Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (para KAH). Agradecemos também a Universidade de Minnesota Citometria de Fluxo de recursos.

Neste estudo, os adultos - foram usados ​​(6 8 semanas) do sexo feminino C57BL / 6. Ratos foram adquiridos no Instituto Nacional do Câncer e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. A Universidade do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional Minnesota (IACUC) aprovou toda a experimentação animal. 1 Preparação de Instrumentos e amortecedores <ol><li> Preparar a solução de enzima (meio RPMI 1640 com 0.05% [w / v] de Liberase TH e 100 U / ml de DNase I), tampão rico em albumina (1X PBS, [Ca 2 + / Mg 2 + livre], com 0,5% de soro de bovino albumina e 2 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético [EDTA]), de tampão de FACS (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo soro de bovino fetal a 1% [FBS] e 0,02% de NaN 3), separação por FACS tampão (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo 2% de FBS), e meio RP10 (RPMI-1640 fornecido com 10% de FBS). </li><li> Prepare 10 placas panning. Preparar a solução de revestimento de 40 ml (0,01 mg / ml de Laveia anti-IgG de rato em 0,1 M de tampão de NaHCO3), e adicionar 4 ml de solução de revestimento em cada 100 x 15 mm placa, redemoinho e incubar a 4 ° CO / N. Escorrer solução de anticorpo e lavar a placa com 5 ml de PBS 1x por 2 vezes, agite vigorosamente entre lavagens. Armazenar as placas preparadas a 4 ° C. </li></ol> 2 Colheita de Thymus Tissue <ol><li> Eutanásia rato numa câmara de CO 2. Coloque o animal em suas costas em uma esteira dissecação, fixar os pés no tapete e molhar a pele por aspersão com etanol 70%. </li><li> Fazer uma incisão na linha média através da pele, a partir de cima da abertura da uretra para cima para o maxilar inferior com uma tesoura e alargar a incisão para baixo para os joelhos em ambos os lados. A incisão se parece com uma cabeça para baixo &quot;Y&quot;. Retire a pele solta de volta nas laterais, e fixá-lo para o tapete dissecção. </li><li> Perfurar o diafragma do xifóide, cortar as costelas de cada lado até cerca da clavícula, em seguida, levante os reforços comfórceps e fixá-lo para o tapete dissecção. O timo é apenas abaixo das costelas, e se parece com dois lobos brancos finos que recobrem o coração (Figura 1). Tecido conjuntivo Disconnect torno do timo, retire com cuidado e retire a par de lobos do timo com uma pinça serrilhada curvas. Lóbulos timo lugar em uma placa de 6 poços contendo 5 ml de meio RPMI-1640. </li></ol> 3 Preparação de Células do estroma tímico <ol><li> Aparar qualquer tecido adiposo e conjuntivo circundante e transferir os lóbulos timo para um novo poço da placa de 6 poços contendo 5 ml de solução de enzima recentemente preparar. Fazer pequenas incisões nos lóbulos do timo com uma tesoura fina, e incubar a placa a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Pipeta suavemente digerir o tecido do timo e para baixo 2-3 vezes usando 5 ml de pipeta para dissociação de tecidos. Recolher a fracção de sobrenadante num tubo de 50 ml contendo 10 ml de tampão frio rico em albumina para neutralizar as enzimas. Mantenha o tubo de coleta no gelo. Adicionar 2,5solução de enzima ml para o tecido restante e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Realizar a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e agulha de 18 G para quebrar agregados. Piscina sobrenadante para o tubo de coleta. Adicionar solução de 2,5 ml de enzima no tecido remanescente e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Repetir a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e uma agulha G 25, e incuba-se a placa adicional 5 - 10 min. </li><li> Após a digestão completa, piscina do sobrenadante para o tubo de coleta. Centrifugar o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 8 minutos para recolher as células. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em 10 ml de tampão ricos em albumina e filtrar a amostra através de malha de 100 milímetros. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Em seguida, realizar a análise de citometria de fluxo (Seção 4) ou TEC enriquecimento (Seção 5). </li></ol> 4 Identificação de TEC por Citometria de Fluxo </p&gt; <ol><li> Preparar células para uma concentração final de 4 x 10 6 culas por 100 ul em tampão de SCAF para a coloração de uma placa de ensaio de 96 poços de fundo redondo e manter a placa em gelo. Adicionar 20 ul solução de bloqueio de Fc (CD16 anti-anticorpo / CD32 em 10 ug / ml em tampão de SCAF) para as células e incuba-se as células durante 10 minutos em gelo. Girar a placa a 400 x g, 4 ° C durante 3 min. Descarte o líquido das cavidades sacudindo o rosto placa para baixo em uma pia. </li><li> Suspender as células peletizadas em 100 mL de cocktail de anticorpos (anti-CD45, -EpCAM, classe II -MHC, e anticorpos -Ly51, e a lectina UEA-1 marcados com diferentes fluorocromos no fabricante ou recomendadas testadas concentrações óptimas de cada anticorpo em tampão FACS ), e incuba-se as células em gelo durante 20 min no escuro. Para compensação, manchar um x 10 6 células com cada fluorocromo individual. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de SCAF a cada poço e a placa de girar a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Repetir o passo de lavagemtempo, e em seguida ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS. Transferência das células para um tubo de FACS de fundo redondo de 12 x 15 mm, encheu-se com 300 ul de tampão de FACS. Adquirir amostras no citômetro de fluxo e análise de dados usando o software de análise FACS. Estratégia gating TCE é mostrado na Figura 2. </li></ol> 5. Enriquecimento da TEC garimpando <ol><li> Girar as células do timo (preparados na Seção 3) a 400 xg, 4 ° C por 5 min. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em tampão FACS triagem a uma concentração de 2 x 10 8 culas por ml em 15 ml ou um tubo de 50 ml. Adicionar anticorpos anti-CD90.2 (Clone 30-H12) (ou anti-CD45), a uma concentração final de 2,5 ug / ml de suspensão de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. A seguir à incubação, lava-se com uma 5 - volume de meio RP10 10x e centrifugar o tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas emMeio RP10 a uma concentração de 1 x 10 7 por ml. Adicionar 5 ml de suspensão de células para cada placa revestida panning (preparada no Passo 1.3), redemoinho e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Agite vigorosamente; transferir o sobrenadante para um tubo cónico. Lavar a placa duas vezes com o meio RP10 e reunir os sobrenadantes dentro do tubo de coleta. </li><li> Centrifuga-se o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas em cinco ml de meio RP10. Adicionar a suspensão de células para uma nova placa de deslizamento, agite e incube durante 30 min à temperatura ambiente. Coletar as células lavar o prato e reuni-los em um tubo cônico. Uma vez que são enriquecidas TEC, rodar para baixo as células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min e suspender as células em 5 ml de tampão de FACS triagem. </li></ol> 6. Purificação da TEC por separação de células <ol><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e preparar a suspensão de células a uma concentração de 4 x 10 7 células em tampão de SCAF triagem. Adicionar anticorpos described na Secção 4.4 em solução de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. Após a coloração, lavar e suspender as células a uma concentração de 10 x 10 6 culas por mL de tampão de FACS triagem. </li><li> Ordenar subconjuntos TEC através de um bocal de 100 pM utilizando separação de células activadas por fluorescência. Célula classificados são recolhidos em 30% (v / v) de FBS em meio RPMI-1640). Uma vez que separação de células é feito, centrifugar células a 400 xg, 4 ° C por 5 min e se preparar para análise a jusante. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

No protocolo, os passos críticos são a preparação de células do estroma do timo (ponto 3) e o enriquecimento da TEC (Seção 4). É altamente recomendável que a solução enzimática fresca é preparada de cada vez e que o tecido é tratado o mais rapidamente possível. Para timos reunidas, optimizar o volume da solução de enzimas é necessária, dependendo do número de timos. Se qualquer resíduo de tecido é deixado após o processamento, a adição de mais solução enzimática e extensão do tempo de incuba...

No início do desenvolvimento das células T, de medula óssea hematopoiéticas derivadas de células progenitoras pluripotentes são recrutados para o córtex do timo, submetido a compromisso de linhagem T e tornar-se precursores de células T 1. No córtex, precursoras de células T CD4 e CD8 duplo negativos (DN) timócitos expandir e diferenciar em imaturo CD4 e CD8 duplo positivo (DP) timócitos, formando uma grande piscina de progenitores com receptores de células T altamente variável 1. Apenas um seleto subconjunto MHC-restrito de células DP vai se tornar único positivos (SP) timócitos CD4 ou CD8, migram para a medula do timo, e se diferenciar em células T maduras funcionalmente competentes, um evento que é chamado de seleção como positiva 2 6. Em contraste, os clones de timócitos auto-reactivos sofrem de selecção negativa e são removidos por meio de apoptose, convertidas em células T reguladoras para a auto-tolerância, ou desviado para linfócitos intra-epiteliais para fins que ainda não são claras 3,7-10. No timo, as células do estroma de timo formar um microambiente único fornecimento de sinais para esses vários destinos de desenvolvimento de células T 5,11,12. As células do estroma de timo são compostas por células epiteliais tímicas (TEC) - incluindo TEC corticais (CTECs TEC) e medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, pericitos derivados da crista neural e outras células mesenquimais 13-15. Entre estes, TEC são cruciais nas várias fases de desenvolvimento das células T 1,2,16,17. No entanto, a falta de uma forma robusta para isolar TEC tem dificultado uma compreensão abrangente de suas funções 16. Em particular, CTECs, que formam uma rede tridimensional circundante progenitores no córtex, são essenciais para a seleção positiva 13,18,19 por razões que ainda não estão claras. Estudos anteriores forneceram pistas sobre a heterogeneidade eo papel da TEC, principalmente contando com ferramentas morfológicas e histológicas 13 </sup&gt;. Recentemente, os papéis únicos de subconjuntos TEC foram abordados por abordagens genéticas em modelos de ratos 12,20. A forma robusta e reproduzível para isolar TEC é fundamental para alcançar a caracterização imparcial de subconjuntos do TCE, avaliação quantitativa e qualitativa das funções do TCE, e esclarecimento de mecanismos como CTECs apoiar seleção positiva. Devido à raridade da TEC no timo e as interações apertadas formam no órgão intacto, o isolamento da TEC tem sido um desafio. O protocolo aqui descrito é baseado em descobertas anteriores, atualmente reagentes disponíveis, técnicas e conhecimento da estrutura do timo e composição estromal. Há quase duas décadas, vários procedimentos foram relatados desagregar tecidos timo 21-27, em que diferentes enzimas foram utilizadas durante a digestão, incluindo tripsina, colagenase e Dispase. Gray et al. comparação dessas enzimas em sua precedure 28, e relataram uma melhoria da method com a digestão de várias etapas de coquetéis enzimáticos 29 que se tornaram amplamente utilizados 20,30. No entanto, este método envolve um tempo de preparação longos e complexos processos de digestão e resulta em última variável o número de células e as proporções de TEC ainda na mesma coorte de murino 29,30. Vários anos atrás, Liberase enzima grau de investigação, contendo altamente purificado colagenase e protease neutra começou a ser utilizado na dissociação tecido do timo 30. Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em digestão Liberase, com processos de separação mecânica optimizadas, que produz um elevado número de TEC viáveis ​​a partir de tecidos do timo do rato. . Para enriquecer células estromais dissociados, estudos anteriores têm usado gradientes de densidade ou separação magnética talão 21,29. No entanto, ambos os métodos de causar grave perda de determinadas populações de células do estroma de timo, especialmente a população de CTECs 29. Eliminação citotóxica e técnicas de panning <sse&gt; 31,32 têm sido amplamente utilizadas para a depleção ou separação de linfócitos no campo imunológica 12,31. Após a comparação destas técnicas, foi estabelecido o protocolo de panning atual para o enriquecimento da TEC. A condição suave durante o processo de enriquecimento leva a menos morte celular e imparcial e uma maior recuperação do TCE. A suspensão de células do timo isolado descrito na Seção 3 pode ser aplicado diretamente para análise por citometria de fluxo para a identificação e caracterização dos subconjuntos TEC e células dendríticas. A Seção 4 descreve uma forma simples e útil para identificar subconjuntos TEC utilizando fluxo multiparâmetro citômetro. Para experiências que procuram obter CTECs purificadas ou mTECs, TEC enriquecimento e células de triagem procedimentos podem ser encontradas na Seção 5 e 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:487px;">Anti-mouse EpCAM</td>
			<td style="width:153px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">XX-5791-YY*</td>
			<td style="width:163px;">Clone G8.8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse MHC II</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5321-YY*</td>
			<td>Clone M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-mouse Ly51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>XX-5891-YY*</td>
			<td>Clone 6C3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UEA-1</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>FL-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td>TreeStar - Flowjo</td>
			<td>FlowJo v7/9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

O timo é um órgão vital para o desenvolvimento de linfócitos T. De células do estroma do timo, as células epiteliais do timo (TEC) são particularmente crucial em vários estágios de desenvolvimento de células T: compromisso de células T, de seleção positiva e negativa de seleção. No entanto, a função de TEC no timo permanece incompletamente compreendida. No artigo, nós fornecemos um método para isolar subconjuntos TEC de timo fresco rato usando uma combinação de ruptura mecânica e digestão enzimática. O método permite que as células do estroma de timo e de timócitos de ser eficientemente libertado a partir de células de células e ligações célula-matriz extracelular e para formar uma suspensão de célula única. Utilizando as células isoladas, multiparamétrica de citometria de fluxo pode ser aplicado para a identificação e caracterização de TEC e células dendríticas. Porque TEC são uma população rara de células no timo, que também descrevem uma forma eficaz para enriquecer e purificar a TEC, esgotando os timócitos, o tipo de célula mais abundante no timo. Folloala o enriquecimento, a selecção de células de tempo pode ser reduzida de forma que a perda de viabilidade das células pode ser minimizada durante a purificação de TEC. As células purificadas são adequados para diversas análises a jusante como o Real Time-PCR, Western blot e perfil de expressão gênica. O protocolo irá promover a investigação da função do TCE e, assim como o desenvolvimento de reconstituição in vitro de células T.

Usando este protocolo, um órgão timo foi removido a partir de um rato adulto (Secção 2) e uma suspensão de células do timo, foi preparado como descrito no ponto 3 a suspensão de células obtida consistiu de timócitos, células de estroma derivadas de hematopoiéticas e células estromais não hematopoiéticas. CD45 é um marcador de pan-hematopoiético expressos em ambos os timócitos e células do estroma hematopoiético, tais como macrófagos e células dendríticas. Em contraste, os TEC não são de origem he...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.7K visualizações.  University of Minnesota.  Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T. 