ونحن ممتنون لأوستن فيرو وجواو غيليرمي روزا في مختبر سفيتانوفيتش لمساعدتهم في استكشاف الأخطاء وإصلاحها تشريح وفي استخراج الجيش الملكي النيبالي وRTqPCR. يتم تمويل هذا البحث من قبل M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS المعاهد الوطنية للصحة (NIH).

1. الإعداد
<ol><li>جمع المعدات اللازمة بما في ذلك مقص قطع الرأس، ملقط حادة، مقص تشريح، مقص الأوعية الدموية، microspatula، مصفوفة الدماغ الماوس القوس، شفرات الحلاقة، نصائح الأنابيب 200 ميكرولتر، طبق بيتري الزجاج، والانزلاق الزجاجي، ودلو الثلج. وضع جميع المعدات على لوحة ماصة.</li>
	<li>ضع طبق بتري، لوحة زجاجية، ومصفوفة الدماغ على الجليد.</li>
	<li>باستخدام شفرة حلاقة بزاوية عمودية، قم بتقليم حوالي 5 مم من طرف طرف أنبوبي واحد سعة 200 ميكرولتر. وهذا يجعل حجم الفتحة في نهاية الطرف حوالي 1 ملم. وينبغي أن يكون هذا كافيا لكمة خارج DCN. ولكن يمكن أيضا تعديل هذا حسب الحاجة اعتمادا على تشريح. لديك العديد من النصائح جاهزة لسهولة الاستبدال والتكيف.</li>
	<li>تسمية 1.5 مل أنابيب الميكروفون مع تحديد هوية الحيوان ومنطقة المخيخ (أربعة أنابيب لكل حيوان).</li>
	<li>ملء حاوية cryosafe مع النيتروجين السائل لوميض تجميد الأنسجة بعد الاستخراج.</li>
</ol>2. استخراج الدماغ وتشريح
وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجان رعاية الحيوان في جامعة مينيسوتا.
<ol><li>القتل الرحيم الماوس باستخدام التعرض 5٪ CO2. بمجرد توقف التنفس، قم بإجراء خلع عنق الرحم. قطع رأس الفأر بمقص قطع الرأس والتخلص من الذبيحة في الوعاء المناسب.</li>
	<li>إجراء شق مع شفرة حلاقة على طول خط القوس الوتوسطي من الرأس بدءا من الأنف والاستمرار على طول الطريق مرة أخرى. فصل الجلد، فراق إلى جانبي خط الوسط. استخدام شفرة الحلاقة لقطع العضلات على كل جانب، وقطع الماضي قنوات الأذن.</li>
	<li>باستخدام مقص تشريح، تقليم أي مناطق الحبل الشوكي، حتى حيث جذع الدماغ يلتقي المخيخ، والحرص على عدم الإضرار المخيخ.</li>
	<li>أدخل إحدى شفرات مقص الأوعية الدموية في المسافة بين جذع الدماغ والعمود الفقري وقطع نحو قناة الأذن، ورفع على مقص لقطع العظام نظيفة ولكن الحد من الأضرار التي لحقت الأنسجة.</li>
	<li>الاستمرار في قطع على طول حافة الجمجمة حتى نحو المصابيح الشمية، والاستمرار في رفع في حين قطع للحد من الأضرار التي لحقت أنسجة الدماغ.</li>
	<li>باستخدام ملقط حاد، قشر بلطف قبالة الجزء الخلفي من الجمجمة الكشف عن المنطقة الخلفية من الدماغ والمخيخ.</li>
	<li>باستخدام ملقط حاد على طول حافة الجمجمة التي تم قطعها للتو، قشر بقية الجمجمة صعودا وأكثر من الدماغ. هذه الخطوة يجب أن تزيل غالبية غطاء الجمجمة، وتكشف عن الدماغ.</li>
	<li>تقليم بقية الجمجمة مع مقص الأوعية الدموية والملقط حادة، وتطهير معظم الجمجمة من أعلى الدماغ.</li>
	<li>باستخدام ميكروسباتولا، رفع الدماغ قليلا ومغرفة تحت والانزلاق لإزالة المصابيح الشمية من الجمجمة المتبقية وقطع ألياف المسالك البصرية. الدماغ يجب أن يأتي مجانا بسهولة في هذه المرحلة.</li>
	<li>ضع الدماغ في طبق بيتري الجالس على الجليد وأزل أي جمجمة متبقية أو حطام آخر.</li>
	<li>باستخدام ميكروسباتولا، ضع الدماغ بلطف في مصفوفة الدماغ مع الجانب الظهري لأعلى. يستغرق وقتا طويلا للتأكد من أنه يتم تعيين مستوى في المصفوفة، وخاصة أن خط الوسط يقع مركز في المصفوفة. تم تصميم هذه المصفوفة لأنسجة الدماغ الماوس الكبار، والأنسجة من الحيوانات الأصغر سنا أو المريضة قد بقية أقل في المصفوفة ولكن ينبغي أن يكون لا يزال من الممكن تحقيق نتائج قابلة للاستنساخ عبر العينات.</li>
	<li>ضع شفرة حلاقة واحدة على طول خط الوسط القوسي ، مع التأكد من أن النصل يدفع على طول الطريق إلى أسفل المصفوفة(الشكل 1B).</li>
	<li>ضع شفرة حلاقة أخرى 1 مم إلى جانب النصل الأول(الشكل 1B). ضع نصلين آخرين 1 مم بعيدا عن بعضهما البعض. وينبغي أن تكون النتيجة النهائية ثلاثة شفرات وضعت على جانب واحد من الدماغ، وكلها 1mm بعيدا. افعل نفس الشيء مع الجانب الآخر. في المجموع، سيتم وضع 7 ريش 1mm بعيدا (الشكل 1C).</li>
	<li>بعناية، والاستيلاء على طرفي الأمامية والخلفية من شفرات الحلاقة ورفع مباشرة حتى من المصفوفة. يمكن التخلص من الأنسجة على السطح الخارجي لشفرات الحلاقة.</li>
	<li>ببطء، فصل شفرة حلاقة واحدة في وقت واحد من الآخرين، مع الحرص على عدم تلف أقسام الأنسجة.</li>
	<li>الشريحة بعناية قسم الأنسجة الخروج من شفرة الحلاقة وعلى الشريحة الزجاجية مع ميكروسباتولا. في المجموع سيكون هناك ستة أقسام الدماغ القوس(الشكل 1D).</li>
	<li>سيكون للأقسام الجانبية 4 DCN مرئية (مربع أرجواني الشكل 1D). لعزل DCN، عقد قلصت 200 ميكرولتر ماصة تلميح عموديا على DCN ودفع إلى أسفل من خلال الأنسجة بحزم، هزاز في جميع الاتجاهات لتشريح كامل DCN من الأنسجة المحيطة بها. ارفعه مباشرة إلى الأعلى لإزالة DCN بشكل نظيف ، وتأكد بصريا من وجود الأنسجة في الطرف.</li>
	<li>ضع إصبعا واحدا في الجزء العلوي من الطرف وادفع لأسفل ، مما تسبب في انتفاخ الأنسجة. ضع الطرف في أنبوب الميكروفوغ المسمى بشكل صحيح وتأكد من وضع لكمة الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. كرر 2.17 للأقسام الثلاثة المتبقية ، ووضع اللكمات DCN في نفس الأنبوب. وضع أنبوب في النيتروجين السائل لتجميد فلاش. تمثيل حجم كل لكمة في الشكل 1E.</li>
	<li>الأقسام التي استخرجت DCN مؤهلة لنصف الكرة المخيخ. أبعد بقية أنسجة الدماغ حول المخيخ في هذه الأقسام. استخدام ملقط حاد والتقاط بلطف هذه المقاطع قشرة المخيخ نصف الكرة الأرضية ومكان في أنبوب الميكروفونكل منها. تجميد فلاش.</li>
	<li>لآخر قسمين فيرمال (مربع أزرق فاتح، Figure1D)،دفع بعيدا أنسجة الدماغ المحيطة ترك المخيخ فقط. باستخدام شفرة حلاقة، وجعل قطع فصل المصابيح الأمامية من lobules الخلفي. يجب أن يكون قطع فقط بعد تشكيل lobule 6 وينبغي أن لا تشمل lobule 10(الشكل 1F).</li>
	<li>باستخدام ملقط حاد، ضع بعناية أقسام قشرة المخيخ الأمامية وأقسام قشرة المخيخ الخلفية في أنابيب الميكروفون الخاصة بهم وتجميد الفلاش عن طريق ترك الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق. من هنا المضي قدما لاستخراج الحمض النووي الريبي، أو قد تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.</li>
</ol>3. استخراج الحمض النووي الريبي 
ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول كولد سبرينغ هاربور لاستخراج الحمض النووي الريبي مع TRIzol20. TRIzol solubilizes المواد البيولوجية، مما يجعل من الممكن لاستخراج الحمض النووي الريبي.
<ol><li>ضع أنابيب الميكروفون في الثلج للحفاظ على الأنسجة من ذوبان بسرعة كبيرة جدا، وتطبيق 150 ميكرولتر من TRIzol الباردة في أنبوب microfuge. تجانس مع الحشرات المعقمة. مرة واحدة يتم تجانس الأنسجة، pipet الحل صعودا وهبوطا لضمان عدم وجود الأنسجة المتبقية سليمة. مزيد من تفريق أي قطع الأنسجة الصغيرة عن طريق سحب ما يصل الى حقنة الأنسولين عدة مرات.</li>
	<li>إضافة أخرى 350 ميكرولتر من TRIzol وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. اسمحوا الجلوس في درجة الحرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنبوب ويهز بقوة ثم ترك بقية لمدة 2-3 دقائق. يفصل الكلوروفورم محلول الأنسجة المتجانسة إلى مراحل (الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين).</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g، عند 15 درجة مئوية، لمدة 10 دقائق. تأكد من أن جميع الأنابيب في نفس الاتجاه.</li>
	<li>قم بإزالة الأنابيب بعناية وحدد درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. إزالة فقط مرحلة مائي واضح في أنبوب جديد (وهذا هو الجيش الملكي النيبالي)، والحرص على عدم تعطيل interphase مبهمة (الحمض النووي).  وستكون المرحلة الأدنى حمراء وتحتوي على البروتين. يمكن حفظ المحلول المتبقي في الأنابيب أو التخلص منه.</li>
	<li>إضافة الكحول isopropyl 100٪ بنسبة 1:2 (إذا أزيلت 200 ul من المرحلة المائية، إضافة 100 ميكرولتر من الكحول isopropyl). تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. اترك الراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. الكحول isopropyl يعجل الجيش الملكي النيبالي للخروج من الحل.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g، عند 4°C، لمدة 10 دقائق. تأكد من وضع جميع الأنابيب في نفس الاتجاه لتسهيل تصور بيليه. وسوف تكون بيليه الناتجة عن الحمض النووي الريبي المستخرج.</li>
	<li>إزالة بعناية الأنابيب، وإزالة supernatant مع pipet الحرص على عدم تعطيل بيليه. بيليه هو هلام إلى حد ما مثل وسيكون من الصعب أن نرى، ولكن ينبغي أن تكون قادرة على تقدير حيث يستند إلى اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي.</li>
	<li>بعد إزالة كل من supernatant، إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول 75٪، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي في 7500 x ز، في 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. الايثانول يغسل كذلك بيليه.</li>
	<li>إزالة supernatant بعناية، دون تعطيل بيليه. اترك القبعات مفتوحة لتجفيف العينة. هذا عادة ما يستغرق 5-10 دقائق ولكن يمكن أن تختلف تبعا لكمية الإيثانول تركت على بيليه. لا أكثر من الجافة.</li>
	<li>مرة واحدة جافة، resuspend بيليه في المياه الحرة DNase. إضافة 20 ميكرولتر لعينات DCN، و 30 ميكرولتر لجميع الآخرين.</li>
	<li>وبمجرد إعادة الإنفاق، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو الشروع في إجراء المزيد من الاختبارات.</li>
</ol>4. في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (RTqPCR)
<ol><li>قبل هذه الخطوة سيكون من الضروري أن DNase علاج الحمض النووي الريبي لإزالة أي الحمض النووي الجينوم، وتوليد cDNA باستخدام iScript من BioRad. تأكد من تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي قبل إجراء cDNA. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تحسين التمهيديات لqPCR. اتبع الطرق الموضحة هنا لإكمال هذه الخطوة21. وصف موجز لqPCR أدناه.</li>
	<li>يتم شراء جميع التمهيديات من IDT. التسلسلات الأمامية والعكسية كلاهما في نفس أنبوب العينة، ويتم تخزينهما بتركيز 20x. Rps18 (جين التحكم): إلى الأمام – 5'-CCTGAGAGCCAGCACAT-3' عكس – 5'-أكاكاكاتغاغكاتاكتكتيك-3' بارفالبومين (بروتين ملزم للكالسيوم، خلايا مثبطة): إلى الأمام – '5-ATGAGGTGAAGAGGTTCC-3' عكس – '5-AGCGTCTTTGTTTCTCTGCAG-3' Kcng4 (وحدة فرعية قناة البوتاسيوم): إلى الأمام – 5'-CTGTCTTCTCTGGTCAGTGA-3' عكس – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' ألدولاس C (زيبرين الثاني، أعرب عن التفاضلية عبر قشرة المخيخ): إلى الأمام – 5'-AGAGAACAAGغاكتغ-3' عكس – 5'-TCAGTAGGCATGGGGC-3'</li>
	<li>وكانت شروط qPCR كما يلي. فترة ما قبل الحضانة، 5 دقائق، عند 95 درجة مئوية. فترة التضخيم، 50 دورة: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية، 10 دقائق عند 62 درجة مئوية، و 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. فترة منحنى الذوبان، 5 ثوان عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية، وتعيين معدل المنحدر إلى 0.07 درجة مئوية/ ثانية حتى درجة الحرارة المستهدفة من 97 درجة مئوية. ثم فترة التبريد لمدة 10 دقائق إلى 40 درجة مئوية.  تم إجراء جميع ردود فعل qPCR في ثلاثية القنوات وتم تحليل التعبير الجيني باستخدام 2- ΔΔCt مع Rps18 كتحكم في التحميل لتطبيع التعبير الجيني. تم استخدام مستخلص المخيخ السائب كمرجع.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

الطريقة الموصوفة هنا تجعل من الممكن تقييم التعبير الجيني الأساسي والآليات الجزيئية داخل أربع مناطق مخيخ متميزة - النوى المخيخية العميقة (DCN) ، والقشرة المخيخية الأمامية للفيرميس (CCaV) ، والقشرة المخيخية الخلفية للفيرميس (CCpV) ، والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH). إن القدرة على تقييم هذ?...

المخيخ يحتوي على أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ، وقد تاريخيا يشار إليها باسم مركز التحكم في المحركات والتوازن في الدماغ1. في الآونة الأخيرة ، أثبتت الدراسات أن المخيخ يلعب دورا رئيسيا في وظائف أخرى مختلفة بما في ذلك الإدراك ، ومعالجة المكافأة ، وتؤثر على2و3و4و5.
المخيخ لديه تشريح موصوف جيدا: تتكون منطقة القشرة من حبيبات وبوركينجي وطبقات جزيئية. تشكل خلايا الحبيبات طبقة الخلية الحبيبية وترسل مدخلات عبر ألياف متوازية إلى تشعبات خلايا بوركينجي للطبقة الجزيئية التي تتلقى أيضا مدخلات من ألياف التسلق التي نشأت في الزيتون السفلي. ترسل خلايا بوركينجي إسقاطات مثبطة إلى الخلايا في نواة المخيخ العميقة (DCN) ، والتي تعمل كخرج رئيسي من المخيخ. يتم تعديل إخراج هذه الدائرة المخيخية من خلال نشاط الخلايا الداخلية المثبطة في قشرة المخيخ ، بما في ذلك Golgi و stellate و خلايا السلة4. يتم توزيع هذه الوحدة الوظيفية المخيخ في جميع أنحاء lobules من قشرة المخيخ. على الرغم من هذه الدوائر موحدة نسبيا عبر المخيخ, الأدلة من الأدب التصوير العصبي البشري ودراسات المريض يشير إلى عدم التجانس الوظيفي للميخيخ6,7.
يمكن تقسيم قشرة المخيخ إلى منطقتين رئيسيتين: الحشرات المحددة في منتصف الخط، ونصفي الكرة الأرضية الجانبيين. يمكن تقسيم الحشرات إلى مصابيح الأمامي والخلفي. وقد تورطت هذه المناطق المتميزة من المخيخ في المساهمة في سلوكيات مختلفة. أنماط النشاط التي تثيرها المهام أو الخالية من المهام تورط فيها أن المناطق الأمامية من الحشرات تساهم بشكل أكبر في الوظيفة الحركية في حين تساهم الحشرات الخلفية بشكل أكبر في الإدراك6 ،7. ويرتبط أيضا مع vermis تؤثر والعواطف، في حين أن نصفي المخيخ تسهم في التنفيذية والبصرية المكانية واللغة، وغيرها من الوظائف الذاكرية8. بالإضافة إلى ذلك، قدمت الدراسات التشريحية أدلة على أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا ترتبط بالمناطق القشرية المختلفة9. كشف رسم خرائط أعراض الآفة أن المرضى الذين يعانون من السكتات الدماغية التي تؤثر على الفص الأمامي (تمتد إلى lobule VI) كان أداؤهم ضعيفا في المهام الحركية الدقيقة ، في حين أظهر المرضى الذين يعانون من تلف في مناطق الفص الخلفي ونصفي الكرة الأرضية عجزا معرفيا في غياب متلازمة المخيخ الحركي10. وأخيرا ، تشير أمراض المخيخ الإقليمية في المرض إلى أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا معرضة أيضا بشكل مختلف للمرض11و12.
في حين أن أقل بكثير استكشافها، والأدلة الأولية يدل على توقيعات التعبير الجيني متميزة عبر المناطق القشرية المخيخية. Purkinje تعبير الخلية من زيبرين الثاني يظهر نمط المنطقة محددة في vermis بحيث يكون هناك المزيد من الخلايا الإيجابية زيبريني الثاني في lobules الخلفي وأقل في lobulesالأمامية 13. ويرتبط هذا أيضا مع وظيفة الفسيولوجية متميزة إقليميا كما Zebrin II خلايا بوركينجي السلبية عرض وتيرة أعلى من إطلاق منشط من خلايا بوركينجي التي هي زيبرين الثانيإيجابية 14.
بالإضافة إلى قشرة المخيخ ، يتضمن المخيخ نواة المخيخ العميقة (DCN) التي تعمل كخرج أساسي للميخيخ. تتكون النوى من الوسيط (MN) ، المتشابكة (IN) ، والنوى الجانبية (LN). وقد أظهرت دراسات التصوير الوظيفي والمريض أن DCN تشارك أيضا في السلوكيات المختلفة15، ولكن دراسات قليلة جدا دراسة تغيير التعبير الجيني في DCN.
جعلت التقدم في التقنيات الجزيئية من الممكن تقييم التعبير الجيني الإقليمي في الدماغ وكشفت عن عدم التجانس عبر وداخل مناطق الدماغ المختلفة في كل من الحالات الفسيولوجيةوالمرضية 16. مثل هذه الدراسات تورط أن المخيخ يختلف عن مناطق الدماغ الأخرى. على سبيل المثال، يتم عكس نسبة الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في المخيخ مقارنة مع مناطق الدماغ الأخرى1. حتى في الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم تنظيم التعبير عن الجينات proinflammatory في المخيخ مقارنة بالمناطق الدماغية الأخرى17. كما كانت التقنيات الجزيئية مفيدة للغاية في تحديد المسارات التي تساهم في مسببات أمراض المخيخ. على سبيل المثال، حدد تسلسل الحمض النووي الريبي لمستخلصات المخيخ بأكملها الجينات التي تم تغييرها في نموذج فأرة معدل وراثيا محدد لخلية بوركينجي من نوع ترنح سبينوكيربيلار 1 (SCA1) بالمقارنة مع ضوابط النوع البرية الخاصة بهم. وقد كشفت هذه الأدلة المسارات الجزيئية الرئيسية الكامنة وراء الإمراض في خلايا المخيخ بوركينجي وساعد على تحديد الأهداف العلاجية المحتملة18. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن هناك اختلافات في التعرض للأمراض عبر مناطق المخيخ11و12و19. وهذا يمكن أن يشير إلى أن هناك تغييرات رئيسية تحدث في مناطق المخيخ متميزة، والتي قد تكون ملثمين أو غير مكتشفة مع مقتطفات المخيخ كله. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير التقنيات التي تسمح للباحثين بفحص الملامح الجزيئية في مناطق المخيخ المختلفة.
وتصف التقنية المقترحة هنا طريقة قابلة للاستنساخ لتشريح أربع مناطق متميزة من المخيخ الماوس من أجل عزل الحمض النووي الريبي من تلك المناطق واستكشاف الاختلافات الإقليمية في التعبير الجيني. التخطيطي للميخيخ الماوس في الشكل 1A يسلط الضوء على vermis باللون الأزرق، ونصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. على وجه التحديد، هذه التقنية تجعل من الممكن عزل أربع مناطق: نواة المخيخ العميق (DCN) (مربعات حمراء منقط في الشكل 1A)،القشرة المخيخية من الحشرات الأمامية (CCaV) (الأزرق الداكن في الشكل 1A)، القشرة المخيخية للفيرميس الخلفي (CCpV) (الأزرق الفاتح في الشكل 1A)،والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH) (الأصفر في الشكل 1A). ومن خلال تقييم التعبير الجيني لهذه المناطق بشكل منفصل، سيكون من الممكن التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف منفصلة لهذه المناطق المختلفة، فضلا عن الاختلافات المحتملة في ضعفها في المرض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

المخيخ يلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الرئيسية بما في ذلك السيطرة على الحركة, توازن, الإدراك, مكافأة, وتؤثر. تشير دراسات التصوير إلى أن مناطق المخيخ المتميزة تساهم في هذه الوظائف المختلفة. الدراسات الجزيئية دراسة الاختلافات المخيخ الإقليمية متخلفة كما يتم في الغالب على مقتطفات المخيخ كله وبالتالي إخفاء أي تمييز عبر مناطق المخيخ محددة. هنا نصف تقنية لتشريح أربع مناطق مخيخية مختلفة بشكل مستنسخ وسريع: نواة المخيخ العميقة (DCN) ، قشرة المخيخ الأمامية والخلفية ، والقشرة المخيخية في نصفي الكرة الأرضية. تشريح هذه المناطق المتميزة يسمح باستكشاف الآليات الجزيئية التي قد تكمن وراء مساهماتها الفريدة في التوازن والحركة والتأثير والإدراك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لاستكشاف الاختلافات في قابلية المرضية من هذه المناطق المحددة عبر نماذج مختلفة مرض الماوس.

لهذه التجارب، تم استخدام أربعة فئران برية أنثى عمرها أحد عشر أسبوعا C57/Black6. تم استخدام فأر واحد لإجراء تشريح المخيخ الكامل الذي يشار إليه باسم "المخيخ السائب" وسمح بمقارنة مستويات الحمض النووي الريبي في المناطق المشرحة بتشريح كامل. واستخدمت الفئران الثلاثة الأخرى لإجراء ...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

وقد تورطت مناطق المخيخ المختلفة للعب دور في النواتج السلوكية المتميزة، ومع ذلك لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة. يصف هذا العمل طريقة لتشريح قشرة المخيخ بشكل مستنسخ وسريع في نصفي الكرة الأرضية والمناطق الأمامية والخلفية من الحشرات ، والنوى المخيخية العميقة من أجل التحقيق في الاختلافات الجزيئية عن طريق عزل الحمض النووي الريبي واختبار الاختلافات في التعبير الجيني.

تشريح المخيخ الإقليمي للتحليل الجزيئي

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Views.  University of Minnesota. وقد تورطت مناطق المخيخ المختلفة للعب دور في النواتج السلوكية المتميزة، ومع ذلك لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة. يصف هذا العمل طريقة لتشريح قشرة المخيخ بشكل مستنسخ وسريع في نصفي الكرة الأرضية والمناطق الأمامية والخلفية من الحشرات ، والنوى المخيخية ?...

Video: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

سجل النمط الظاهري بسيط مركب نظام لتقييم نماذج الماوس من رنح مخيخي

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

وحيد ذبابة الفاكهة Ommatidium تشريح والتصوير

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

تشريح المخيخ الإقليمي للتحليل الجزيئي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

سجل النمط الظاهري بسيط مركب نظام لتقييم نماذج الماوس من رنح مخيخي

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

وحيد ذبابة الفاكهة Ommatidium تشريح والتصوير

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام

تشريح والثقافة، وتحليل

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار