This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول وفقا للمعهد الوطني للمبادئ التوجيهية الصحة لعلاج الأخلاقية ورعاية الحيوانات، وفقا لبروتوكول IACUC استخدام الحيوانات المعتمدة. 1. خلية الخط الصيانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خلايا BAF3 في المتوسط ​​RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل) وقضى مستنبت من خلايا Wehi. زراعة خلايا HEK293T في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO2. </li></ol> 2. البلازميد البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ فأر JAK2 ولها أنكجنيك شكل الإسوي JAK2-V617F في pMSCV-بورو-GW التي كتبها LR clonase باستخدام معيار إجراءات إعادة التركيب الاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء ناقلات luciferase المراسل التعبير (pMSCV لوك-الكرز-GW) المستخدمة في في السادسالتصوير فو، تضخيم luciferase المراسل من pLVX-تيت-ON ناقلات بواسطة PCR باستخدام بادئات (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG وLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC)، يليه مع الاستنساخ في pENTR-SD-TOPO لتوليد pENTR لوك، والذي يستخدم لنقل الجين luciferase المراسل في ناقلات فيروسات الرجعية، pMSCV-الكرز-GW بواسطة إعادة التركيب الاستنساخ بوساطة باستخدام LR clonase. </li></ol> 3. إعداد مكتبة الطفرة عشوائية، وفحص وتحديد الطفرات 3.1) عشوائية الطفرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ كامل طول JAK2 النوع البري والطفرة V617F إلى pMSCV-بورو-GW فيروسات ناقلات باستخدام تقنية إعادة التركيب استنساخ التجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 ميكروغرام من DNA البلازميد JAK2-V617F لتحويل، XL-1 الأحمر، E. خلايا القولونية، وهو خلل في آليات إصلاح الحمض النووي مما يسمح لهم لدمج الطفرات العشوائية أثناء النسخ المتماثل. وبشكل أكثر تحديدا، مزيج 50-100 نانوغرام من الحمض النووي (أكثر من 100 نانوغرام من الحمض النووي يقلل كفاءة التحول) مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في أنبوب البولي بروبلين قبل المبردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة، يحوم بلطف كل 5 دقائق. للحصول على تغطية مكتبة جيدة، استخدم 05:56 أنابيب الخلايا المختصة. ملاحظة: أكثر من 100 نانوغرام من الحمض النووي يقلل كفاءة التحول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأنبوب في حمام مائي عند 42 ° C لصدمة الحرارة من 45 ثانية واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. المقبل، إضافة 1 مل من SOC المتوسطة (2.0٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.05٪ كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl2، 10 ملي MgSO4، و 0.4٪ D-الجلوكوز). احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا لوحة من كل أنبوب على أربعة 10 سم لوحات LB-آغار تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحات ل16-24 ساعة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد المستعمرات مرئية، وجمع لهم عن طريق كشط لوحات مع لوحة مكشطة معقمة. خلايا تجمع من كل لوحة وبلازميد العزلة DNA استخدام عدة استخراج البلازميد التجارية. ملاحظة: عادة المستعمرات هي أصغر واتخاذ 18-24 ساعة لتكونمرئية لأن هذه هي بطيئة سلالات بكتيرية المتنامية. في هذه المرحلة، وتقييم عدم التجانس من الطفرات في المكتبة عن طريق تقييد الهضم مع قطع متكررة مثل Sau3A1 أو Taq1 أو التسلسل. </li></ol> 3.2) إنتاج فيروسات الرجعية Supernatants وتنبيغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، لوحة 4 × 10 6 خلايا كلوة 293T على 100 ​​سم أطباق في DMEM تحتوي على 10٪ FCS والبنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، استبدل المتوسطة وبالنقل الخلايا مع mutagenized مكتبة pMSCV-JAK2-V617F. لكل 10 سم لوحة، وخلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي (5 ميكروغرام من مكتبة البلازميد و 5 ميكروغرام من التعبئة والتغليف فيروسات البلازميد، pCLEco) مع 40 ميكرولتر من FuGENE إلى إجمالي حجم 400 ميكرولتر باستخدام المصل وسائل الاعلام DMEM مجانا. احتضان هذا المزيج DNA والدهون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة إضافة قطرة-DNA الدهون المعقدة الحكيم على رأس خلايا HEK293T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ستة ساعة، وتغيير وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ثإيث وسائل الإعلام الجديدة واحتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية لإنتاج الفيروس. بعد 48 ساعة من الحضانة، وجمع supernatants الفيروسية التي تمت تصفيتها من خلال مرشح 0.45 ميكرون acrodisc. </li></ol> 3.3) اختيار النسخ مقاومة في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمقاومة المسوخ JAK2-V617F المخدرات، تنبيغ 100 مليون BAF3 خلية مع 100 مل من supernatants الفيروس وجود عيار الفيروسية من 0.5-1 X10 6. وبشكل أكثر تحديدا، مزيج 10 8 الخلايا مع 100 مل من طاف الفيروس إلى إجمالي حجم 300 مل باستخدام وسائل الإعلام RPMI، تحتوي على 10٪ مصل و 24 ميكروغرام / مل من polyberene (تركيز النهائي من ployberene هو 8 ميكروغرام / مل). توزيع هذه خلاطات خلية في عدة ست لوحات جيدة (4-5 مل لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،250 x ج لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، تجميع الخلايا معا وتخلط مع Ruxolitinib والمتوسطة التي تحتوي على أجار لينة ومطلي في سيس لوحات جيدة. لكل تركيز الدواء، مزيج 10 مل من خلايا BAF3 transduced (10-20 مليون خلية) مع كمية مناسبة من Ruxolitinib في أنبوب 50 مل. جعل يصل حجم إلى 40 مل باستخدام RPMI تحتوي على 20٪ مصل. إضافة 10 مل من 1.2٪ أجار إلى الخلايا، وmixcarefully لوحة في ست لوحات جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. اختيار المستعمرات المقاومة باستخدام 0.2 مل نصائح ماصة والثقافة الفرعية منهم على حدة في 24 لوحات جيدا لمدة 3-4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا BAF3 المقاومة عن طريق الطرد المركزي في 450 x ج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. عزل الحمض النووي الجيني باستخدام الجينومية عدة عزل الحمض النووي التجارية. PCR تضخيم كامل طول JAK2 [كدنا من 100 نانوغرام من الحمض النووي باستخدام بادئات الجينومية (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG وmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) وقالب الطويل توسيع أنظمة PCR عالية الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المنتجات PCR من قبل الاغاروز الكهربائي للهلام. استئصال 3.4 كيلوبايت من الفرقة DNA تمثل JAK2 إطار الترميز وعزل DNAاستخدام عدة استخراج الهلام التجارية. تسلسل كامل طول كدنا] باستخدام 8 الاشعال الداخلية (P1 - P8) تمتد تسلسل الترميز وتحليل تسلسل باستخدام البرمجيات التجارية. </li></ol> 4. في المختبر التحقق من الطفرات المقاومة لل العديد من الحيوانات المستنسخة خلية تحمل التحور أكثر من واحد، لاختبار مساهمة كل طفرة في مقاومة النمط الظاهري، وتوليد المتغيرات مختارة من قبل الطفرات موقع الموجه باستخدام pMSCV-617F-JAK2V بلازميد كقالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الموقع الطفرات الموجهة على pMSCV-JAK2-V617F البلازميد باستخدام طقم الطفرات التجارية و[أليغنوكليوتيد تهدف إلى خلق طفرات نقطة. تأكيد الهويات من الحيوانات المستنسخة طافرة من التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيغ الخلايا BAF3 مع الفيروسات القهقرية التي تستخدم فيها البلازميدات متحولة يتبع مع اختيار باستخدام بوروميسين في 1μg / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 10 4 خلايا BAF3-JAK2-V617F (50 ميكرولتر من RPMI مع 10٪ FCS) في كل بئر من 96 لوحة جيدا. فصللاي إضافة 50 ميكرولتر من ruxolitinib تحتوي على وسائل الإعلام إلى الآبار عبر لوحة (تركيز النهائي: 0، 1، 3، 5، 10، و 20 ميكرومتر)، واحتضان لوحات لمدة 60 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم بقاء الخلية من خلال إضافة 10 ميكرولتر من WST-1 الكاشف لكل يتبع بشكل جيد مع الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة. الامتصاصية سجل في A450 باستخدام قارئ لوحة. أداء جميع المقايسات في ثلاث نسخ ومؤامرة متوسط ​​الامتصاصية ضد INCB018424 تركيزات. إجراء منحنى السيني أفضل مناسبا باستخدام منحنى غير الخطية الخوارزمية المناسب. يسجل تركيز الدواء مما أسفر عن 50٪ بقاء الخلية مثل IC50 الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالي، لوحة ستة ملايين BAF3 الخلايا معربا عن المتغيرات JAK2 في ست لوحات جيدة في RPMI المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل مع زيادة تركيزات ruxolitinib وحضنت لمدة 4-6 ساعة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وليز في 20 ملي تريس، الكلور (درجة الحموضة 7.5)، 50مم كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40، 0.1٪ SDS، 5 ملي EDTA، 1MM EGTA، 1 ملم فلوريد الصوديوم، 2 ملي الصوديوم فانادات، و 5٪ الجلسرين تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز. يصوتن تعليق خلية لمدة 1 دقيقة تليها إضافة 5X عازلة هلام تحميل (350 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 6.8]، 500 ملي DTT، 15٪ SDS، 10 ملي Benzamidine، 5 ملي EDTA، 5 ملي EGTA، 5 ملي الصوديوم فانادات ، البروتياز الكوكتيل، 50٪ الجلسرين، و 0.001٪ برموفينول الأزرق) وتمسخ عند 70 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل البروتينات على 8٪ SDS بولي أكريلاميد هلام في ظل ظروف تغيير طبيعة. أداء immunoblotting مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للphopsho STAT5. تجريد البقع وreprobed مع الأرنب بولكلونل مكافحة SATA5 الأجسام المضادة. تصور العصابات باستخدام الكواشف ECL وفقا لتوصية المورد. </li></ol> 5. في فيفو التحقق من صحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيغ الخلايا BAF3 التعبير و luciferase الكرز (transduced مع الفيروسات القهقرية مصنوعة من pMSCV لوك-شيرراي GW) مع الفيروسات معربا عن JAK2-V617F والمتغيرات مقاومة. حدد الخلايا التي تعيش اختيار بوروميسين للتعبير عن JAK2 والمتغيرات مقاومته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ مليوني بنشاط متزايد خلايا / الكرز BAF3 لوك تحمل JAK2-V617F والمتغيرات مقاومة في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ل6 الفئران BALB / C عن طريق حقن الوريد الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أيام من زرع الخلايا، وحقن الفئران مع Ruxolitinib (100 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء القائم على luciferase المراسل التصوير تلألؤ بيولوجي مع نظام التصوير. . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وباختصار، وإعداد حل وسيفيرين عن طريق إذابة 300 ملغ إلى 25 مل من الماء منزوع الأيونات عقيمة، قسامة في أحجام أصغر وتخزينها. ملاحظة: مخزن وسيفيرين في -80 درجة مئوية، وحماية من الضوء حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 250 ميكرولتر لكل الماوس عن طريق IP لتحقيق 125 مغ / كغ في كل فأر. تخدير الفئران من نفس المجموعة معا باستخدام الأيزوفلورين استنشاقه (1.5٪ -2.0٪) في صندوق مغلق. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على الالبريد العين لمنع جفاف. ملاحظة: الوقت الذي يستغرقه لالفئران للنوم (10-15 دقيقة) سمحت النشاط وسيفيرين إلى الذروة. الحفاظ على الوقت متناسقة بين المجموعات لتجنب الاختلاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الفئران على الفور إلى غرفة التصوير المرحلة والحفاظ على التخدير في 1.5-2٪ isofluorane خلال إجراءات التصوير. الفئران صورة مع متسلسل 0.1، 0.5، 1، 5، 30، 60، و 300 التعرض ثانية. التقط صورا وquantitate شدة تلألؤ بيولوجي باستخدام الحصول على الصور وبرامج التحليل. وبعد التصوير عودة الفئران إلى قفصه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل، في الجسم الحي الخيمرية حصاد مجموع الخلايا bonemarrow. الموت ببطء الفئران مع CO 2 لمدة 5 دقائق تليها مع خلع عنق الرحم. حصاد العظام وسحق في 4 مل PBS الباردة لجمع نخاع العظام. تحليل الخلايا إيجابية في المئة الكرز تحت المجهر مضان وتحديد باستخدام FACS. جمع عشرين ألف الأحداث من كل عينة. </li></ol>

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

أثبتت نجاح السريري للإيماتينب في علاج CML ليس فقط إمكانية استهداف تحركات شفتين بواسطة مثبطات جزيء صغير، ولكن القيود كشفت أيضا العلاج المستهدفة: الانتكاس السريري وظهور الطفرات المقاومة للأدوية في الجينات المستهدفة. تحديد الطفرات المقاومة يساعد في تحسين إدارة السرير?...

تحركات البروتينات هي الانزيمات التنظيمية الرئيسية داخل الخلايا مسارات نقل الإشارة التي تعدل على ما يبدو كل وظيفة الخلوية. والرقابة السليمة على كيناز بوساطة إشارات حاسمة إلى التوازن والتنمية، والتي تعتمد في الغالب على التنظيم السليم لتحركات، الفسفاتازات وتحلله من قبل شركة يو بي إس (نظام proteasome واليوبيكويتين). تحركات حررت هي في مركز الصدارة في العديد من أنواع السرطان وتورط في مجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 1. الجينوم البشري بترميز أكثر من 500 تحركات البروتينات التي تم ربطها بشكل مباشر أو غير مباشر، إلى ~ 400 الأمراض التي تصيب الإنسان 2. دعمت هذه الملاحظات مفهوم لاستهداف العلاجي للتحركات التي كتبها مثبطات جزيء صغير 3-5. قدمت مظاهرة من مثبطات كيناز ABL، مثل إيماتينب، في علاج سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) الدليل على مفهوم لهذا النهج 6،7. هذه الملاحظة ثورة ليس فقط النملةط-كيناز العلاج ولكن أيضا فرض فكرة التعرف على الآفات الوراثية في أمراض الأورام الأخرى لاستهداف العلاجية، والتي تؤدي إلى اكتشاف الطفرات أنكجنيك في JAK2 من كثرة الحمر فيرا (PV) والمرضى الذين يعانون من الأورام التكاثر النقيي (MPN). هذا الاكتشاف ولدت اهتماما كبيرا في علاج MPNs من خلال استهداف JAK2 مع مثبطات كيناز جزيء صغير. الآن، ما يقرب من اثني عشر من مثبطات JAK2 هي في التجارب السريرية واحد منهم قد وافقت مؤخرا لعلاج تليف النقي. بينما استهداف معين من تحركات أنكجنيك بواسطة مثبطات جزيء صغير في سرطانات تجلب نتائج واعدة، أنها تعاني أيضا من تطوير مقاومة للعلاج. في الواقع، حتى الآن، والمرضى تعامل مع مثبطات كيناز، مثل إيماتينب، Gefitinib، Erlotinib وDasatinib وضعت الطفرات المقاومة في الغالب من خلال الحصول على الطفرات في المجال كيناز التي تستهدف المخدرات 8-10. المقاومة نتيجة لطفرة جينية تسلط الضوء على القيود سو استهدفت حيد ضد تحركات أنكجنيك، وتمثل التحدي المقبل في تطوير أكثر نجاحا من أي وقت مضى العلاج الكيميائي للسرطان. يجب أن عواقب الميكانيكية والوظيفية للمقاومة المخدرات توفر الأساس المنطقي لاختيار وتصميم مركبات مجانية لتطوير الأدوية. الطفرات التي تم تحديدها عبر الشاشات في المختبر، وقد أظهرت درجة عالية من الارتباط مع تلك التي وجدت في المرضى. لذلك، في المختبر لفحص الطفرات التي تمنح المخدرات المقاومة لإعطاء أزواج الهدف المخدرات في تمريرات التطوير السريري أو قبل السريرية في تحديد أنماط المقاومة التي من المحتمل أن تسبب الانتكاس السريري. تحديد هذه الأشكال متحولة ليست فقط مفيدة في مراقبة المرضى عن الاستجابة للدواء والانتكاس ولكنها ضرورية أيضا لتصميم أكثر قوة مثبطات الجيل القادم. على سبيل المثال، وتطوير الجيل القادم مثبطات BCR / ABL، Nilotinib وPonatinib، أدلى ممكن وذلك بسبب زيادة MECاكتسبت تفاهمات hanistic من الطفرات، والبنائية، والدراسات وظيفية. في وقت سابق، ونحن قد أفادت نتائج الشاشة لدينا باستخدام الطفرات العشوائية من BCR / ABL للكشف عن الطيف من الطفرات التي تمنح مقاومة للمثبطات مثل إيماتينب 11،12، PD166326 12، وAP24163 13. النتائج ليس فقط تحديد الطفرات منح المقاومة والمرض السريري الانتكاس، ولكن قدمت أيضا فهم الآلية المقاومة للأدوية والمبادئ التي تحكم وظيفة كيناز 11،14. هنا نقدم التفاصيل المنهجي إضافي، وذلك باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، لتمكين تطبيق أوسع لهذه الاستراتيجية الفرز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

أدى اكتشاف BCR / ABL باعتباره الجين الورمي السائق في سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) في تطوير إيماتينب، والتي، في الواقع، أظهرت إمكانية استهداف كيناز في السرطانات عن طريق علاج فعال للمرضى CML. هذه الملاحظة ثورة في تطوير العقاقير لاستهداف تحركات أنكجنيك المتورطين في مختلف الأورام الخبيثة الأخرى، مثل EGFR، B-RAF، KIT وPDGFRs. ومع ذلك، عيب رئيسي واحد من العلاجات المضادة للكيناز هو ظهور الطفرات المقاومة للأدوية مما يجعل الهدف قد خفضت أو فقدت تقارب للدواء. فهم الآليات التي تستخدمها المتغيرات مقاومة لا يساعد فقط في تطوير مثبطات الجيل القادم ولكن أيضا يعطي دفعة لإدارة السريرية باستخدام الطب الشخصي. أبلغنا استراتيجية ناقلات فيروسات على أساس فحص لتحديد الطيف المقاومة منح الطفرات في BCR / ABL، الذي ساعد في تطوير الجيل القادم BCR / مثبطات ABL. باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، وهنا وصفنا في طرق الفحص في المختبر التي تستخدم خلايا الفأر BAF3 معربا عن مكتبة طفرة عشوائية من JAK2 كيناز.

ظهور الطفرات الوراثية يشكل تحديا كبيرا للعلاج استهدفت مكافحة كيناز. دراسات طفرية، إلى جانب توفير رؤى الميكانيكية والوظيفية التي هي مفيدة في اختيار وتصميم تطوير الأدوية من الجيل التالي، كما يسمح أفضل التدبير العلاجي السريري وربما في المستقبل سيكون أكثر فائدة للعلا?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

ظهور المقاومة الوراثية ضد العلاج كيناز المانع يشكل تحديا كبيرا لعلاج السرطان فعال. تحديد وتوصيف الطفرات المقاومة ضد المخدرات وضعت حديثا يساعد في تحسين إدارة السريرية وتصميم الأدوية الجيل القادم. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا في المختبر لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة.

وهناك طريقة لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة ضد كيناز مثبطات

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  ظهور المقاومة الوراثية ضد العلاج كيناز المانع يشكل تحديا كبيرا لعلاج السرطان فعال. تحديد وتوصيف الطفرات المقاومة ضد المخدرات وضعت حديثا يساعد في تحسين إدارة السريرية وتصميم الأدوية الجيل القادم. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا في المختبر لفح...

Video: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

الأسلوب MODS لتشخيص السل والسل المقاوم للأدوية المتعددة

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...