Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (para KAH). Agradecemos também a Universidade de Minnesota Citometria de Fluxo de recursos.

Neste estudo, os adultos - foram usados ​​(6 8 semanas) do sexo feminino C57BL / 6. Ratos foram adquiridos no Instituto Nacional do Câncer e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. A Universidade do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional Minnesota (IACUC) aprovou toda a experimentação animal. 1 Preparação de Instrumentos e amortecedores <ol><li> Preparar a solução de enzima (meio RPMI 1640 com 0.05% [w / v] de Liberase TH e 100 U / ml de DNase I), tampão rico em albumina (1X PBS, [Ca 2 + / Mg 2 + livre], com 0,5% de soro de bovino albumina e 2 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético [EDTA]), de tampão de FACS (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo soro de bovino fetal a 1% [FBS] e 0,02% de NaN 3), separação por FACS tampão (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo 2% de FBS), e meio RP10 (RPMI-1640 fornecido com 10% de FBS). </li><li> Prepare 10 placas panning. Preparar a solução de revestimento de 40 ml (0,01 mg / ml de Laveia anti-IgG de rato em 0,1 M de tampão de NaHCO3), e adicionar 4 ml de solução de revestimento em cada 100 x 15 mm placa, redemoinho e incubar a 4 ° CO / N. Escorrer solução de anticorpo e lavar a placa com 5 ml de PBS 1x por 2 vezes, agite vigorosamente entre lavagens. Armazenar as placas preparadas a 4 ° C. </li></ol> 2 Colheita de Thymus Tissue <ol><li> Eutanásia rato numa câmara de CO 2. Coloque o animal em suas costas em uma esteira dissecação, fixar os pés no tapete e molhar a pele por aspersão com etanol 70%. </li><li> Fazer uma incisão na linha média através da pele, a partir de cima da abertura da uretra para cima para o maxilar inferior com uma tesoura e alargar a incisão para baixo para os joelhos em ambos os lados. A incisão se parece com uma cabeça para baixo &quot;Y&quot;. Retire a pele solta de volta nas laterais, e fixá-lo para o tapete dissecção. </li><li> Perfurar o diafragma do xifóide, cortar as costelas de cada lado até cerca da clavícula, em seguida, levante os reforços comfórceps e fixá-lo para o tapete dissecção. O timo é apenas abaixo das costelas, e se parece com dois lobos brancos finos que recobrem o coração (Figura 1). Tecido conjuntivo Disconnect torno do timo, retire com cuidado e retire a par de lobos do timo com uma pinça serrilhada curvas. Lóbulos timo lugar em uma placa de 6 poços contendo 5 ml de meio RPMI-1640. </li></ol> 3 Preparação de Células do estroma tímico <ol><li> Aparar qualquer tecido adiposo e conjuntivo circundante e transferir os lóbulos timo para um novo poço da placa de 6 poços contendo 5 ml de solução de enzima recentemente preparar. Fazer pequenas incisões nos lóbulos do timo com uma tesoura fina, e incubar a placa a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Pipeta suavemente digerir o tecido do timo e para baixo 2-3 vezes usando 5 ml de pipeta para dissociação de tecidos. Recolher a fracção de sobrenadante num tubo de 50 ml contendo 10 ml de tampão frio rico em albumina para neutralizar as enzimas. Mantenha o tubo de coleta no gelo. Adicionar 2,5solução de enzima ml para o tecido restante e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Realizar a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e agulha de 18 G para quebrar agregados. Piscina sobrenadante para o tubo de coleta. Adicionar solução de 2,5 ml de enzima no tecido remanescente e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Repetir a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e uma agulha G 25, e incuba-se a placa adicional 5 - 10 min. </li><li> Após a digestão completa, piscina do sobrenadante para o tubo de coleta. Centrifugar o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 8 minutos para recolher as células. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em 10 ml de tampão ricos em albumina e filtrar a amostra através de malha de 100 milímetros. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Em seguida, realizar a análise de citometria de fluxo (Seção 4) ou TEC enriquecimento (Seção 5). </li></ol> 4 Identificação de TEC por Citometria de Fluxo </p&gt; <ol><li> Preparar células para uma concentração final de 4 x 10 6 culas por 100 ul em tampão de SCAF para a coloração de uma placa de ensaio de 96 poços de fundo redondo e manter a placa em gelo. Adicionar 20 ul solução de bloqueio de Fc (CD16 anti-anticorpo / CD32 em 10 ug / ml em tampão de SCAF) para as células e incuba-se as células durante 10 minutos em gelo. Girar a placa a 400 x g, 4 ° C durante 3 min. Descarte o líquido das cavidades sacudindo o rosto placa para baixo em uma pia. </li><li> Suspender as células peletizadas em 100 mL de cocktail de anticorpos (anti-CD45, -EpCAM, classe II -MHC, e anticorpos -Ly51, e a lectina UEA-1 marcados com diferentes fluorocromos no fabricante ou recomendadas testadas concentrações óptimas de cada anticorpo em tampão FACS ), e incuba-se as células em gelo durante 20 min no escuro. Para compensação, manchar um x 10 6 células com cada fluorocromo individual. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de SCAF a cada poço e a placa de girar a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Repetir o passo de lavagemtempo, e em seguida ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS. Transferência das células para um tubo de FACS de fundo redondo de 12 x 15 mm, encheu-se com 300 ul de tampão de FACS. Adquirir amostras no citômetro de fluxo e análise de dados usando o software de análise FACS. Estratégia gating TCE é mostrado na Figura 2. </li></ol> 5. Enriquecimento da TEC garimpando <ol><li> Girar as células do timo (preparados na Seção 3) a 400 xg, 4 ° C por 5 min. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em tampão FACS triagem a uma concentração de 2 x 10 8 culas por ml em 15 ml ou um tubo de 50 ml. Adicionar anticorpos anti-CD90.2 (Clone 30-H12) (ou anti-CD45), a uma concentração final de 2,5 ug / ml de suspensão de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. A seguir à incubação, lava-se com uma 5 - volume de meio RP10 10x e centrifugar o tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas emMeio RP10 a uma concentração de 1 x 10 7 por ml. Adicionar 5 ml de suspensão de células para cada placa revestida panning (preparada no Passo 1.3), redemoinho e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Agite vigorosamente; transferir o sobrenadante para um tubo cónico. Lavar a placa duas vezes com o meio RP10 e reunir os sobrenadantes dentro do tubo de coleta. </li><li> Centrifuga-se o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas em cinco ml de meio RP10. Adicionar a suspensão de células para uma nova placa de deslizamento, agite e incube durante 30 min à temperatura ambiente. Coletar as células lavar o prato e reuni-los em um tubo cônico. Uma vez que são enriquecidas TEC, rodar para baixo as células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min e suspender as células em 5 ml de tampão de FACS triagem. </li></ol> 6. Purificação da TEC por separação de células <ol><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e preparar a suspensão de células a uma concentração de 4 x 10 7 células em tampão de SCAF triagem. Adicionar anticorpos described na Secção 4.4 em solução de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. Após a coloração, lavar e suspender as células a uma concentração de 10 x 10 6 culas por mL de tampão de FACS triagem. </li><li> Ordenar subconjuntos TEC através de um bocal de 100 pM utilizando separação de células activadas por fluorescência. Célula classificados são recolhidos em 30% (v / v) de FBS em meio RPMI-1640). Uma vez que separação de células é feito, centrifugar células a 400 xg, 4 ° C por 5 min e se preparar para análise a jusante. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

No protocolo, os passos críticos são a preparação de células do estroma do timo (ponto 3) e o enriquecimento da TEC (Seção 4). É altamente recomendável que a solução enzimática fresca é preparada de cada vez e que o tecido é tratado o mais rapidamente possível. Para timos reunidas, optimizar o volume da solução de enzimas é necessária, dependendo do número de timos. Se qualquer resíduo de tecido é deixado após o processamento, a adição de mais solução enzimática e extensão do tempo de incuba...

No início do desenvolvimento das células T, de medula óssea hematopoiéticas derivadas de células progenitoras pluripotentes são recrutados para o córtex do timo, submetido a compromisso de linhagem T e tornar-se precursores de células T 1. No córtex, precursoras de células T CD4 e CD8 duplo negativos (DN) timócitos expandir e diferenciar em imaturo CD4 e CD8 duplo positivo (DP) timócitos, formando uma grande piscina de progenitores com receptores de células T altamente variável 1. Apenas um seleto subconjunto MHC-restrito de células DP vai se tornar único positivos (SP) timócitos CD4 ou CD8, migram para a medula do timo, e se diferenciar em células T maduras funcionalmente competentes, um evento que é chamado de seleção como positiva 2 6. Em contraste, os clones de timócitos auto-reactivos sofrem de selecção negativa e são removidos por meio de apoptose, convertidas em células T reguladoras para a auto-tolerância, ou desviado para linfócitos intra-epiteliais para fins que ainda não são claras 3,7-10. No timo, as células do estroma de timo formar um microambiente único fornecimento de sinais para esses vários destinos de desenvolvimento de células T 5,11,12. As células do estroma de timo são compostas por células epiteliais tímicas (TEC) - incluindo TEC corticais (CTECs TEC) e medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, pericitos derivados da crista neural e outras células mesenquimais 13-15. Entre estes, TEC são cruciais nas várias fases de desenvolvimento das células T 1,2,16,17. No entanto, a falta de uma forma robusta para isolar TEC tem dificultado uma compreensão abrangente de suas funções 16. Em particular, CTECs, que formam uma rede tridimensional circundante progenitores no córtex, são essenciais para a seleção positiva 13,18,19 por razões que ainda não estão claras. Estudos anteriores forneceram pistas sobre a heterogeneidade eo papel da TEC, principalmente contando com ferramentas morfológicas e histológicas 13 </sup&gt;. Recentemente, os papéis únicos de subconjuntos TEC foram abordados por abordagens genéticas em modelos de ratos 12,20. A forma robusta e reproduzível para isolar TEC é fundamental para alcançar a caracterização imparcial de subconjuntos do TCE, avaliação quantitativa e qualitativa das funções do TCE, e esclarecimento de mecanismos como CTECs apoiar seleção positiva. Devido à raridade da TEC no timo e as interações apertadas formam no órgão intacto, o isolamento da TEC tem sido um desafio. O protocolo aqui descrito é baseado em descobertas anteriores, atualmente reagentes disponíveis, técnicas e conhecimento da estrutura do timo e composição estromal. Há quase duas décadas, vários procedimentos foram relatados desagregar tecidos timo 21-27, em que diferentes enzimas foram utilizadas durante a digestão, incluindo tripsina, colagenase e Dispase. Gray et al. comparação dessas enzimas em sua precedure 28, e relataram uma melhoria da method com a digestão de várias etapas de coquetéis enzimáticos 29 que se tornaram amplamente utilizados 20,30. No entanto, este método envolve um tempo de preparação longos e complexos processos de digestão e resulta em última variável o número de células e as proporções de TEC ainda na mesma coorte de murino 29,30. Vários anos atrás, Liberase enzima grau de investigação, contendo altamente purificado colagenase e protease neutra começou a ser utilizado na dissociação tecido do timo 30. Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em digestão Liberase, com processos de separação mecânica optimizadas, que produz um elevado número de TEC viáveis ​​a partir de tecidos do timo do rato. . Para enriquecer células estromais dissociados, estudos anteriores têm usado gradientes de densidade ou separação magnética talão 21,29. No entanto, ambos os métodos de causar grave perda de determinadas populações de células do estroma de timo, especialmente a população de CTECs 29. Eliminação citotóxica e técnicas de panning <sse&gt; 31,32 têm sido amplamente utilizadas para a depleção ou separação de linfócitos no campo imunológica 12,31. Após a comparação destas técnicas, foi estabelecido o protocolo de panning atual para o enriquecimento da TEC. A condição suave durante o processo de enriquecimento leva a menos morte celular e imparcial e uma maior recuperação do TCE. A suspensão de células do timo isolado descrito na Seção 3 pode ser aplicado diretamente para análise por citometria de fluxo para a identificação e caracterização dos subconjuntos TEC e células dendríticas. A Seção 4 descreve uma forma simples e útil para identificar subconjuntos TEC utilizando fluxo multiparâmetro citômetro. Para experiências que procuram obter CTECs purificadas ou mTECs, TEC enriquecimento e células de triagem procedimentos podem ser encontradas na Seção 5 e 6.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

O timo é um órgão vital para o desenvolvimento de linfócitos T. De células do estroma do timo, as células epiteliais do timo (TEC) são particularmente crucial em vários estágios de desenvolvimento de células T: compromisso de células T, de seleção positiva e negativa de seleção. No entanto, a função de TEC no timo permanece incompletamente compreendida. No artigo, nós fornecemos um método para isolar subconjuntos TEC de timo fresco rato usando uma combinação de ruptura mecânica e digestão enzimática. O método permite que as células do estroma de timo e de timócitos de ser eficientemente libertado a partir de células de células e ligações célula-matriz extracelular e para formar uma suspensão de célula única. Utilizando as células isoladas, multiparamétrica de citometria de fluxo pode ser aplicado para a identificação e caracterização de TEC e células dendríticas. Porque TEC são uma população rara de células no timo, que também descrevem uma forma eficaz para enriquecer e purificar a TEC, esgotando os timócitos, o tipo de célula mais abundante no timo. Folloala o enriquecimento, a selecção de células de tempo pode ser reduzida de forma que a perda de viabilidade das células pode ser minimizada durante a purificação de TEC. As células purificadas são adequados para diversas análises a jusante como o Real Time-PCR, Western blot e perfil de expressão gênica. O protocolo irá promover a investigação da função do TCE e, assim como o desenvolvimento de reconstituição in vitro de células T.

Usando este protocolo, um órgão timo foi removido a partir de um rato adulto (Secção 2) e uma suspensão de células do timo, foi preparado como descrito no ponto 3 a suspensão de células obtida consistiu de timócitos, células de estroma derivadas de hematopoiéticas e células estromais não hematopoiéticas. CD45 é um marcador de pan-hematopoiético expressos em ambos os timócitos e células do estroma hematopoiético, tais como macrófagos e células dendríticas. Em contraste, os TEC não são de origem he...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K visualizações.  University of Minnesota.  Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T. 

Vídeo: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Otimizando o isolamento de células estromais do timo e da medula óssea

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa hematopoiética usando isolamento de células estromais para sequenciamento de células únicas

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis