Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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著者らは、フローサイトメトリーの支援をジェームズOesterlingに感謝したいと思います。この研究は、米国国立がん研究所（R01-CA178380、ZY）および米国国立衛生研究所博士研究訓練助成金（5T32CA009035-37、LWY）からの助成金によってサポートされていました。

このプロトコルにおける動物の使用は、フォックスチェイスがんセンター動物実験委員会によって承認された手順に従って行われている。 楽器、ソリューション、およびカバーガラスの作製<ol><li> ＃5細かい鉗子のクリーン二組、＃7の1組の罰金、湾曲鉗子、一つの大きな外科はさみ、1 microdissectingはさみ、1へら一あきスプーン。セルフシール滅菌袋とオートクレーブ中で楽器を置きます。使用するまで袋に楽器を保管してください。 </li><li> 3％の低融点アガロース溶液を調製する。 <ol><li>気泡が出現するまで、電子レンジ、暑さの中に置くの滅菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）50ml中に1.5グラムのアガロースを追加します。スワールフラスコと再加熱すべてアガロースを溶解するまで。塊が現れた場合、加熱前に攪拌棒を備えたソリューションを混ぜる。 </li><li> 37℃の水浴に保管ソリューションまで、必要に応じ。 </li><li>長期的なSTORAG​​用E、カ月間室温または4℃で、将来の使用のためにアガロース溶液を格納します。液化するために、電子レンジで再加熱する。アガロース溶液を繰り返し加熱するために、温かい滅菌蒸留水との初期重量を維持するために加熱する前に、フラスコの重量を量る。 </li></ol></li><li>以前に2に記載されているように、パパインベースの細胞解離のために以下の手段を準備します。 <ol><li>赤含有DPBSを滅菌フェノールでパパイン（100 U / ml）を、システイン（0.2 mg / mlで）およびDNase（250 U / ml）でパパイン溶液。 </li><li>ウシ血清アルブミンとオボムコイド溶液（BSA; 8 mg / ml）を、大豆トリプシンインヒビター（8 mg / ml）で）およびDNase（250 U / ml）の滅菌フェノールレッドを含有するDPBS中。 フィルターは両方のソリューションを殺菌し、フェノールレッドを含有するDPBSの元の色を返すようにpHを調整する。 </li></ol></li><li>細胞培養培地（NB / B27）を調製：1 mMピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）及びB27サプリメントを基本培地を補う。 FilteR殺菌し、光から保護します。使用前に37℃で媒体を平衡化し、5％CO 2。 </li><li> FACS緩衝液を準備しDPBS中の5％ウシ胎児血清（FBS）を。 47.5ミリリットルのDPBSに2.5ミリリットルのFBSを追加します。 </li><li>ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされたカバースリップを準備します。 <ol><li>オートクレーブ新しいカバーガラス。 </li><li>コー​​トPDLとカバースリップ（滅菌蒸留水中に100μgの/ ml）を37℃で一晩または室温で2時間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、滅菌蒸留水を用いてカバースリップ。 NB / B27培地で一回洗浄する。カバースリップは使用前に、組織培養フード内で完全に乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 2解剖と組織スライスの調製<ol><li>解剖の日に、吸収パッドと、70％のエタノールとカバーで解剖領域を拭う。 </li><li>滅菌袋から解剖ツールを削除します。氷の上の小さなペトリ皿や場所に氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sを追加します。 </li><li>首を切るP4 のMath1-GF大手術用ハサミでP / ネスチン-CFPの仔マウスを微湾曲した鉗子で頭を押したままにします。皮膚を外し、静かにへらを使って頭蓋骨から脳をかき出すとDPBS / 1％P / Sを含むペトリ皿に移すし、＃5細かい鉗子で頭蓋骨をはがす。 <ol><li> ＃5細かい鉗子を使用して、慎重に脳の他の部分から小脳を分離する。可能な限り迅速に一度に一つの子犬を解剖してください。 </li><li>分子·機能解析のための十分なNEPのを得るために、8小脳の最小値を収集します。 </li></ol></li><li> 3％低融点アガロース溶液で2×2×2cmの埋め込み型を満たす。アガロースの温度はせいぜい37℃ではないことを確認してください。 </li><li>実験室の組織を軽くたたくことにより、小脳から余分な液体を除去します。縦位置で金型内に小脳を置きます。それはすぐに固化するできるように、氷の上に金型を配置します。ブロックあたり〜4小脳を使用してください。 </li><li>李を取得振動ブレードビブラトームを用いて組織切片をヴィング。かみそりの刃で小脳を含むアガロースブ​​ロックをトリミング。垂直位置に配向小脳でビブラトーム板にアガロースブ​​ロックを接着。 </li><li>氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sをビブラトームのトレイを記入し、下に氷を置く。 <ol><li>小脳の全長を通して600μmのセクションをカット。穴あきスプーンを使用して、製氷皿からの切片を収集します。氷上でDPBS / 1％P / Sで満たされたペトリ皿内の場所セクション。 </li></ol></li></ol> 3マイクロダイセクションおよび細胞解離<ol><li>蛍光解剖顕微鏡下で組織切片を含むペトリ皿を置きます。 <ol><li> CFP +分子層およびGFP + EGL（ 図1の点線を参照）との間での解剖による細かい鉗子を用いて小脳セクションの残りの部分からEGLを慎重に分離。になり、これ分子層の任意の部分を含まないように注意してくださいネスチン発現バーグマングリアの汚染。 </li><li>可能な限り迅速に、この手順を完了し、細胞死を回避するために、氷上で組織を維持する。 </li><li>次のステップに進む前に、周囲の組織アガロースを削除します。 </li></ol></li><li>以前に、単一細胞懸濁液を得るために、2に記載のようにパパインベースのプロトコルを使用して顕微解剖EGL組織を消化する。 <ol><li>再懸濁FACSを介して、CFP-陽性細胞の収集のためのFACS緩衝液で細胞を。 </li></ol></li></ol> 4。セルソーティングおよびめっき<ol><li>適切なCFPフィルターを含む滅菌、高速フローサイトメーターを使用して、CFP蛍光のソート細胞と氷上で、FACS緩衝液で細胞を集める。各P4小脳からの約10万のNEPを取得します。 </li><li> 5分間300×gで遠心分離した細胞。さらなる実験のための分子解析や培養のために、すぐに細胞を使用してください。 </li><li>培養細胞に、予め温めておいたNB / B27 mの細胞を再懸濁以前に2に記載されているように、PDLコーティングしたカバーガラス上EDIAとプレート。 </li></ol>

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	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. 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M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. 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著者らは、開示することは何もない。

ここで説明顕微解剖法は、分子的および機能的分析において使用するための生細胞の純粋な集団を単離することができる最初の手順である。 Li ら9によって実証されるように、 この方法で得られたのNEPを培養し、各種実験に組み込むことができ、その高い純度で、マイクロアレイ分析のためにも使用することができる。 これは顕微解剖技術に習熟?...

小脳は、それぞれが異なる細胞型を含む、複数の細胞層から構成されている。開発中は、EGLは分子層とプルキンエ層はそれぞれ、バーグマングリアとプルキンエニューロンを含み、一方顆粒ニューロン前駆体（のGNP）が増殖して含まれています。小脳内のディープは、神経幹細胞（NSC）およびオリゴデンドロサイト1が含まれている白質を、ある。 ソニックヘッジホッグ（Shhが）小脳発生の調節において重要な役割を果たしており、特に、パッチが適用その受容体（PTC）、Shhの2-4シグナルの負の調節因子への結合を介してのGNPの増殖を促進する。 Shhシグナル伝達の異常な活性化は、髄芽腫（MB）、小児5,6で最も一般的な悪性脳腫瘍を生成します。 PTCミュータントMBトランスジェニックマウスモデルは、MBの研究のための強力なツールであり、人間のMB 7,8に似た腫瘍を発症。これらを使用したマウスは、それがのGNPはハリネズミ型MB 7起源の細胞であることが発見された。さらに、のG​​NPに加えて、私たちは最近、またMBを生じさせることができる開発する小脳のEGL内の神経前駆細胞のユニークな集団を同定した。これらの細胞は、タイプVIの中間フィラメントタンパク質、ネスチンを高レベルで発現し、9のNEPと呼ばれる。のNEPは、EGLの深部内に配置され、唯一の新生児小脳の開発中に一過的に存在している。彼らはのGNPのような顆粒細胞系譜にコミットしますが、彼 ​​らは静止状態にしてのMath1、従来のGNP 10のためのよく確立されたマーカーを発現しないように区別されます。さらに、NEPのは彼らMBの腫瘍形成のための新規の原点になりShhのシグナル伝達経路9、起動後のMBの上昇よりも効率的にのGNPを与える。 私たちは、以前に顕微解剖技術によって生後4日目（P4）での小脳のEGLからのNEPを隔離ここで9について説明した。組織の直接顕微鏡可視化を介したマイクロダイセクションは、小脳のEGLの特定の解剖を可能にします。ネスチンはまた、分子層1,7,11,12に小脳白質中のNSCによってとバーグマングリアによって発現し、それは彼らが分析を混乱さと同じように、これらの細胞は、含まれていないことが非常に重要でしているように、これが必要です。顕微解剖組織から単離された細胞は、分子分析のために直ちに使用することができ、またはそれらは、さらなる用途のために培養することができる。 具体的にはEGLをmicrodissectingにおいて補助するために、さらなるのNEPを精製する、 のMath1-GFP（緑色蛍光タンパク質）マウスは、 ネスチン-CFP（シアン蛍光タンパク質）マウスと交配した。 Math1または特異的のGNP及びGFPの発現によって発現される転写因子は、EGL 9,13においてはっきりと見える。 ネスチン-CFPマウスはCFPの核型を発現し、容易に分子層9,14に視覚化することができる。一緒に、GFPとCFP式がEGLのマイクロダイセクションのための境界を作成します（ 図1を参照）。 CFP陽性のNEPは、その後解剖しEGLsの酵素的解離に続いて、FACSによって単離した。 現在、EGLから細胞を単離するための最もよく利用される方法は、全小脳組織15,16のパーコール勾配遠心分離である。しかし、この方法は、完全に分子層と白質のネスチン+細胞集団を除外することができないのでのNEPの研究のために使用することができない。関心のある細胞を除去するためにレーザエネルギーの転送を利用するレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、異種の組織17,18内の特定の細胞を単離するために使用されるが、捕捉された細胞のみがDNA、RNAおよびタンパク質の回収のために使用されないことができる別の方法である培養することができるように。 このプロトコルは、具体的には、EGLからのNEPの生きている、純粋な集団を単離する方法を提供します。この技術は、認識可能な解剖学的アーキテクチャまたは蛍光標識された細胞/領域のいずれかを有する異なる組織タイプに適用することができる。したがって、細胞単離プロトコールにこの新規顕微解剖技術を組み込むの主な利点は、細胞が隣接する組織を汚染除去するために、特定の組織領域から単離することができ、細胞は、他のアプリケーションの分析または培養のためにすぐに収集することができることである。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

顕微解剖は、組織の特定の領域を分離し、隣接領域における細胞源からの汚染を排除することができる新規な技術である。この方法は、最初にネスチン発現前駆細胞（のNEP）の研究では、小脳の外部胚層（EGL）内の細胞の新たに同定された集団において利用した。蛍光活性化細胞分類（FACS）と組み合わせてマイクロダイセクションを使用して、のNEPの純粋な集団は、小脳におけるEGLにおける従来の顆粒神経細胞前駆体から及び他の汚染ネスチン発現細胞とは別に収集した。マイクロダイセクションがなければ、のNEPの機能解析は、パーコール勾配遠心分離およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとして利用可能な現在の方法では不可能でした。この技術は、認識可能な領域または蛍光標識された細胞のいずれかを含むさまざまな組織との使用のために適用することができる。最も重要なことは、このmicrodissectioの主な利点n個の技術は、単離された細胞が生きていると、他に記載された方法で、現在は不可能であるさらなる実験のために培養することができるということです。

図1Aに示すように、小脳スライスは小脳EGLは、GFP発現のGNPによって支配された分子層がCFP陽性グリア細胞によって濃縮された、P4 のMath1-GFP / ネスチン-CFPマウスから調製した。 （; 図1A点線に沿って）EGLの深部に位置しているのNEPを単離するために、スライスは、EGLと分子層の間に顕微解剖された。解剖EGLs（ 図1B）は、次いで、FACS続い酵素?...

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

ネスチン発現前駆細胞は、発展途上小脳における神経前駆細胞の新たに同定された集団である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてここで示さ顕微解剖技術を用いて、この細胞集団は、他の小脳領域から汚染を含んでいない精製することができ、さらなる研究のために培養することができる。

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K ビュー.  Temple University Health System. ネスチン発現前駆細胞は、発展途上小脳における神経前駆細胞の新たに同定された集団である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてここで示さ顕微解剖技術を用いて、この細胞集団は、他の小脳領域から汚染を含んでいない精製することができ、さらなる研究のために培養することができる。 

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

発生生物学

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

生物学

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

免疫・感染学

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

神経科学

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

分子解析のための小脳局所解剖

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

マウス初代小脳顆粒ニューロンの単離と培養

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

出生後マウス小脳からの幹細胞の単離と神経細胞への分化

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...