فإن الكتاب أود أن أشكر جيمس Oesterling عن التدفق الخلوي المساعدة. وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الأمريكي الوطني للسرطان (R01-CA178380، ZY) ومنحة المعاهد الوطنية الأمريكية للتدريب ما بعد الدكتوراه (5T32CA009035-37، LWY).

وقد تم تنفيذ استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة مركز سرطان رعاية الحيوان واستخدام فوكس تشيس. 1. إعداد الآلات، حلول، وCoverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة مجموعتين من # 5 ملقط غرامة، مجموعة واحدة من رقم 7 ملقط المنحنية الجميلة، واحدة كبيرة مقص جراحي، مقص microdissecting واحدة، ملعقة واحدة وملعقة مثقوبة واحد. وضع الصكوك في الحقيبة التعقيم الختم الذاتي والأوتوكلاف. إبقاء الأدوات في الحقيبة حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3٪ درجة حرارة انصهار منخفضة الحل الاغاروز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 غرام الاغاروز في 50 مل من العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم وضع في الميكروويف والحرارة حتى تظهر فقاعات. وقد حل قارورة دوامة ويسخن حتى كل الاغاروز. مزيج حل مع بقضيب قبل التدفئة إذا ظهرت كتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن حل في 37 ° C حمام الماء لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لstorag على المدى الطويلالإلكترونية، وتخزين الحل الاغاروز لاستخدامها في المستقبل في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجة مئوية لمدة أشهر. يسخن في الميكروويف لتسييل. لتسخين المتكررة من الحل الاغاروز، وزن القارورة قبل تسخين للحفاظ على الوزن الأولي بالماء المقطر المعقم الدافئ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية للغراء التفكك القائم على خلية كما هو موضح سابقا 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والحل مع غراء غراء (100 U / مل)، السيستين (0.2 ملغ / مل) والدناز (250 U / مل) في الفينول الأحمر العقيمة التي تحتوي DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل مخاطاني البيض مع ألبومين المصل البقري (BSA و 8 ملغ / مل)، فول الصويا مثبط التربسين (8 ملغ / مل)) والدناز (250 U / مل) في العقيمة التي تحتوي على الفينول الأحمر DPBS. فلتر تعقيم كل من الحلول وضبط درجة الحموضة للعودة اللون الأصلي من الفينول التي تحتوي الأحمر DPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد وسائل الإعلام ثقافة الخلية (ملحوظة / B27): استكمال وسائل الاعلام القاعدية مع 1 ملي البيروفات الصوديوم، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين الستربتوميسين (P / S) وB27 الملحق. Filteص تعقيم وحماية من الضوء. تتوازن وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة FACS: 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في DPBS. إضافة 2.5 مل FBS إلى 47.5 مل DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بولي-D-يسين (PDL) coverslips -coated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف coverslips الزجاج جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف لل coverslips مع PDL (100 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم)، واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع الماء المقطر المعقم. يغسل مرة واحدة مع ملاحظة / B27 سائل الإعلام. دعونا coverslips تجف تماما في الأنسجة الثقافة غطاء محرك السيارة قبل استخدامها. </li></ol></li></ol> 2. تشريح وإعداد شرائح الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم تشريح، مسح أسفل منطقة تشريح مع الايثانول 70٪ والغطاء مع وسادة ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أدوات تشريح من الحقيبة التعقيم. إضافة الجليد الباردة، DPBS العقيمة / 1٪ P / S لطبق بيتري صغير ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس P4 Math1-GFP / Nestin-CFP الجراء الفأر مع مقص جراحي كبيرة ثم تمسك الرأس إلى أسفل مع ملقط المنحنية الجميلة. إزالة الجلد وقشر بلطف بعيدا الجمجمة مع # 5 ملقط غرامة ثم مغرفة من الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة وتحويلها إلى طبق بتري تحتوي DPBS / 1٪ P / S. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام # 5 ملقط غرامة، بعناية فصل المخيخ عن بقية الدماغ. تأكد من تشريح الجرو في وقت واحد في أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن 8 مخيخات من أجل الحصول على ما يكفي من NEPS للالتحليلات الجزيئية والوظيفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء القالب تضمين قياس 2 × 2 × 2 سم 3٪ مع انخفاض درجة حرارة انصهار الحل الاغاروز. تأكد من أن درجة حرارة الاغاروز لا تتجاوز 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل الزائد من المخيخ بواسطة اللمس بلطف على الأنسجة المختبر. وضع المخيخ في القالب في وضع عمودي. وضع القالب على الجليد لتمكينه من ترسيخ بسرعة. استخدام ~ 4 مخيخات لكل كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول لىأقسام الأنسجة فينج مع تهتز شفرة vibratome. تقليم التي تحتوي على مخيخات كتلة الاغاروز بشفرة حلاقة. الغراء كتلة agarose إلى لوحة vibratome مع مخيخات الموجهة في وضع عمودي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء علبة من vibratome مع الجليد الباردة DPBS العقيمة / 1٪ P / S ومكان تحت الجليد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 600 ميكرون من خلال أقسام طول كل من المخيخ. جمع المقاطع من علبة الجليد باستخدام ملعقة مثقوبة. أقسام مكان في طبق بتري مليئة DPBS / 1٪ P / S على الجليد. </li></ol></li></ol> 3. تسليخ مجهري والتفكك خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري تحتوي على شرائح الأنسجة تحت المجهر الفلورسنت تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بعناية EGL عن بقية القسم المخيخ باستخدام ملقط غرامة من قبل في تشريح بين CFP + طبقة الجزيئية وGFP + EGL (يرجى الرجوع إلى الخط المنقط في الشكل 1). كن حذرا حتى لا يتضمن أي جزء من طبقة الجزيئية، الأمر الذي سيؤدي فيتلوث، معربا عن Nestin بيرجمان الدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إتمام هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن والحفاظ على الأنسجة على الجليد لتجنب موت الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة المحيطة الاغاروز قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم الأنسجة EGL microdissected باستخدام بروتوكول القائم على غراء كما هو موضح سابقا 2 للحصول على تعليق خلية واحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا CFP إيجابية عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li></ol></li></ol> 4. خلية الفرز والتصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع خلايا لمضان CFP باستخدام معقم، وارتفاع سرعة تدفق عداد الكريات التي تحتوي على عامل تصفية الحراجية المناسبة وجمع الخلايا في المخزن FACS على الجليد. الحصول على ما يقرب من 100،000 NEPS من كل المخيخ P4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. استخدام خلايا فورا للتحليل الجزيئي أو ثقافة لمزيد من التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى خلايا الثقافة، واعادة تعليق الخلايا في مرحلة ما قبل تحسنت NB / B27 موالقانونين لوحة coverslips على PDL المغلفة كما سبق وصفه 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

طريقة تسليخ مجهري الموصوفة هنا هو الإجراء الأول قادرا على عزل السكان نقية من الخلايا الحية لاستخدامها في التحليلات الجزيئية والوظيفية. كما يتبين من لي وآخرون. 9، NEPS التي حصلت عليها هذه الطريقة يمكن تربيتها ودمجها في التجارب المختلفة وبسبب نقاء عالية...

يتكون المخيخ من طبقات خلايا متعددة، تحتوي على كل أنواع الخلايا متميزة. خلال التنمية، وEGL يحتوي المتكاثرة السلائف الحبيبية الخلايا العصبية (الناتج القومي الإجمالي) في حين أن طبقة طبقة الجزيئية والعصبية تحتوي على بيرجمان الدبقية والخلايا العصبية، على التوالي. في عمق المخيخ تكمن المادة البيضاء، والذي يحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) و oligodendrocytes 1. القنفذ الصوتي (شش) يلعب دورا حاسما في تنظيم وتطوير المخيخ على وجه الخصوص، أنه يعزز انتشار الناتج القومي الإجمالي عن طريق ملزمة لمستقبله مرقع (PTC)، منظم السلبي للشش يشير 2-4. تفعيل الشاذة من شش الإشارات يولد نخاعي (MB)، ورم خبيث في الدماغ الأكثر شيوعا في الأطفال 5،6. المؤسسة العامة للاتصالات MB متحولة نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات قوية لدراسة MB وتطوير الأورام تشبه MB 7،8 البشري. باستخدام هذهالفئران، تم اكتشاف أن الناتج القومي الإجمالي هي خلايا المنشأ للالقنفذ من نوع MB 7. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى الناتج القومي الإجمالي، حددنا مؤخرا السكان فريد من الأسلاف العصبية داخل EGL من المخيخ النامية التي يمكن أن تؤدي إلى MB. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من النوع السادس بروتين خيوط وسيطة، Nestin، وصفته NEPS 9. وتقع NEPS داخل الجزء العميق من EGL وجود عابر فقط خلال تطوير المخيخ الولدان. انهم ملتزمون النسب الخلية الحبيبية حيث الناتج القومي الإجمالي ولكنها متميزة كما هي هادئة ولا تعبر Math1، علامة راسخة لالناتج القومي الإجمالي التقليدية 10. بالإضافة إلى ذلك، NEPS تثير MB أكثر كفاءة من الناتج القومي الإجمالي بعد تفعيل شش 9 إشارات الطريق، مما يجعلها أصل الرواية لMB تكون الأورام. نحن معزولة سابقا NEPS من EGL المخيخ في يوم ما بعد الولادة 4 (P4) بواسطة تقنية تسليخ مجهريالموصوفة هنا 9. تسليخ مجهري عبر التصور المجهري المباشر من الأنسجة يسمح للتشريح محدد من EGL المخيخ. وهذا أمر ضروري كما يعبر Nestin أيضا NSCs في المادة البيضاء للدماغ وبيرجمان الدبقية في طبقة الجزيئية 1،7،11،12 وكان من الأهمية بمكان أن هذه الخلايا لم تدرج، لأنها نخلط التحليل. خلايا معزولة عن الأنسجة microdissected يمكن استخدامها على الفور للتحليل الجزيئي أو أنها يمكن تربيتها لمزيد من التطبيقات. للمساعدة في microdissecting تحديدا EGL، ومواصلة تنقية NEPS، وقد عبرت Math1-GFP (ببروتين أخضر) الفئران مع Nestin-CFP (سماوي البروتين الفلوري) الفئران. عامل النسخ يتم التعبير Math1 تحديدا من الناتج القومي الإجمالي وGFP التعبير مرئيا بوضوح في EGL 9،13. الفئران Nestin-CFP تعبر عن شكل النووي الحراجية ويمكن تصور بسهولة في طبقة الجزيئية 9،14. معا، وGFP CFP التعبير خلق الحدود للتسليخ مجهري من EGL (انظر الشكل 1). تم NEPS CFP إيجابية ثم عزل من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، في أعقاب تفكك الأنزيمية للEGLs تشريح. حاليا، الأسلوب الأكثر استخداما جيدا لعزل الخلايا من EGL هو Percoll الطرد المركزي التدرج من الأنسجة دماغ كامل 15،16. هذه الطريقة، ومع ذلك، غير قادر على أن تستبعد كليا السكان الخلية Nestin + من الطبقة الجزيئية والمادة البيضاء، وبالتالي لا يمكن استخدامها لدراسة NEPS. القبض على الليزر تسليخ مجهري، والذي يستخدم نقل طاقة الليزر لإزالة الخلايا من الفائدة، هو طريقة أخرى تستخدم لعزل خلايا معينة داخل الأنسجة غير المتجانسة 17،18 ولكن يمكن فقط أن تستخدم الخلايا والقبض لاسترداد DNA، RNA والبروتين وليس قادرة على أن تكون مثقف. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل وحيا، والسكان نقية من NEPS من EGL على وجه التحديد.ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لأنواع الأنسجة المختلفة التي إما بنية تشريحية أو التعرف fluorescently المسمى خلايا / المناطق. ولذلك، فإن الميزة الرئيسية لدمج هذه التقنية الجديدة في تسليخ مجهري بروتوكولات العزل الخلية أن الخلايا يمكن أن تكون معزولة من مناطق الأنسجة محددة للقضاء على تلوث الأنسجة المجاورة والخلايا يمكن جمعها فورا للتحليل أو مثقف لتطبيقات أخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="572">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Neurobasal media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PDL</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ultra pure low melting temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DPBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

تسليخ مجهري هو أسلوب الرواية التي يمكن عزل مناطق معينة من الأنسجة وإزالة التلوث من مصادر الخلوية في المناطق المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لأول مرة في دراسة Nestin، معربا عن الأسلاف (NEPS)، يبلغ عدد سكانها التي تم تشخيصها حديثا من الخلايا في الطبقة الخارجية للدماغ جرثومي (EGL). باستخدام تسليخ مجهري في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، تم جمع السكان نقية من NEPS بشكل منفصل عن التقليدية السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في EGL من تلويث وخلايا Nestin، معربا عن الأخرى في المخيخ. دون تسليخ مجهري، والتحليلات الوظيفية للNEPS لم يكن ممكنا مع الأساليب المتاحة حاليا، مثل التدرج Percoll الطرد المركزي والقبض على الليزر تسليخ مجهري. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية للاستخدام مع الأنسجة المختلفة التي تحتوي إما مناطق معروفة أو خلايا fluorescently المسمى. الأهم من ذلك، الميزة الرئيسية لهذا microdissectioن الأسلوب هو أن الخلايا المعزولة يعيشون ويمكن تربيتها لمزيد من التجارب، وهو حاليا غير ممكن مع الأساليب المذكورة الأخرى.

كما هو مبين في الشكل 1A، تم إعداد شرائح من دماغ P4 Math1-GFP / الفئران Nestin-CFP، الذي سيطر على EGL المخيخ من الناتج القومي الإجمالي، معربا عن GFP وإثراء طبقة الجزيئية الخلايا الدبقية CFP إيجابية. لعزل NEPS التي تقع في الجزء العميق من EGL، تم microdissected بين شرائح EGL وطبقة ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى للدماغ ويمكن تربيتها لمزيد من الدراسات.

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Views.  Temple University Health System.  الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى...

Video: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...