Engagement der T-Linie und zu T-Zell-Vorläufer 1. In der Rinde, T-Zell-Vorläufer-CD4 und CD8 doppelt negative (DN) Thymozyten erweitern und differenzieren sich in unreifen CD4 und CD8 doppelt positiven (DP) Thymozyten, bilden einen großen Pool von Vorläuferzellen mit sehr unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren 1. Nur eine ausgewählte MHC-beschränkten Teilmenge von DP-Zellen werden CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) Thymozyten zu werden, wandern in der Medulla des Thymus und differenzieren sich in funktional zuständigen reifen T-Zellen, eine Veranstaltung, die als positive Selektion bezeichnet wird 2 6. Im Gegensatz dazu Klone von autoreaktiven Thymozyten zogen negative Selektion und über Apoptose entfernt, um regulatorische T-Zellen, die für Selbst-Toleranz umgewandelt oder intraepitheliale Lymphozyten für Zwecke, die nicht klar sind, abgeleitet 3,7-10. Im Thymus Thymus-Stromazellen bilden eine einzigartige Mikroumgebung, die Signale für die verschiedenen T-Zell-Entwicklung Schicksale 5,11,12. Einschließlich Rinden TECs (CTEC) und Mark TECs (mTEZ), dendritische Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Neuralleiste stamm Perizyten und anderen mesenchymalen Zellen 13-15 - Thymus-Stroma-Zellen von Thymus-Epithelzellen (TECs) besteht. Unter diesen sind TECs entscheidend auf den verschiedenen Stufen der T-Zell-Entwicklung 1,2,16,17. Allerdings hat noch kein robuster Weg zu isolieren TEC ein umfassendes Verständnis ihrer Funktionen 16 behindert. Insbesondere CTEC, die eine dreidimensionale Netzwerk umgebenden Vorläuferzellen im Cortex zu bilden, sind für die positive Selektion 13,18,19 aus Gründen, die nicht klar sind. Frühere Studien lieferten Hinweise auf die Heterogenität und die Rolle der TEC, meist unter Berufung auf morphologische und histologische Werkzeuge 13 </sup&gt;. Vor kurzem hat die einzigartige Rolle der TEC Teilmengen wurden durch genetische Ansätze in Mausmodellen 12,20 gerichtet. Eine robuste und reproduzierbare Weise zu isolieren TEC ist von grundlegender Bedeutung, um unvoreingenommene Charakterisierung von TEC Teilmengen, quantitative und qualitative Bewertung der TEC-Funktionen, und die Klärung der Mechanismen zu erreichen, wie CTEC unterstützt positive Selektion. Aufgrund der Seltenheit von TECs im Thymus und den engen Wechselwirkungen sie im intakten Organ zu bilden, die Isolierung von TECs wurde schwierig. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf früheren Entdeckungen, die derzeit erhältlichen Reagenzien, Techniken und Kenntnisse der Thymus Struktur und Stromazellen Zusammensetzung. Vor fast zwei Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren berichtet, Thymus Gewebe 21-27, in denen verschiedene Enzyme wurden während der Verdauung verwendet werden, einschließlich Trypsin, Collagenase und Dispase aufzuschlüsseln. Gray et al. verglichen diese Enzyme in ihrer precedure 28 und berichtet eine verbesserte Method mit einem mehrstufigen Verdauung von Enzym-Cocktails, die 29 wurde weit verbreitet 20,30. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren eine lange Vorbereitungszeit und komplexe Schritte Verdauung und führt variable endgültige Zellzahlen und Mengenverhältnisse der TECs sogar in der gleichen Maus-Kohorte 29,30. Vor einigen Jahren Liberase Research Grade Enzym enthält hoch gereinigte Kollagenase und neutraler Protease begonnen, in Thymus Gewebedissoziation 30 verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Liberase Verdauung-basiertes Protokoll, mit optimierten mechanischen Trennverfahren, die eine hohe Anzahl von lebensfähigen TEC aus Maus-Thymus Gewebe ergibt. . Dissoziiert Stromazellen zu bereichern, haben frühere Studien entweder Dichtegradienten oder Magnetkügelchen Trennung 21,29 eingesetzt. , Verursachen jedoch beide Methoden schweren verloren bestimmter Populationen von Thymusstroma Zellen, insbesondere der Bevölkerung von 29 CTEC. Zytotoxische Eliminierung und Panning-Techniken <sbis&gt; 31,32 sind weithin zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Lymphozyten in dem immunologischen Gebiet 12,31 verwendet. Nach dem Vergleich dieser Techniken haben wir die aktuellen Panning-Protokoll zur Anreicherung von TEC. Die sanfte Zustand während der Anreicherungsverfahren führt zu weniger Zelltod und unvoreingenommene und erhöhte TEC Erholung. Die in Abschnitt 3 beschriebenen isolierten Thymus Zellsuspension kann direkt angewendet werden, um durchflusszytometrische Analyse fließen zur Identifizierung und Charakterisierung von TEC Teilmengen und dendritischen Zellen. Abschnitt 4 beschreibt eine einfache und nützliche Methode, um Untergruppen mit TEC Multi Durchflusszytometer zu identifizieren. Für Experimente, die gereinigt oder CTEC mTEZ, TEC Bereicherung und Zellsortierverfahren zu erhalten suchen, finden Sie in Kapitel 5 und 6 zu finden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:487px;">Anti-mouse EpCAM</td>
			<td style="width:153px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">XX-5791-YY*</td>
			<td style="width:163px;">Clone G8.8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse MHC II</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5321-YY*</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse Ly51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5891-YY*</td>
			<td>Clone 6C3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UEA-1</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>FL-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td>TreeStar - Flowjo</td>
			<td>FlowJo v7/9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

Der Thymus ist ein wichtiges Organ für die T-Lymphozyten-Entwicklung. Von Thymus-Stromazellen sind Thymus-Epithelzellen (TEC) besonders wichtig in mehreren Stufen von T-Zell-Entwicklung: T-Zell-Engagement, positive und negative Selektionsauswahl. Allerdings bleibt die Funktion der TEC in der Thymusdrüse unvollständig verstanden. In dem Artikel wird ein Verfahren zur TEC Teilmengen aus frischen Maus Thymus mit einer Kombination von mechanischen Störungen und enzymatische Verdauung zu isolieren. Das Verfahren ermöglicht Thymus-Stroma-Zellen und Thymozyten effizient von Zell-Zell-und Zell-extrazellulären Matrix-Verbindungen freigesetzt werden, und um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Verwendung der isolierten Zellen können Multi Durchflusszytometrie, um die Identifizierung und Charakterisierung von TECs und dendritischen Zellen verwendet werden. Da TEC sind eine seltene Zellpopulation im Thymus, wir beschreiben auch eine effektive Möglichkeit zu bereichern und zu reinigen TEC durch abbau Thymozyten, die am häufigsten vorkommende Zelltyp im Thymus. FolloFlügel die Anreicherung, Zellsortierzeit kann verringert werden, so dass der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen kann während der Reinigung von TEC minimiert werden. Gereinigten Zellen sind für verschiedene Downstream-Analysen wie Echtzeit-PCR, Western-Blot-und Gen-Expressionsprofilen. Das Protokoll wird die Forschung von TEC-Funktion und so gut wie die Entwicklung von in-vitro-T-Zell-Rekonstitution zu fördern.

Mit diesem Protokoll wurde ein Thymus Organ von einer erwachsenen Maus (Abschnitt 2) und einer Thymus-Zellsuspension entfernt wurde, wie in Abschnitt 3 skizzierten Die erhaltene Zellsuspension bestand aus Thymozyten hämatopoetischen abgeleiteten Stromazellen und nicht-hämatopoetischen Stromazellen. CD45 ist ein hämatopoetischer pan-Marker exprimiert auf beiden Thymozyten und hämatopoetische stromale Zellen, wie Makrophagen und dendritischen Zellen. Im Gegensatz dazu sind TECs nicht hämatopoetischen Ursprungs und ni...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.8K Aufrufe.  University of Minnesota.  Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden. 

Serie: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

Isolation, Verarbeitung und Analyse von Murine Gingivazellen

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.