يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الانزعاجات في شبكات الإشارة التي يمكن أن تسبب نمو السرطان أو تطوير مقاومة علاجات محددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن توفر تغذية مرتدة سريعة وموثوقة على حالة الفوسفور من شبكات متعددة التي يتم تحريرها في كثير من الأحيان في السرطان. ويمتد تأثير هذه التقنية على علاج السرطانات المقاومة للأدوية لأن تحديد التعديلات والتعديلات اللاحقة للترجمة يمكن أن يوضح التغيرات في نشاط مسار تحويل الإشارات.
في حين أن هذه التقنية تستخدم في الفسفر، يمكن أيضا أن تستخدم للنظر في التعديلات الأخرى بعد الترجمة مثل جليكوسيل وجليكيتيشن. تبدأ بشطف الخلايا المستزرعة بين عشية وضحاها ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع الحرص على إزالة كل من برنامج تلفزيوني بعد الغسيل الماضي. بعد ذلك، إضافة الحجم المناسب من العازلة تحلل من مجموعة تحليل البروتين واستخدام مكشطة الخلية لفصل الخلايا.
اجرِدُ حل الخلية الناتجة 10 مرات تقريبًا قبل نقل مرة واحدة على الأقل إلى الخلايا السابعة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. ثم قم بتحميل الليسات إلى حقنة مجهزة بإبرة قياس 27 وpiratesate والاستغناء عن العينة 10 مرات لتهي أغشية الخلايا.
عندما أغشية الخلايا قد تعطلت تماما، الطرد المركزي وlysate ونقل sunatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر لتحديد كمية البروتين الكلي اللاحقة وفقا للبروتوكولات القياسية. لإجراء مقايسة فوسفوكيناز الإنسان، استخدم أولاً ملاقط مسطحة الشكل لوضع غشاء صفيف واحد في كل بئر من علبة متعددة الآبار تحتوي على ميليلترين من عازلة صفيف طازجة معدة واحدة في البئر مع أعداد الأغشية التي تواجه ما يصل. عند الغمر ، ستختفي الصبغة على الغشاء.
غطي الصينية بغطاء وحضن الأغشية على منصة هزازة شاكر لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الحضانة منع، تمييع كل عينة lysate إلى 50 إلى 100 ميكروغرام من تركيز البروتين في حجم أقصى 334 ميكرولترات من العازلة تحلل وجلب الحجم النهائي من عينة البروتين المستخرج تصل إلى 1.5 ملليلتر مع عازلة صفيف جديد. المقبل، بعناية الطامح العازلة صفيف من كل بئر من علبة متعددة واحتضان الأغشية مع 1.5 ملليلتر من عينة البروتين في جيدا بين عشية وضحاها في درجتين إلى ثماني درجات مئوية على شاكر منصة هزاز.
في صباح اليوم التالي، قم بنقل كل مجموعة بعناية إلى حاويات بلاستيكية فردية تحتوي على 20 ملليلترًا من عازل الغسيل لمدة ثلاث غسيلات لمدة 10 دقائق على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، إضافة 20 ميكرولترات من مناسبة تشكيلها كوكتيل الأجسام المضادة إلى مليلتر اثنين من العازلة صفيف، اثنين في بئر، وبعناية لطخة الحافة السفلى من كل غشاء على منشفة ورقية لإزالة أي العازلة غسل الزائدة. ثم ضع كل صفيف مرة أخرى في البئر المناسب من علبة الأجسام المضادة واغطي الصينية لاحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز.
في نهاية الحضانة، نقل بعناية كل مجموعة في حاوية بلاستيكية جديدة ثمانية من 11 سنتيمترا تحتوي على 20 ملليلتر من عازلة غسل لمدة ثلاثة 10 دقيقة يغسل كما أظهرت للتو. بعد الغسيل الأخير، أضف ملليلترًا واحدًا من محلول الفجل بيروكسيديز الحصان streptavidin المناسب لكل بئر من علبة الآبار المتعددة وارجع الأغشية إلى آبارها المناسبة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع كل غشاء بين قطعتين من ورقة تصفية خمسة ملليمتر لإزالة أي العازلة الزائدة واحتضان الأغشية المجففة مع حل الكشف عن بيروكسيديز الفجل الحصان المناسب لمدة ثلاث دقائق.
ثم ضع الأغشية في واقيات ورقة بلاستيكية واضحة فردية للتصوير اللاحق. لتقييم تعبير التيروزين كيناز المستقبلات في كل عينة، افتح الصور في برنامج مناسب لمعالجة الصور مثل Image J وحدد Edit وVert من القوائم المنسدلة المناسبة لعكس البقع السوداء على الخلفية البيضاء للصورة إلى بقع بيضاء على خلفية سوداء. بعد ذلك، استخدم الأداة البيضاوية لتطويق زوج واحد من النقاط البيضاء على لطخة النقطة وحدد تحليل وقياس لفتح نافذة جديدة تعرض القيم للمنطقة المحددة تلقائيًا.
ثم ضع نقطة سهم الماوس في وسط البيضاوي واسحب المنطقة الدائرية حول منطقة النقطة التالية حتى يتم قياس جميع النقاط ذات الاهتمام. في هذه التجربة التمثيلية، تم تحليل آثار مقاومة مثبطات التيروزين كيناز على مسارات نقل الإشارة في عنصر تحكم واحد في ثلاثة خطوط خلايا مقاومة مثبطات التيروزين كيناز. تم اختيار ستة بروتينات فوسفو مع نشاط تفاضلي وتم تحديد الكثافة النسبية للعديد من البروتينات المرشحة في كل خط خلية.
كما يتضح من خريطة الحرارة، يمكن بعد ذلك توليد قراءة شبه كمية للتغيرات في فوسفوريل البروتين من بروتينات تحويل الإشارة الهامة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تبدأ بالخلايا الصحية والتقسيم النشط لأن الضغوطات قد تحفز على تغييرات في نشاط مسار نقل الإشارة. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل PCR الرقمية و المناعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هل تؤدي التغييرات في الفسفر إلى تنشيط عوامل النسخ؟
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في بيولوجيا السرطان لاستكشاف التغييرات الأساسية في التعديل اللاحق للبروتينات مما يؤدي إلى ظهور دواء شخصي للمرضى المصابين بالسرطان. لا ننسى أن العمل مع خطوط الخلايا السرطانية هو خطير للغاية لذلك تأكد من استخدام تقنيات معقمة، والحذر عند التخلص من الحادة وارتداء معطف المختبر في جميع الأوقات.
