نموذج الطين cecal لتعفن الدم المتعدد الميكروبات هو أداة قوية لتشريح من فريدة من نوعها حديثي الولادة فيزيولوجيا المرض. يمكن أن يكون متغيرًا ، ولا يتم وصف نقاط النهاية الإنسانية بشكل جيد. هنا نقدم لدينا إجراء موحدة للغاية لإعداد الطين cecal وحقن في الحيوانات التجريبية.
وعلاوة على ذلك، نستخدم نهج البيانات المدفوعة لتحديد الجراء المحتضرة في أقرب وقت ممكن. لنبدأ بإعداد مخزون من الطين المجمدة cecal. ويتم ذلك عن طريق تجميع التشنج cecal من خمسة فئران الكبار على الأقل، وتعليق في الماء دكستروز العقيمة، وتخزينها في ناقص 80 للاستخدام في وقت لاحق.
يمكنك استخدام الذكور أو الإناث، ولكن يجب الحفاظ على جنس الفئران وعمرها وخلفيتها في تجاربك ثابتة. أولاً، لنعد أدواتنا للتشريح. وتشمل هذه مجموعة من مقص والملقط للجلد ومجموعة ثانية للأعضاء الداخلية.
بدوره على خرز الساخنة تعقيم 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تراجع الأدوات في 70٪ الإيثانول ومن ثم غمرها في خرز الساخنة تعقيم لمدة دقيقة واحدة على الأقل. رش حصيرة من المناشف الورقية مع الإيثانول 70٪ ، ثم إزالة الأدوات من التعقيم دون لمس الجزء المعقم من الأداة إلى مقابض غير معقمة من أدوات أخرى.
وضعها على منشفة ورقية لتهدئة. تشريح الفئران في خزانة السلامة البيولوجية. دبوس الساقين من الماوس إلى لوحة الستايروفوم باستخدام 23 الإبر قياس حتى الماوس هو البطن.
رش البطن مع 70٪ الإيثانول. باستخدام ملقط معقم ومقص، وقطع من خلال الجلد، وتخفيف الجلد من بطانة الصفاق مع مقص، وقطع فتح منطقة مستطيلة من الفخذ إلى القص والجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن. إزالة أي الفراء حول الصفاق.
التبديل إلى زوج جديد من الأدوات العقيمة لقطع من خلال الصفاق، مما يجعل أيضا فتحة مستطيلة. تحديد cecum، والتي ينبغي أن يكون تشغيل الجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن عبر الجسم. تعطيل النسيج الضام لتحديد فروع cecum من الأمعاء وقطع cecum بعيدا عن الأمعاء.
وضعه على ورقة معقمة من وزن ورقة. باستخدام أدوات عقيمة، وقطع من خلال طرفي cecum. عقد منتصف cecum مع ملقط واستخدام ملعقة معدنية مسطحة لدفع بلطف محتويات cecal من الغايات باستخدام حركة المتداول.
جمع المحتوى ووضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي وزنها قبل 15 ملليلتر. محتويات cecal بركة من خمسة فئران كحد أقصى في نفس الأنبوب. وزن الأنبوب مرة أخرى مرة واحدة وقد تم إضافة جميع المحتويات.
لحساب حجم الماء دكستروز لإضافة إلى محتويات cecal في كل أنبوب، وتقسيم وزن محتويات cecal في أنبوب من التركيز المطلوب في ملليغرام لكل ملليلتر. الحفاظ على aliquot من الماء dextrose على الجليد لإعادة تعليق محتويات cecal. إضافة الكمية المطلوبة من المياه dextrose إلى 15 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على محتويات cecal.
دوامة الأنبوب عموديا وأفقيا لمدة 30 ثانية تقريبا. مراقبة لوجود الجسيمات أكثر من بضعة ملليمترات في القطر، وإذا كان حاضرا، والاستمرار في دوامة حتى اختفت جميع الجسيمات بشكل واضح. ضع أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر على الجليد لجمع الترشيحات وتثبيت مصفاة خلية 70 ميكرومتر معقمة فوق القمة.
Pipette أربعة ملليلتر من الطين إعادة تعليق من أنبوب واحد 15 ملليلتر على مصفاة الخلية وإلى أنبوب جمع. إعادة تعليق الجسيمات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات. فقاعات البثق بلطف لزيادة سرعة التصفية مع اثارة محتويات مع تلميح ماصة حتى لا يكون هناك المزيد من السائل يجري تصفيتها.
هذا يجب أن يستغرق حوالي 30 ثانية. تغيير مصافي الخلايا بين كل أنبوب من الطين cecal، ولكن تجمع جميع المحتويات في نفس أنبوب جمع 50 ملليلتر. إذا كان المخزون الخاص بك يتجاوز 40 ملليلتر، ثم دوامة لمدة 15 ثانية، ووضع 20 ملليلتر في أنبوب جديد الطرد المركزي.
تقسيم الطين إلى قوارير التبريد من 500 ميكرولتر aliquots لكل من. دوامة الطين بين كل قوارير ثلاث. حافظ على المخزون الرئيسي في قارورة على الجليد.
عن طريق تخزين aliquots في ناقص 80، مستعمرة الهوائية تشكيل وحدة التركيز في إعداد الطين cecal لا يتغير على مدى فترة ستة أشهر. الآن بعد أن تم إعداد الطين cecal، يمكننا استخدامه لتحدي القمامة من الفئران من العمر سبعة إلى ثمانية أيام مع جرعة معدلة الوزن من الطين cecal. فتاك الطين يعتمد على الجرعة.
سيكون لديك لتحديد الجرعة القاتلة المطلوبة في مرفق الخاص بك لكل مخزون جديد مع جرعة جديدة المعايرة. يتم إعداد حقن الطين cecal واحد aliquot لكل القمامة. نحن تطبيع inoculum إلى حجم 100 ميكرولتر، التقريب إلى أقرب 10 ميكرولترات لكل في القمامة.
إعداد التحدي aliquot يتطلب ثلاث حسابات، وحجم مخزون الطين المطلوبة، وحجم إضافي من المياه دكستروز، وحجم مدورة لكل جرو في القمامة. يمكن الاطلاع على تفاصيل حول كيفية تنفيذ كل عملية حسابية في القسم الثالث من البروتوكول. تنفيذ هذه الحسابات باليد لكل تجربة يمكن أن يكون مضيعة للوقت وسوف تسهم في خطأ تجريبي، وبالتالي يمكن تحميل جدول البيانات جنبا إلى جنب مع البروتوكول حيث يمكنك إدخال تركيز الأسهم الخاصة بك، والجرعة المطلوبة، ووزن القمامة الخاصة بك، وكمية من مخزون الطين، وحجم المياه dextrose، ويتم إرجاع تلقائيا الحجم الفعلي لكل جرو.
يمكنك طباعة هذه الورقة وأخذها معك عندما تكون مستعدًا لتحدي حيواناتك. إعداد aliquot حقن في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية والاحتفاظ بها على الجليد. قبل تحميل الحقنة، اخلط أنبوب microcenterrifuge عن طريق الخفق 20 مرة.
يتم تحدي الجراء مع حقنة الأنسولين قياس 28. قبل رسم الطين، وخلط aliquot عن طريق الملهم وإخراج 300 إلى 500 ميكرولترات من aliquot التحدي داخل وخارج أنبوب microcentrifuge. ثم، رسم ما يقرب من 150 ميكرولترات من التحدي aliquot.
هذا ينبغي أن يكون أكبر من حجم الحقن لأي الجرو من العمر سبعة إلى ثمانية أيام. نفض الغبار في حقنة لطرد فقاعات من المكبس والسحب قليلا على حقنة لطرد أي فقاعات الهواء. لا تلمس الإبرة أو رمح المكبس خلال هذه العملية.
الاستغناء عن الطين cecal الزائدة مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge حتى يتم تحميل كمية محسوبة من الطين cecal للماوس في الحقنة. يتم إعطاء الطين Cecal مع حقن داخل الصفاق. قم بإجراء هذا وفقا للبروتوكول في مؤسسة رعاية الحيوان الخاصة بك.
لتقليل التسريبات، قم بإمالة الجرو إلى الأسفل وأدخل الإبرة بين الساق والأعضاء التناسلية، مع الحفاظ على الإبرة الضحلة وتحت الجلد. بعد إدخال الإبرة حوالي سنتيمتر واحد ، اضغط على الأسفل وإلى الأمام حتى تشعر بالإبرة تثقل الصفاق ، ثم اخفض ببطء المكبس. سحب بعناية الإبرة التالية نفس الطريق كما ذهبت في، والاسترخاء إصبعك الأوسط كما تفعل ذلك.
لاحظ أي تسرب في دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك والنظر في حذف الحيوانات مع تسرب كبيرة من النتيجة النهائية. في هذا القسم سوف نحدد مستويات مختلفة من الصحة التي نلاحظها في الفئران التي تحدى مع تعفن الدم متعدد الميكروبات ونقطة النهاية الإنسانية المقابلة. بالنسبة لأي إجراءات تشمل فئران حديثي الولادة، ننقل مواد الفراش إلى قفص جديد.
هذا ينقل رائحة السيدة على قفازاتك ويقلل من الضغط على السيدة من الدخول المتكرر إلى قفصها. نحن جعل عش ثان في القفص الجديد لعقد الجراء رصدها حتى نهاية الإجراء أو الرصد عندما تكون القمامة كلها جاهزة للعودة إلى قفص السيدة. ضع فأرة على ظهرها وراقب القدرة على الحق في غضون أربع ثوان.
إذا كان يمكن أن الحق، ثم الانتظار ثماني ثوان أخرى لتحديد مستوى التنقل. الماوس غير المطعون أو استرداد غالباً ما تكون قادرة على الحق واستكشاف بيئتها عن طريق اتخاذ خطوات متعددة في صف واحد. إعادة تجميع الفئران الذين هم قادرون على اليمين واتخاذ بضع خطوات لاستكشاف بيئتها كحقوق الخمول.
قد تسقط هذه الفئران أثناء اتخاذ خطوة وتبدو مهتزة على أقدامهم. الماوس الذي هو غير قادر على الحق وحركة الورك التي تتجاوز 90 درجة من الأفقي ونحن مجموعة كما تفشل في حق المحمول. هذا الماوس في نهاية المطاف الحق ولكن لا يمكن في غضون أربع ثوان.
بسبب حركات الورك، يتم تجميعها على أنها تفشل في حق المحمول. الجراء التي لم تتمكن من الحق ولها حركة الورك أقل من 90 درجة من الأفقي يتم تجميعها على أنها تفشل في الخمول الأيمن. وهذا مثال آخر على الفأرة التي لا تتجاوز أردافها 90 درجة من الأفقي ويتم تجميعها على أنها تفشل في الخمول الأيمن.
وسوف تفشل في الجرو غير المحمول الحق يكون الساقين التي قد تهتز أو تهتز ولكن ليس لديها حركة الورك. قد تمتد الأطراف وتتراجع ولكن لن يكون لها حركة الطرفين الجانبي. الجرو هو مرض واضح ووصلت إلى نقطة النهاية الإنسانية.
هذا مثال آخر على فشل الجرو غير المحمول الأيمن. الوركين لا يهز من اليسار إلى اليمين، ولكن الكفوف لا تهتز. عند التعامل مع قفص السيدة، يمكن سحب الجراء من العش إذا كانت سيدة التمريض يعمل.
نستبدل هذه ثم نتحقق من وجود الجراء المتناثرة الأخرى التي هي بعيدة عن عشها. إذا فشلت تلك الجراء المتناثرة في الخمول الأيمن ، فهي في نقطة نهاية إنسانية. هنا منحنى بقاء كابلان ماير من نموذج الإنتان لدينا.
ويمكن العثور على نقاط الرصد الزمنية في النظام اُستوبِل. في أي نقطة على طول منحنى البقاء على قيد الحياة إذا تم العثور على الماوس أن تفشل في عدم الحركة اليمنى، هو في نقطة النهاية الإنسانية والقتل الرحيم. بين 12 و 21 ساعة بعد التحدي، سوف الفئران تبدو مريضة وحوالي نصف الفئران سوف تكون قادرة على الحق على جانب واحد، في حين أن النصف الآخر تفشل الحق على أي من الجانبين.
هذا هو الإطار الزمني حيث الفئران سوف تبدأ في الاستطراد في درجة الصحة والوصول إلى نقطة النهاية الإنسانية من تفشل في عدم حق. هذه هي النتائج التمثيلية لعشرات الصحة لوحظ في هذا الإطار الزمني. ولا يمكن التمييز بين الناجين وغير الناجين في هذه المرحلة استناداً إلى درجاتهم الصحية.
في هذه المرحلة من المرض، 21 إلى 48 ساعة بعد التحدي، نلاحظ أعلى نسبة من النقاط النهائية الإنسانية. كما لاحظنا أن الغالبية العظمى من أي فئران غير قادرة على الحق على كلا الجانبين لن ينتهي بها المطاف بالتعافي من المرض، الذي يصبح بالتالي معايير جديدة لنقطة النهاية الإنسانية بالإضافة إلى الفشل في معايير عدم الحركة. وأسفرت النتائج الصحية التي لوحظت خلال هذه المرحلة من المرض عن فصل الناجين عن غير الناجين.
الغالبية العظمى من الفئران التي لم تكن قادرة على الحق على كلا الجانبين لم يتعافى من المرض. تدعم هذه البيانات أن المعايير الجديدة لنقطة النهاية الإنسانية التي تبدأ في 21 ساعة بعد التحدي يجب أن تكون القتل الرحيم لأي فئران تفشل في الحق على كلا الجانبين. على مدى 48 ساعة بعد التحدي العديد من الفئران سوف تبدأ في عرض المزيد من النشاط ومنعكس أفضل الحق.
على الرغم من أن نسبة النقاط النهائية الإنسانية أقل في هذه الفترة ، يمكن للفئران الاستطراد وتصبح أكثر مرضا ، وأنها لا تزال تتطلب الرصد لنقطة نهاية إنسانية. وخلال هذا الإطار الزمني، أظهرت بعض الفئران التي تم تجميعها في نهاية المطاف على أنها غير ناجية زيادة في النشاط في مرحلة ما ولكنها فعلت ما هو أسوأ في وقت لاحق ووصلت إلى نقطة نهاية إنسانية. وهذا يتطلب استمرار رصد الحيوانات المريضة مع زيادة وتيرة إذا بدأت في إظهار نتائج صحية أسوأ.
تم اختبار المجربين المستقلين الذين لم يتلقوا تدريبًا شخصيًا ويراقبون هذا الفيديو التعليمي فقط في قدرتهم على تعيين نفس النتيجة التي حصل عليها المحققون باستخدام مقاطع فيديو اختبار مسجلة. هذا الفيديو التعليمية النتائج في تصنيف سلوكي دقيق. تم تحديد القدرة على تعيين النتيجة الصحيحة للفشل في الفئران الوليدية غير المتحركة ، وهي مقياس لنقطة النهاية الإنسانية ، من أصل 60 فأرًا حديثي الولادة ، وتم تمييز 97٪ من السلوكيات بدقة ، مع عدم تحديد سوى 3٪ منها.
بعد ذلك، تم اختبار القدرة على التمييز بين الفئران حديثي الولادة التي فشلت في الحق أو التي كانت قادرة على الحق في غضون أربع ثوان. هذا هو مقياس آخر من نقطة النهاية الإنسانية وتم تعيينه بدقة في 97٪ من الفئران حديثي الولادة ، في حين تم تعيين 3٪ من الجراء بشكل غير صحيح كحق. هنا هي نتائج تمثيلية لتغيير الوزن في المئة من الفئران مقارنة مع وقت التحدي.
بدأ متوسط تغير الوزن بين الناجين وغير الناجين في الانفصال في 24 ساعة بعد التحدي، ولكن هناك الكثير من التداخل بين المجموعات. كان هناك بعض الناجين الذين فقدوا أكثر من 20٪ الوزن ولكن لا يزال يتعافى من المرض. ولم يكن تغير الوزن فعالاً في التنبؤ بالنتائج مقارنة بالاختلافات في الدرجات الصحية، وهذا هو السبب في أنه لا يستخدم كمعيار في تحديد ما إذا كانت الفئران في نقطة نهاية إنسانية.
في الختام، يجب أن تكون الآن قادرة على إعداد مخزون من الطين cecal المجمدة، وحساب الجرعة المعدلة الوزن. وحقن ورصد الفئران حديثي الولادة لنقاط النهاية الإنسانية. نأمل أن يكون هذا موردا قيما لأبحاث الماوس.
