ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00 CA160574 (SFB) وزمالة من برنامج التدريب التكنولوجيا الحيوية روتجرز (إلى SMM).

وقد وافق هذا الإجراء من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدم في روتجرز، جامعة ولاية نيو جيرسي. عولجت فئران وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يجب استشارة العلماء المنظمات الوطنية والمؤسسية للحيوان المبادئ التوجيهية الموضوعة والمعتمدة. قبل البدء، وإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1. 1. B عزل الخليوي والتنشيط الموت ببطء باستخدام الماوس CO 2 تليها خلع عنق الرحم. ضع الماوس وبالتالي فإن الجانب الأيسر من الجسم هو ما يصل رذاذ والفأر مع الايثانول 70٪ حتى هو الفراء رطبة. تشريح الطحال ومكان في 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع 2 مل غسل العازلة. في غطاء تدفق الصفحي، وكسر بلطف صعودا الطحال في طبق زراعة الأنسجة باستخدام نهاية شقة من حقنة 5 مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 70 ميكرومتر شبكة النايلون إلى 50مل أنبوب ونقل عينة الطحال في 2 مل غسل العازلة داخل شبكة من النايلون. تعطيل بلطف الطحال في شبكة باستخدام نهاية شقة من الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجزء الخلفي من حقنة و35 ملم مع لوحة 8 مل من غسل العازلة وتصفية 70 ميكرون من خلال شبكة من النايلون. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 3 مل من ACK العازلة تحلل. ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة لتعطيل كتل واحتضان لمدة 5 دقائق. إضافة 10 مل من غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل طاف و resuspend بيليه من خلال الاستفادة من الجزء السفلي من الأنبوب ثم من قبل pipetting في 1 مل من غسل العازلة. إضافة 50 ميكرولتر من مكافحة CD43 MACS الخرز الصغير واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. إضافة 10 مل من غسل العازلة، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة 10 مل من غسل العازلة، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لالعمود المصغرة MACS عن طريق وضع عمود على المغناطيس MACS. وضع وصفت 15 مل أنبوب مخروطي تحت العمود. إضافة 1 مل من غسل العازلة إلى العمود والسماح لتشغيل وصولا إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وطاف resuspend في 1 مل من غسل العازلة. تحميل العينة في العمود بعد تشغيل من خلال غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشغيل العينة من خلال العمود، إضافة 1 مل غسل عازلة لغسل العمود. إضافة 7 مل من غسل العازلة مباشرة إلى العينة التي تم جمعها في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نقل حجم المطلوب من الخلايا اللازمة ل5،000،000 خلية / جيدا في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. الملحق المتوسطة خلية B مع LPS 1: 500 وIL4 1: 1،000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وإضافة حجم مناسب لاستكمال المتوسطة الخلايا B اللازمة لتركيز النهائي من 1،000،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في 6 لوحات جيدة مع 5 مل من الخلايا في خلية 1،000،000 / مل ومكان في الرطوبة فيإد ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 2. B تثبيت خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من colcemid إلى جانب تحتوي على 5 مل من الخلايا البائية (لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل)، واحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. Prewarm 75 ملي بوكل حل في 37 ° C حمام الماء. نقل الخلايا B إلى المسمى أنبوب 15 مل. تغطية التسمية مع الشريط وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وترك 1 مل في الأنبوب و resuspend بيليه من قبل pipetting. إضافة 5 مل من قطرة قطرة بوكل prewarmed بينما التنصت أو ينبض في دوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من بوكل وتخلط بواسطة قلب. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. إضافة 5 قطرات من تثبيتي الطازجة ومزيج من قلب. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف وترك 1 مل في الأنبوب و resuspend بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من قطرة قطرة تثبيتي الطازجة بينما التنصت أو يتقطع على VORتكس. إضافة 10 مل إضافية من تثبيتي، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف وترك 1 مل في أنبوب و resuspend من قبل pipetting. إضافة 14 مل من مثبت الطازجة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.7 مرتين أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 14 مل من تثبيتي الطازجة. ختم قبعات مع parafilm وتخزينها بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية. </li></ol> 3. إعداد الطورية ينتشر كروموسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة البيئية تنظم إلى 22.9 درجة مئوية والرطوبة 52٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا B الثابتة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تثبيتي نضح ترك 70 ميكرولتر في الأنبوب و resuspend من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح وصفت في غرفة الرطوبة في زاوية 35 درجة. إسقاط 35 ميكرولتر من الخلايا B معلق على شريحة وإسقاط شريحتين لكل عينة. تسمح الشرائح لتجف في غرفة الرطوبة لمدة 30 دقيقة ثم تخزين الشرائحفي مربع الشريحة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 4. التيلومير السلطة الوطنية الفلسطينية FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التحقيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفورماميد منزوع الأيونات قبل الدافئ إلى 37 درجة مئوية. خلط 2 ميكرولتر من التيلومير التحقيق مع السلطة الوطنية الفلسطينية قبل تحسنت الفورماميد 7 ميكرولتر منزوع الأيونات واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ مزيج الرئيسي FISH إلى 37 درجة مئوية. إضافة 7 ميكرولتر قبل تحسنت مزيج الرئيسي FISH إلى خليط من الخطوة 4.1.1 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الخليط التحقيق لمدة 8 دقائق عند 80 درجة مئوية. قبل يصلب التحقيق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعالجة من الشرائح كروموسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تسخين وعاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على 50 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.01 M إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في مختلف عاء زجاجي يحتوي على الشريحة تلطيخ 2X SSC لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من الأسهم البيبسين على الزجاج قبل تحسنت الشريحة تلطيخ جرة وتخلط بواسطة قلب. نقل الشرائح لهذا SL زجاججرة IDE تلطيخ واحتضان 90 ثانية في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح 2X في مختلف عاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة، والهز. ثم تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X / MgCl 2 في درجة حرارة الغرفة، والهز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى وعاء زجاجي يحتوي على الشريحة تلطيخ الطازجة 1٪ الفورمالديهايد / 1X PBS / MgCl 2 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في مختلف عاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة، والهز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة الجفاف الايثانول من خلال وجود زجاج الجرار منفصل الشريحة تلطيخ تحتوي على 70٪، 90٪، والإيثانول بنسبة 100٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى كل جرة لمدة 3 دقائق، بدءا من الايثانول 70٪، ثم 90٪ من الإيثانول، ثم الإيثانول بنسبة 100٪. وضع الجرار الإيثانول في -20 ° C عند الانتهاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح للهواء الجاف من خلال استغلال الإيثانول الزائد على منشفة ورقية والذين يدعمون الشرائح في زاوية 35 درجة. مرة واحدة جافة، يا أماهRK مساحة 18 × 18 مم للتهجين على خلفية الشرائح باستخدام قلم الماس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمسخ من الشرائح لFISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الفورماميد 120 ميكرولتر 70٪ منزوع الأيونات / 2X SSC إلى 24 × 60 مم ساترة. تلمس الشريحة إلى ساترة. تفسد الشريحة في 80 درجة مئوية على طبق ساخن لمدة 90 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة وبدقة الانزلاق قبالة ساترة ومكان الشريحة في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق، تليها 90٪ من الإيثانول، والإيثانول بنسبة 100٪ كل لمدة 3 دقائق. تسمح الشرائح للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة رطبة من بطانة مربع من البلاستيك مع غطاء محكم والمناديل الورقية المبللة. وينبغي أن تكون ورقة رطبة، ولكن ليس مشبعة بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة رطبة، وتطبيق مزيج صلب التحقيق قبل من الخطوة 4.1.3 الى المجال ملحوظة على الشريحة، وتغطي مع 18 × 18 مم زلة تغطية واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بعد الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ 50٪ الفورماميد / SSC 2X، 1X SSC، و4X SSC / 0.1٪ توين 20 في 45 °، C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية لل coverslips وتغسل الشرائح في درجة حرارة ما قبل 50٪ الفورماميد / 2X SSC 3xfor كل 5 دقائق في الظلام وتهتز. تغسل الشرائح في قبل تحسنت 1X SSC 3xfor كل 5 دقائق، والهز. أخيرا، وغسل الشرائح في قبل تحسنت 4X SSC / 0.1٪ توين 20 3xfor 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الشرائح لمدة 3 دقائق في دابي في ضوء محمية الزجاج الشرائح تلطيخ الجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 2X SSC، والهز. تطبيق 35 ميكرولتر من Mowiol المتوسطة المتزايدة، مع تغطية 24 × 60 ملم coverslips وتخزين الشرائح في 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol> 5. تحليل مجهرية من الكروموسومات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الشرائح الطورية باستخدام مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان القياسية. استخدام منصة التصوير مع مرحلة الآلية مثل منصة MetaSystems Metafer للحصول على أفضل النتائج. لكل انتشار الطورية، وجمع صورة واحدة للدابي مضان لتصور الكروموسومات، وصورة واحدة للإشارة الفلورسنت من التيلومير صرداء. (على سبيل المثال، يتم fluors غيرها من Cy3- المتاحة ونعمل بنفس القدر أيضا.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب الصور مع برنامج تحليل الصور وتحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم المصالح المتضاربة.

بينما هي مناسبة خاصة الخلايا الليمفاوية B المنشط لإعداد ينتشر كروموسوم الإنقسامية، أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا. الخلايا اللمفية تي تشترك العديد من مزايا خلايا B، حيث يمكن تنقيته من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ولها مؤشر الإنقسامية عالية عندما حفز النمو ?...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

ويتسبب السرطان عن طريق تراكم الطفرات التي تؤثر على الجينات التي تنظم نمو الخلايا العادية. الطفرة هي نتيجة للتغيرات في هيكل وتسلسل الجينوم الناجمة عن الأضرار التي لحقت الحمض النووي. يمكن أن يحدث التلف في الحمض النووي من خلال مجموعة متنوعة من العملية، بما في ذلك العوامل خارجية مثل الإشعاع المؤين، وكناتج نتاج الأيض الخلوي العادي، مثل نزع الأمين التلقائي للقواعد النوكليوتيدات أو ضرر يحدث عن طريق الاتصال مع أنواع الاكسجين التفاعلية 1. على الرغم من أن خلايا الثدييات تمتلك مجموعة من الأنشطة التي يمكن أن إصلاح الحمض النووي من التلف أو عكس استعادة تسلسل في مواقع انقطاع، مع ذلك الطفرات تتراكم طوال فترة حياة الخلية. التلف في الحمض النووي يمكن أن تساهم علاوة على الشيخوخة وفقدان فاعلية الخلايا الجذعية، وهما العمليات التي ترتبط مع المرض الناجمة عن الشيخوخة 2. فهم إصلاح الحمض النووي من التلف لذلك من أهمية مركزية في معالجة اثنين علامةقضايا ificant في الصحة العامة. تشير أدلة متزايدة على أن الثدييات مسارات إصلاح الحمض النووي يمكن أن تسهم في تطور جينوم الخلايا السرطانية 3،4، مما يزيد من ضرورة لفهم العمليات التي تدخل في قمع طفرة على المستوى الجزيئي. التصور المباشر من الانحرافات الكروموسومات هي وسيلة قوية وكمية من تحديد مدى عدم الاستقرار الجيني في نوع من الخلايا معين. الكروموسومات المختصرة من الخلايا في الطورية يمكن عزل وتفتيشها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت. لقد حققت هذه المناهج الوراثية الخلوية في الممارسة العملية لعدة عقود، ويمكن استخدامها للتدليل على ظهور translocations أو أنواع معينة من الانحرافات الصبغية المرتبطة بفقدان أنشطة إصلاح الحمض النووي. بروتوكول يفسح المجال لعدة ملحقات المحتملة: يمكن أن توصف الكروموسومات مع تحقيقات لتنميط نووي الطيفي (SKY) أو متعدد الألوان فلوري التهجين في الموقع(mFISH) لتحديد translocations 5،6. كما تمكن هذه التقنيات وتيرة translocations الصبغي وهيكل translocations الصبغي معقدة يتم تحديدها، الذي يوفر معلومات إضافية تتجاوز ما هو ممكن مع هذا البروتوكول. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد تحقيقات تسلسل معين وتستخدم لاختبار تردد الكسر DNA في مواقع الجينومية اختيار 7. في هذا البروتوكول، ونحن تصف إعداد كروموسوم الطورية ينتشر من الخلايا الليمفاوية B. يستخدم الببتيد حمض النووي (PNA) التحقيق fluorescently المسمى ليكرر الكروموسومات، الذي يصادف التيلوميرات بكفاءة في كروموسوم الطورية ينتشر هذا البروتوكول لديه العديد من المزايا. خلايا B يمكن أن يتسبب في النمو في مؤشر الإنقسامية عالية جدا، بحيث يمكن أن تنتج باستمرار هوامش عالية الجودة. خلايا B من الفئران المعدلة وراثيا هي أيضا أقل احتمالا لاحتواء الطفرات الوراثية الثانوية التي يمكن أن نخلط تحليل مساهمة كبيرةجينات محددة لسلامة الجينوم. يمكن أن تكتمل النهج PNA-FISH في يوم واحد، ويسمح التهديف أكثر دقة من الاعفاءات كروموسوم. باستخدام هذا النهج، وخاصة في تركيبة مع معدات معينة الموصوفة في هذا البروتوكول، فمن الممكن لإنتاج متسقة للغاية، وينتشر عالية الجودة وتحليل بسرعة معدل ونوع من عدم الاستقرار الجيني.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

إصلاح خلل الحمض النووي يؤدي إلى زيادة عدم الاستقرار الجيني، والذي هو السبب الجذري للطفرات التي تؤدي إلى تكون الأورام. تحليل وتيرة ونوع من الانحرافات الصبغية في أنواع مختلفة من الخلايا يسمح عيوب في مسارات إصلاح الحمض النووي ليتم توضيح. وقد ساعد فهم الثدييات إصلاح الحمض النووي البيولوجيا كثيرا من إنتاج فئران مصابة بالضربة القاضية في جينات معينة. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني في الخلايا الليمفاوية B الماوس. وضع العلامات على التيلوميرات باستخدام تحقيقات PNA-FISH (ببتيد الحمض النووي - فلوري في الموقع التهجين) يسهل تحليل سريع من عدم الاستقرار الجيني في كروموزوم ينتشر الطورية. خلايا B لديها مزايا نسبية محددة على الخلايا الليفية، لأن لديهم الصيغة الصبغية الطبيعي ومؤشر الإنقسامية العالي. وبالتالي الثقافة على المدى القصير من خلايا B يمكن قياس دقيق من عدم الاستقرار الجيني في السكان الخلية الأساسي الذي من المرجح أن يكون أقل طفرة جينية الثانويةق مما هو عادة موجودة في الخلايا الليفية تتحول أو خطوط الخلايا المرضى.

يجب الكروموسومات الطورية المشتقة من خلية واحدة تشكل مجموعة منفصلة تحتوي على 40 صبغيا (إذا باستخدام خلايا فأر) (الشكل 1A). كل كروموسوم يحتوي على السنترومير في نهاية واحدة، وهو أمر واضح باعتباره المجال الأزرق الفاتح. في الصبغيات العادية، وينظر إشارتين التيلومير...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

مسارات إصلاح الحمض النووي ضرورية لصيانة سلامة الجينوم ومنع الطفرات والسرطان. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني عن طريق الملاحظة المباشرة للانحرافات في الكروموسومات الطورية ينتشر من خلايا B الماوس باستخدام الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) ليكرر DNA الكروموسومات في.

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  Rutgers, the State University of New Jersey.  مسارات إصلاح الحمض النووي ضرورية لصيانة سلامة الجينوم ومنع الطفرات والسرطان. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني عن طريق الملاحظة المباشرة للانحرافات في الكروموسومات الطورية ينتشر من خلايا B الماوس باستخدام الفلورسنت 

Video: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

سرعة الكشف الجزيئي والتمايز من فيروسات الأنفلونزا A و B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...