עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01 AI088209 (לקה). אנו מודים גם לאוניברסיטת מינסוטה cytometry זרימת המשאבים.

במחקר זה, למבוגרים - הנשי (6 8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שנרכשו מהמכון הלאומי לסרטן וקיומם תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. אוניברסיטת ועדת בעלי החיים המוסדית מינסוטה טיפול ושימוש (IACUC) אישרה את כל הניסויים בבעלי החיים. .1 הכנת מכשירים והחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים (בינוני RPMI1640 עם 0.05% [w / v] של Liberase TH ו100 U / ml של DNase I), חיץ אלבומין העשיר (1X PBS [Ca 2 + / 2 + -חינם Mg] עם 0.5% בסרום שור אלבומין ו2 חומצת Ethylenediamine Tetraacetic מ&quot;מ [EDTA]), חיץ FACS (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] 1% בסרום שור עוברי המכיל [FBS] ו0.02% NaN 3), FACS מיון חיץ (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] (בינוני RPMI-1640 המכיל 2% FBS), ובינוני RP10 מסופק עם 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 צלחות צילום פנורמי. הכן פתרון ציפוי 40 מ&quot;ל (0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Gשיבולת שועל אנטי העכברוש-IgG ב0.1 M NaHCO הצפת 3), ולהוסיף 4 מ&quot;ל של תמיסת ציפוי לכל 100 x 15 צלחת מ&quot;מ, מערבולת ולדגור על 4 CO ° / N. יוצקים את פתרון נוגדן ולשטוף את הצלחת באמצעות 5 מ&quot;ל של 1x PBS עבור 2 פעמים, מערבולת במרץ בין שטיפות. אחסן את הצלחות מוכנות ב 4 ° C.. </li></ol> .2 קציר של רקמות קורנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בתא CO 2. שים את החיה על גבה על מחצלת לנתיחה, להצמיד את הרגליים על המזרן ולהרטיב את הפרווה על ידי ריסוס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע דרך העור, החל מלמעלה פתיחת השופכה ישר עד הלסת התחתונה עם מספריים ולהאריך את החתך כלפי מטה עד הברכיים בשני הצדדים. החתך נראה כמו במהופך &quot;Y&quot;. משוך את העור הרפוי לאחור בצדדים, ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הסרעפת מxiphoid, לחתוך את הצלעות בכל צד עד כ עצם הבריח, ואז להרים את הצלעות עםמלקחיים ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. התימוס הוא בדיוק מתחת לצלעות, ונראה כמו שתי אונות הלבנות דקות שמעל הלב (איור 1). רקמת חיבור נתק המקיף את בלוטת התימוס, משוך בעדינות ולהסיר את זוג אונות התימוס עם מלקחיים משוננים מעוקלים. אונות התימוס מקום לצלחת 6 היטב המכילה 5 מ&quot;ל RPMI-1640. </li></ol> .3 הכנת התאים הרתי סטרומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את כל רקמת שומן וחיבור המקיפה ולהעביר את אונות התימוס לבאר חדשה של צלחת 6 היטב המכילה 5 מ&quot;ל טרי להכין פתרון אנזים. לעשות חתכים קטנים באונות התימוס עם מספריים עדינים, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה לעכל רקמה עד התימוס וירידה של 2 - 3 פעמים באמצעות 5 פיפטה מ&quot;ל לניתוק רקמות. לאסוף חלק supernatant בצינור 50 מ&quot;ל מכיל 10 מ&quot;ל חיץ אלבומין העשיר קר לנטרל אנזימים. שמור את צינור האיסוף על קרח. הוסף 2.5פתרון מ&quot;ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ&quot;ל ומחט 18 G כדי לשבור את אגרגטים. supernatant בריכה לצינור האיסוף. הוסף פתרון 2.5 מ&quot;ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ&quot;ל ו25 מחט G, ודגירה את הצלחת נוספת 5 - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול מלא, בריכת supernatant לתוך צינור האיסוף. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות כדי לאסוף את התאים. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted ב10 מ&quot;ל חיץ אלבומין העשיר ולסנן את המדגם באמצעות 100 רשת מ&quot;מ. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. ואז לבצע ניתוח תזרים cytometic (סעיף 4) או העשרת Tecs (סעיף 5). </li></ol> .4 זיהוי של Tecs על ידי cytometry הזרימה </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאים לריכוז סופי של 4 x 10 6 תאים במאגר FACS 100 μl מכתים בצלחת מבחן גם מסביב לתחתית 96 ולשמור את הצלחת על קרח. הוסף 20 μl פתרון לחסום Fc (אנטי CD16-/ נוגדן CD32 ב10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במאגר FACS) לתאי דגירה התאים ל10 דקות על קרח. ספין הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. בטל נוזל מבארות על ידי מצליף את פני הצלחת לתוך כיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את תאי pelleted ב100 קוקטייל נוגדני μl (אנטי CD45, -EpCAM, כיתת -MHC השנייה, ו-Ly51 נוגדנים, וקטיני UEA-1 שכותרתו עם fluorochromes שונה ביצרן מומלץ או נבדקים ריכוזים אופטימליים של כל נוגדן במאגר FACS ), ודגירת התאים על קרח ל20 דקות בחושך. לפיצוי, להכתים 1 x 10 6 תאים עם כל fluorochrome הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ FACS 100 μl היטב כל אחד ולסובב את הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד אחד לשטוףזמן, ולאחר מכן resuspend תאי חיץ FACS 100 μl. להעביר את תאי צינור FACS מסביב לתחתית 12 x 15 מ&quot;מ מלא ב300 μl FACS חיץ. לרכוש דגימות על cytometer זרימה ולנתח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS. אסטרטגית gating TEC מוצגת באיור 2. </li></ol> .5 העשרה של Tecs על ידי צילום פנורמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאי התימוס (שהוכנו בסעיף 3) ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted במאגר מיון FACS בריכוז של 2 x 10 8 תאים לכל מ&quot;ל בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל. הוסף נוגדן אנטי CD90.2 (Clone 30-H12) (או אנטי CD45) בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של השעיה תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף עם 5 - 10x נפח בינוני RP10 וצנטריפוגות הצינור ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted בבינוני RP10 בריכוז של 1 x 10 7 לכל מ&quot;ל. הוסף השעיה תא 5 מ&quot;ל לכל צלחת מצופה צילום פנורמי (מוכנה בשלב 1.3), מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. מערבולת במרץ; להעביר את supernatants לתוך צינור חרוטי. יש לשטוף את הצלחת שתי פעמים באמצעות מדיום RP10 וברכת supernatants לתוך צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted במדיום RP10 5 מ&quot;ל. מוסיף את ההשעיה התא לצלחת צילום פנורמי חדשה, מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. לאסוף את התאים לשטוף את הצלחת וברכה אותם לתוך צינור חרוטי. ברגע שTecs מועשרים, ספין למטה התאים ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהשעות תאי 5 FACS מ&quot;ל מיון חיץ. </li></ol> .6 טיהור Tecs על ידי מיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהכין השעיה תא בריכוז של 4 x 10 7 תאי חיץ מיון FACS. הוספת נוגדני described בסעיף 4.4 לפתרון תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעקבות צביעה, לשטוף ולהשעות תאים לריכוז של 10 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל של חיץ מיון FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תת TEC דרך נחיר 100 מיקרומטר באמצעות מיון תא הקרינה הופעלה. תא ממוין נאספים ב30% (v / v) FBS בRPMI-1640). ברגע שמיון תא נעשה, תאי צנטריפוגות ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהתכונן לניתוח במורד הזרם. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).</li><li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+epithelial+cells:+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection.">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li><li>Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta5t-containing+thymoproteasome:+specific+expression+in+thymic+cortical+epithelial+cells+and+role+in+positive+selection+of+CD8.">beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8.</a> T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).</li><li>Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+subunit+G5PR+that+regulates+the+JNK-mediated+apoptosis+signal+is+essential+for+the+survival+of+CD4+and+CD8+double-positive+thymocytes.">Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes.</a> Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).</li><li>Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+cells,+life+history,+and+diversity.">Treg cells, life history, and diversity.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).</li><li>Pobezinsky, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+deletion+and+the+fate+of+autoreactive+thymocytes+that+survive+negative+selection.">Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection.</a> Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).</li><li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus.">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).</li><li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+tolerance:+central+and+peripheral.">T-cell tolerance: central and peripheral.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).</li><li>Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intrathymic+microenvironments+to+establish+T-cell+tolerance.">Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).</li><li>Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoproteasome+subunit-beta5T+generates+peptide-MHC+complexes+specialized+for+positive+selection.">Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).</li><li>Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).</li><li>Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+and+molecular+overview+of+the+thymus+as+site+for+T-cells+development.">Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).</li><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+organogenesis.">Thymus organogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).</li><li>Griffith, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+thymic+stromal+microenvironments+reveals+unique+features+influencing+T+lymphoid+differentiation.">Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation.</a> Immunit. 31, 999-1009 (2009).</li><li>Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+self-antigens+by+subsets+of+thymic+stromal+cells.">Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).</li><li>Hogquist, K. A., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+CD8++T+cells+need+diversity+when+growing+up.">Why CD8+ T cells need diversity when growing up.</a> Immunit. 32, 5-6 (2010).</li><li>Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+ability+of+thymic+epithelial+cells+to+mediate+positive+selection+does+not+require+expression+of+the+steroidogenic+enzyme+p450scc.">Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc.</a> J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD8++T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes.">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316, 1349-1353 (2007).</li><li>Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adult+thymic+stromal-cell+suspension+model+for+in+vitro+positive+selection.">An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection.</a> Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).</li><li>Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+reveals+unexpected+shared+antigens+between+histologically+defined+populations+of+thymic+stromal+cells.">Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells.</a> Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).</li><li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro.">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).</li><li>Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+of+the+autoreactive+T-cell+repertoire+by+a+splice+variant+of+self+protein+expressed+in+thymic+epithelial+cells.">Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells.</a> Nat. Med. 6, 56-61 (2000).</li><li>Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+the+thymocytes+associated+with+dendritic+cells+and+macrophages+in+thymic+rosettes.">Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes.</a> Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).</li><li>Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+cells+in+the+thymus+that+can+negatively+select+MHC+class+II-restricted+T+cells+recognizing+a+circulating+self+antigen.">Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen.</a> J. Immunol. 158, 693-706 (1997).</li><li>Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+subpopulations+of+thymic+epithelial+cells+by+flow+cytometry+using+a+new+specific+thymic+epithelial+marker,+Ly110.">Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110.</a> J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).</li><li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry.">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).</li><li>Gray, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+analysis,+enrichment+and+purification+of+thymic+stromal+cells.">Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells.</a> J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations:+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury.">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).</li><li>Kanof, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+T+cell+subpopulations.">Purification of T cell subpopulations.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).</li><li>Mage, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+T+cells+and+B+cells+using+panning+techniques.">Fractionation of T cells and B cells using panning techniques.</a> Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).</li><li>Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells.+Lymphoepithelial+cell+complexes+in+murine+thymuses:+morphological+and+serological+characterization.">Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization.</a> The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).</li><li>Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoepithelial+interactions+in+the+mouse+thymus:+phenotypic+and+kinetic+studies+on+thymic+nurse+cells.">Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells.</a> J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+alpha+rearrangement+in+cortical+thymocytes.">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).</li><li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis.">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, ...

בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T 1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד 1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית כ2 6. בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויוסרו באמצעות אפופטוזיס, יומרו לתאי T רגולטורים לסובלנות עצמית, או מופנים לימפוציטים intraepithelial למטרות שאינן ברורים עדיין 3,7-10. בבלוטת התימוס, תאי סטרומה הרתי ליצור microenvironment ייחודי המספק אותות לאלה גורלות פיתוח תאים השונים T 5,11,12. תאי סטרומה הרתי מורכבים מתאי אפיתל הרתי (Tecs) - כולל Tecs קליפת המוח (cTECs) וTecs הלשדי (mTECs), תאים דנדריטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי אנדותל, pericytes המופק מרכס העצבי ותאי mesenchymal אחרים 13-15. בין אלה, Tecs הם קריטיים בשלבים השונים של פיתוח תאי T 1,2,16,17. עם זאת, חוסר דרך חזקה כדי לבודד Tecs עכב הבנה מקיפה של הפונקציות שלהם 16. בפרט, cTECs, אשר יוצר רשת תלת ממדים המקיפה את האבות בקליפת המוח, חיוני לסלקציה חיובית 13,18,19 מסיבות שאינן ברורים עדיין. מחקרים קודמים סיפקו רמזים לגבי ההטרוגניות והתפקיד של Tecs, בעיקר להסתמך על כלים מורפולוגיים והיסטולוגית 13 </sup&gt;. לאחרונה התפקידים הייחודיים של תת TEC טופלו על ידי גישות גנטיות בעכברי מודל 12,20. דרך חזקה ושחזור כדי לבודד Tecs היא יסוד להשגת אפיון משוחד של תת TEC, הערכה כמותית ואיכותית של פונקציות TEC, והבהרה של מנגנונים איך cTECs יתמוך בבחירה חיובית. בשל הנדירות של Tecs בבלוטת התימוס והאינטראקציות הדוקות הם יוצרים באיבר שלם, הבידוד של Tecs היה מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על תגליות קודמות, כיום ריאגנטים זמינים, טכניקות, ואת הידע של מבנה בלוטת התימוס והרכב סטרומה. לפני כמעט שני עשורים, כמה נהלים דווחו לdisaggregate רקמות בלוטת התימוס 21-27, שבו אנזימים שונים שמשו במהלך עיכול, כולל טריפסין, Collagenase וDispase. אפור et al. לעומת אלה אנזימים בprecedure 28, ודיווח ספיד משופרod עם עיכול מרובה צעד של קוקטיילים אנזים 29 שהפכו בשימוש נרחב 20,30. עם זאת, שיטה זו כרוכה בזמן הכנה ארוך וצעדים מורכבים עיכול ותוצאות במשתנה מספרים סלולריים ופרופורציות של Tecs הסופי אפילו באותו הדור העכברי 29,30. לפני מספר שנים, אנזים כיתה מחקר Liberase, מכיל מטוהר ביותר Collagenase ופרוטאז הניטרלי התחיל להיות בשימוש בניתוק רקמת התימוס 30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס עיכול Liberase, עם נהלי הפרדה מכאנית מותאמים, שמניב מספר גבוה של Tecs קיימא מרקמות בלוטת התימוס עכבר. . כדי להעשיר את תאי סטרומה ניתק, מחקרים קודמים השתמשו גם מפלי צפיפות או הפרדת חרוז מגנטית 21,29. עם זאת, שתי השיטות לגרום חמורות אבודות של אוכלוסיות מסוימות של תאי סטרומה הרתי, במיוחד האוכלוסייה של cTECs 29. חיסול ציטוטוקסיות וטכניקות צילום פנורמי <sעד&gt; 31,32 לי נרחב שימש במשך דלדול או הפרדה של לימפוציטים בתחום החיסוני 12,31. לאחר השוואה של טכניקות אלה, הקמנו את פרוטוקול צילום פנורמי הנוכחי להעשרה של Tecs. המצב העדין במהלך הליך ההעשרה מוביל למוות של תאים ופחות משוחד והתאוששות TEC מוגברת. ההשעיה תא התימוס המבודדת שתוארה בסעיף 3 יכולה להיות מיושמת ישירות לזרום ניתוח cytometric לזיהוי ואפיון של תת TEC ותאים דנדריטיים. סעיף 4 מתאר דרך פשוטה ושימושית לזיהוי תת TEC באמצעות זרימת פרמטרים מרובה cytometer. ניתן למצוא בניסויים שמבקשים להשיג cTECs מטוהר או mTECs, העשרת TEC ומיון תא הליכים בסעיף 5 ו -6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:487px;">Anti-mouse EpCAM</td>
			<td style="width:153px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">XX-5791-YY*</td>
			<td style="width:163px;">Clone G8.8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse MHC II</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5321-YY*</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse Ly51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5891-YY*</td>
			<td>Clone 6C3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UEA-1</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>FL-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td>TreeStar - Flowjo</td>
			<td>FlowJo v7/9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.

שימוש בפרוטוקול זה, איבר התימוס הוסר מעכבר בוגר (סעיף 2) והשעית תא הרתי הוכן כפי שתואר בסעיף 3 ההשעיה התא שהושגה כללה thymocytes, תאי סטרומה שמקורם hematopoietic ותאי סטרומה שאינו hematopoietic. CD45 הוא הפאן סמן hematopoietic הביע בשני thymocytes ותאי סטרומה hematopoietic כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים. ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells at JoVE.com

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.7K Views.  University of Minnesota.  כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T. 

Video: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.