تساعد طريقتنا في دراسة حركية تكوين مركب البروتين. وهو يصف مدى ضيق مجمع البروتين ، وإذا كان يتم التدخل في تكوين البروتين المعقد من قبل البروتينات الأخرى. هذه التقنية تمكن دراسة البروتين البروتين التفاعل بطريقة كمية باستخدام الفلوريسكانس كمراسل، لدينا يمكن أن رصد الرابطة وفك ارتباط مجمع البروتين في الوقت الحقيقي.
للبدء، تصميم مقايسة فريت بدءا من البيانات لمجمع COL1 CAND1 من قاعدة بيانات البروتين. تحميل هيكل في PyMOL، ومن ثم انتقل إلى القائمة المعالج واستخدام وظيفة قياس لتقدير المسافة بين الأحماض الأمينية الأولى من CAND1 والأحماض الأمينية الأخيرة من COL1. ثم، تحميل المشاهد الأطياف على الانترنت وعرض الإثارة والأطياف انبعاث 7-أمينية-4-ميثيلكومارين وFlASH في وقت واحد.
AMC هو المانح FRET وFlash هو قبول فريت. إعداد الخلايا مع البروتين المانح FRET باتباع جنبا إلى جنب في بروتوكول النص المرافق. ثم، تنقية مجمع SORTASE COL1 RBX1 عن طريق إضافة أول 50 ملليلتر من العازلة تحلل إلى بيليه من الخلايا القولونية التعبير عن مجمع SORTASE COL1 RBX1.
الجليد الخلايا على الجليد مع سونيكيشن في 50٪ السعة. بالتناوب السلطة لمدة ثلاث دقائق بحيث يكون ثانية واحدة على، ثم ثانية واحدة قبالة لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة. نقل الخلية الناتجة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر وإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 25، 000 مرات ز لمدة 45 دقيقة.
ثم، إضافة إلى خمسة ملليلترات من الخرز الجلوتاثيون واحتضانها في أربع درجات مئوية لمسح الخلية lysate. بعد الحضانة، الطرد المركزي خليط حبة lysate في 1، 500 مرة ز لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية. ثم، إزالة المناط.
المقبل، وغسل الخرز مع 5 ملليلتر من العازلة تحلل عدم وجود مثبطات البروتياز. بعد الطرد المركزي للحل، إزالة الفائق. الآن، إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة تحلل إلى الخرز غسلها ونقل الطين حبة في عمود فارغ.
إلى العمود الجديد، إضافة أيضا خمسة ملليلترات من العازلة elution ومن ثم احتضان العمود لمدة 10 دقائق وجمع eluate. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من ثرومبين في خمسة ملليغرام لكل ملليلتر إلى eluate من الخرز الجلوتاثيون. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تمييع عينة البروتين ثلاث أضعاف مع العازلة A.Load عينة البروتين إلى العازلة A توازنها تبادل العمود اللوني في صفر نقطة خمس ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
ثم، إضافة تدرج من صفر إلى 50٪ من المخزن المؤقت B في المخزن المؤقت A ل elute البروتين مع معدل تدفق 1 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. بعد ذلك، تجمع كسور الويات التي تحتوي على البروتين المانح فريت والتركيز عليه وصولا الى نقطتين خمس ملليلتر باستخدام غشاء الترشيح الفائق مع قطع 30 كيلودالون. الآن، إضافة 7-amino-4-methylcoumarin إلى c-terminus من COL1 من خلال sortase بوساطة transpeptidation عن طريق تغيير أولا العازلة في عينة البروتين المانحة فريت في المخزن المؤقت sortase باستخدام عمود desalting.
لتحقيق ذلك، توازن أول عمود إزالة سالت مع 25 ملليلتر من المخزن المؤقت sortase. ثم، تحميل نقطتين خمس ملليلتر من محلول البروتين المانح FRET في العمود والتخلص من التدفق من خلال. المقبل، elute العينة مع ثلاث نقاط خمس ملليلتر من المخزن المؤقت sortase وجمع تدفق من خلال.
في 900 ميكرولترات من eluate، إضافة 100 ميكرولترات من 600 sortase تنقية ميكرومولار A الحل و 10 ميكرولترات من 25 ملليمولار GGGG-AMC الببتيد. احتضان خليط التفاعل في 30 درجة مئوية في الظلام بين عشية وضحاها لتوليد COL1-AMC-RBX1. الآن، تحميل كل من العينة على حجم استبعاد عمود الكروماتوغرافيا و elute ذلك مع نقطة واحدة خمسة أضعاف حجم العمود من المخزن المؤقت.
في النهاية، تجمع الكسور المائلة التي تحتوي على COL1-AMC-RBX1. اتبع على طول في بروتوكول النص لإعداد البروتين قبول فريت. العديد من الخطوات مماثلة لإعداد البروتين المانحة فريت.
بمجرد الانتهاء، قم بإعداد حل FlASH CAND1. أولا، إضافة مصغرة واحدة من حل FlASH إلى 50 ميكرولترات من حل تترا-cys-CAND1 الطازجة. اخلطي الحلول المشتركة جيدا وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة إلى ساعتين لتشكيل محلول FlASH CAND1.
في 300 ميكرولترات من عازلة فريت، إضافة COL1-AMC-RBX1 إلى تركيز النهائي من 70 نانومولار ونقل الحل إلى cuvette. ضع الـ cuvette في حامل العينة من مقياس الفلور. استثارة العينة مع 350 ضوء الإثارة نانومتر ومسح إشارات الانبعاثات من 400 إلى 600 نانومتر في واحدة نانومتر الزيادات.
ثم، في 300 ميكرولتررس من عازلة فريت، إضافة كل من COL1-AMC-RBX1 وFlASH-CAND1 إلى تركيز النهائي من 70 نانوموللار. اثير العينة مع 350 نانومتر ضوء الإثارة ومسح إشارات الانبعاثات من 400-600 نانومتر في واحدة نانومتر الزيادات. تعيين ضوء الإثارة في 350 نانومتر واستخدام شريط تمرير مرشح يسمح 450 نانومتر ضوء الانبعاثات لتمرير وكتل 500 إلى 650 نانومتر ضوء الانبعاثات.
مع صمامات العينة في موضع ملء ربط حقنة ثلاثة ملليلتر مليئة بالماء. ثم، غسل الحقن العينتين بالماء عن طريق تحريك حقنة عينة محرك الأقراص صعودا وهبوطا عدة مرات، والتخلص من الماء عند الانتهاء. بعد ذلك، قم بتوصيل حقنة من ثلاثة ملليلتر مملوءة بمخزنة FRET.
غسل الحقن العينة اثنين مع المخزن FRET عن طريق تحريك محرك حقنة عينة صعودا وهبوطا عدة مرات، والتخلص من الماء عند الانتهاء. الآن، قم بتوصيل حقنة ثلاثة ملليلتر وتحميل أول حقنة عينة، المحاقن A، مع 100 نانومولار COL1-AMC-RBX1 في المخزن المؤقت لـ FRET. ثم تحويل صمام عينة إلى موقف محرك الأقراص أيضا، توصيل حقنة ثلاثة ملليلتر إلى حقنة B وتحميل حقنة B مع 100 نانومولار من FLASH CAND1 في المخزن المؤقت فريت وبدوره صمام إلى موقف محرك الأقراص.
فتح لوحة التحكم تحت الحصول على البرنامج وسجل انبعاث COL1-AMC على مدى 60 ثانية. ثم، خذ طلقة واحدة. تناسب الانخفاض وإشارات الفلورسنت تقاس بمرور الوقت من كل طلقة إلى منحنى أسي واحد.
غسل النظام كما هو مبين سابقا ثم إضافة حل من 100 نانومولار COL1-AMC-RBX1 و 100 نانومولار FlASH CAND1 في المخزن FRET في حقنة A.Connect أنه إلى النظام في حين أنه في موضع ملء تحميل حقنة A ومن ثم تحويل صمام عينة إلى موقف محرك الأقراص. بعد ذلك، تحميل حل من Skp1-Skp2 في حقنة B.Connect إلى النظام في حين أنه في موقف ملء. تحميل حقنة B ومن ثم تحويل العينة إلى موقف محرك الأقراص.
في البرنامج، انتقل إلى الحصول على لوحة التحكم وفتحها. إعداد البرنامج لتسجيل انبعاث COL1-AMC على مدى 30 ثانية. ثم أخذ طلقة واحدة.
وإشارات الفلوريسنس زيادة مع مرور الوقت بعد خلط الحلول من حقنة A والحقنة B.When 70 نانوموللار كل من COL1-AMC وFLASH CAND1 كانت مختلطة لتوليد فريت، وكانت هناك ذرتان للانبعاثات موجودة في أطياف الانبعاثات. وأصبحت ذروة COL1-AMC أقل، وأصبحت ذروة FlASH CAND1 أعلى. عندما تم استخدام الطول الكامل CAND1 لFRET أظهرت ذروة المانحين انخفاضًا بنسبة 10٪ في الكثافة.
ومع ذلك، عندما تم استخدام CAND1 مع أول حلزوني تم اقتطاعها الحد من كثافة الذروة المانحة إلى 30٪ مما يشير إلى كفاءة أعلى من FRET لتأكيد أن التغييرات إشارة كانت نتيجة من FRET بين COL1-AMC وFLASH CAND1، تم خلط FRET المانح مع كاند غير الموسومة الزائدة المعروفة باسم تشيس في المقبّل. ونتيجة لذلك، أعيدت ذروة المانحين بالكامل وانخفضت ذروة المتقبل. يظهر هنا هو رسم من متوسط القيمة K الملاحظة مع تركيز CAND1 بعد تحليل الانحدار الخطي.
لقياس ثابت على المجمع، 50 نانومولار COL1-AMC تم قياسها في سلسلة من الثوابت معدل تفكك لوحظ تم قياسها عن طريق خلط 50 نانومولار COL1-AMC مع زيادة تركيزات FlASH CAND1. وعلى غرار قياس الثابت الموجود، تم العثور على ثابت الانفصام الملاحظ لـ COL1 و CAND1 عن طريق رصد استعادة إشارة المانحة بمرور الوقت على مقياس فلوري التدفق المتوقف. هنا زادت إشارة المانح بسرعة وكشفت عن قيمة K الملاحظة من صفر نقطة أربعة في الثانية الواحدة.
في المقابل، عندما تم إضافة المخزن المؤقت إلى مجمع ما قبل تجميعها، لوحظ أي زيادة إشارة تشير إلى أن تفكك سريع من كاند 1 COL1 تم تشغيلها بواسطة Skp1 Skp2. تأكد من تقليل كمية الضوء التي يتعرض لها المتبرع والبروتينات المقبولة. حاول أن تبقي الفلوروفورات في الظلام قدر الإمكان.
