نشأ الطريقة المعروضة في هذه المقالة عن العمل الممول من BBSRC BB / I021507 / 1 (TB، RJTW) وstudentship الدكتوراه MRC (MH).

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب مع فقا لكينجز كوليدج لندن، المملكة المتحدة والمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان UK زارة الداخلية. 1. تشريح E14 المخيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض البني الدجاج المخصب &quot;في 38 ° C إلى يوم الجنينية 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص البيض قطع رأس الفرخ الجنين في البيضة وإزالة الرأس إلى طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة PBS (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط القياسية، وجعل الشقوق وراء كل عين على طول الطريق من خلال الأنسجة، وإزالة العين والفك العلوي. جعل الشق الثاني على طول الطريق من خلال البلعوم إزالة الفك السفلي (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط القياسية، وإزالة كل الجلد من سطح الجمجمة عن طريق تقشير بعيدا (الشكل 1C) وإزالة أمامي والجداري العظام، وكشف الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الناحية البطنية، وإزالة الغضروف البلعوم واللحمة المتوسطة مساعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الناحية الظهرية، حذرالاي إزالة اللحمة المتوسطة ظهري إلى الدماغ المؤخر مع الحرص على عدم الاضرار الحنون، ودماغ كامل منفصل (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق كل وسيلة من خلال الأنسجة بين الدماغ المتوسط ​​والدماغ المؤخر والدماغ المؤخر منفصل بما في ذلك المخيخ (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق شقوق على طول الطريق من خلال الأنسجة في كل التقاطعات الجانبية من المخيخ وصفيحة الجناحية من الدماغ المؤخر، وإزالة المخيخ بأكمله، مع الحرص على الحفاظ على سلامة الحنون في جميع أنحاء تشريح (الشكل 1F). إزالة تشكيل الضفيرة المشيمية (الشكل 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المخيخ تشريح في الجليد الباردة HBSS. </li></ol> 2. من الثقافة شريحة E14 المخيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المخيخ كله إلى منصة معقمة من الأنسجة المروحية باستخدام ملعقة أو ماصة باستير 3 مل مع طرف قطع لتوسيع الفتحة. إزالة السائل الزائد باستخدام ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المخيخ كله كله في تيكان المطلوب التوجه في 300 ميكرون سمك باستخدام المروحية الأنسجة مع مجموعة سرعة القطع بنسبة 50٪ من الحد الأقصى. هو الحفاظ على سلامة الأنسجة الأكثر سهولة في مقطع سهمي. ومع ذلك، التوجه هو أيضا من الاعتبارات المهمة لتحليل الخلية (يتم محاذاة التشعبات الخلية العصبية sagittally، في حين محاور الخلايا الحبيبية تشغيل مستعرض، عمودي على الطائرة من التشعبات الخلية العصبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 3 مل ماصة باستير، تغطية المخيخ شرائح في الجليد HBSS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح في HBSS إلى 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS الطازجة باستخدام ماصة باستير 3 مل مع خفض الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح مضيئة مع مصدر ضوء الألياف البصرية، وضمان الفصل بين شرائح الفردية باستخدام ملقط ساعاتي. تحديد شرائح ليتم electroporated، استنادا إلى سلامة الأنسجة وموقف ميديو الاطراف. ملاحظة: كل من تشريح الجنين من خلال لشريحة الحضانة في مستنبت يستغرق حوالي 10-20 دقيقة حسب UPOن الخبرة. أداء تشريح في وقت واحد لضمان أن مخيخات تنفق الحد الأدنى مقدار الوقت بين قطع الرأس والثقافة خارج الحي. </li></ol> 3. Electroporation للمن شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء دائرة Electroporation للعن طريق تحديد الأنود من electroporator إلى قاعدة 60 مم طبق بتري مع الشريط العازل. إضافة حوالي 1 مل من HBSS لتغطية القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج 0.4 ميكرومتر الثقافة على رأس القطب المشمولة في HBSS. السماح للإدراج الثقافة للراحة على القطب التأكد من عدم والاتصال دائما بين إدراج والقطب. ملاحظة: في هذا الإعداد، وإدراج الثقافة مع شرائح الراحة على سطح من الحل، والحفاظ على الدوائر ولكن يسمح الاستهداف المكاني للالكاثود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شرائح محددة (ما يصل الى خمسة في إدراج الثقافة) على إدراج الثقافة باستخدام 3 مل ماصة باستير مع خفض الحافة. منفصلة والسماح لتسوية على إدراج الثقافة في sagittآل التوجه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، وإزالة الزائد HBSS بحيث شرائح لم تعد استحم في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة طرف P10، DNA ماصة (بتركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر) المخفف مع الأخضر سريع 20٪ على سطح المنطقة المستهدفة من شريحة. 20٪ الأخضر سريع يضمن حل DNA لزج ويمنع مانع تشتت واسعة من DNA. إضافة ما يقرب من 5 DNA ميكرولتر / حل سريع الخضراء على كل شريحة (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القطب السالب على الأنسجة المستهدفة المطلوب وelectroporate مع 3 × 10 V، 10 البقول مدة ميللي ثانية. تجنب الاتصال المباشر من القطب السالب مع الأنسجة. بدلا من ذلك، والاستفادة من التوتر السطحي للسائل للحفاظ على تصرف (وضع الكاثود أقرب إلى الأنسجة ممكن دون لمس الواقع الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر تسليم DNA و electroporation إلى مناطق متعددة من EGL على كل شريحة المخيخ الفردية كما تريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من Electroporation لل، ثقافة نقل INSEغ إلى 30 مم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل ثقافة، إضافة 1 مل من قبل تحسنت مستنبت (بصل متوسطة النسر، 0.5٪ (ث / ت) D - (+) - الجلوكوز، 1٪ B27 ملحق، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) تحت إدراج الثقافة بحيث إدراج الثقافة في اتصال مع المتوسط، ولكن لم يتم استحم شرائح في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الثقافات في 37 ° C / 6 CO 2٪ لمدة تصل إلى 3 أيام. استبدال كافة مستنبت كل 24 ساعة مع الطازجة المتوسطة قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعقب الثقافة، وتحديد شرائح على ثقافة إدراج لمدة 1 ساعة في 4٪ امتصاص العرق (أو O / N عند 4 درجات مئوية) في 30 ملم طبق جديد مع عدم وجود وسائل الإعلام الثقافة. </li></ol> 4. التصوير من مخيخي شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت، وغسل شرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شفرة حلاقة، تشريح كل شريحة المخيخ electroporated ومثقف من إدراج الثقافة عن طريق خفض حول شريحة وإزالة شريحة ومنطقة إدراج يتم الالتزام فيها. فعللا تحاول إزالة شريحة من السطح إدراج الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل شرائح في حوالي 1 مل من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي (إذا رغبت) تحت ساترة مع الحرص على عدم إدخال فقاعات، والصورة باستخدام ليزر المسح المجهري متحد البؤر. ملاحظة: يمكن أن تختلف المعلمات التصوير وفقا ليبني electroporated، وبناء على السلطة التقديرية للمستخدم فردي. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول ذكرت هنا يصف طريقة لتشريح، electroporating وزراعة شرائح من الجنينية يوم 14 المخيخ من الفرخ. هذا البروتوكول يتيح استهداف Electroporation لللمناطق محورية صغيرة من EGL، بما في ذلك استهداف معزولة من فصوص المخيخ الفردية. فإنه يتيح التحليل الجيني والتصوير بدقة عالية والراحة، وبت?...

المخيخ يجلس في نهاية الأمامي من الدماغ المؤخر وهي المسؤولة عن دمج المعالجة الحسية والحركية في الدماغ ناضجة وكذلك تنظم العمليات العقلية العليا 1. في الثدييات والطيور، وأنها تمتلك التشكل تفصيلا ورقي بشكل كبير، وهو منتج من التضخيم عبور واسعة من الأسلاف خلال التنمية التي تنتج أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ الكبار. وكان المخيخ موضوع دراسة للبيولوجيا عصبية لعدة قرون، في عهد الجزيئي تلقت أيضا اهتماما كبيرا. ويتصل هذا ليس فقط لوظائفه الحيوية للاهتمام في حد ذاتها، ولكن أيضا إلى حقيقة أنه متورط بشكل كبير في الأمراض التي تصيب البشر بما في ذلك اضطرابات وراثية التنموية مثل اضطرابات طيف التوحد 2 وأبرزها سرطان المخيخ، نخاعي 3، الذي هو الدماغ عند الأطفال الأكثر انتشارا ورم. الأهم من ذلك، هو نظام نموذجا ممتازا ضمن ملحقالتراث الثقافي غير المادي لدراسة تخصيص مصير وتكوين الخلايا العصبية أثناء نمو المخ 4. في السنوات الأخيرة، كما ثبت كنظام نموذج لدراسة مقارنة لنمو الدماغ، وذلك بسبب التنوع الهائل في أشكال المخيخ ينظر عبر نسالة الفقاريات 10/05. المخيخ يتطور من نصف ظهري من قسيم معيني 1 في الدماغ المؤخر 11 وتنمويا ويتكون من اثنين من السكان السلف الأساسي، الشفة المعينية ومنطقة البطين. الشفة المعينية تمتد في جميع أنحاء المنطقة الظهرية من الظهارة العصبية من الدماغ المؤخر على الحدود مع لوحة السقف. ومن مهد الخلايا العصبية مثير glutamatergic من المخيخ 12-14. في منطقة البطين يثير في GABAergic الخلايا العصبية للدماغ المثبطة، أبرزها الخلايا العصبية الكبيرة العصبية 14،15. في وقت لاحق في التنمية (من نحو يوم الجنينية 13.5 في الماوس؛ E6 في فرخ 16)، glutamatergic PROGENitors الهجرة بشكل طفيف من الشفة المعينية وتشكل طبقة حنوني من الأسلاف: تسمى منطقة السلف الثانوية الطبقة الحبيبية الخارجية (EGL). ومن هذه الطبقة التي يخضع التضخيم العبور الواسع النطاق الذي يؤدي إلى أعداد هائلة من الخلايا العصبية الحبيبية وجدت في الدماغ ناضجة. منذ فترة طويلة ارتبط انتشار في EGL إلى الموقع الفرعي حنوني الذي ينتج عن الهجرة عرضية من المعينية شفة 17، مع التحول إلى خروج دورة الخلية وتمايز الخلايا العصبية الأسلاف ارتباطهم خروجهم من طبقة EGL الخارجية في منتصف EGL 18. الهجرة عرضية واسعة من الخلايا الحبيبية بعد الإنقسامية في محور وسطي الجانبي يحدث في الوسط والداخلي جي 19، قبل الهجرة النهائية شعاعي في الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ ناضجة. هجرة الخلايا من الشفة المعينية على سطح المخيخ تعتمد على CXCL12 إشارات من الحنون 20-22 </sup&gt; والخلايا الحبيبية التعبير عن مستقبلات CXCL12 CXCR4. الهجرة عرضية من هو هكذا تذكر أن من عرضية القشرة المخية الحديثة المهاجرة السكان عصبون المثبطة 23-25. يثير الاهتمام والفضول، واقترح الإلكترون الدراسات المجهرية 17 أن الخلايا EGL مع التشكل التكاثري البقاء على اتصال حنوني، وربط سلوك الخلية مع القدرة على التكاثر بطريقة تذكرنا الأسلاف القاعدية من القشرة الثدييات 26. وينعكس هذا في الطبقات المذكور من EGL إلى ثلاث طبقات فرعية التي تم تعريفها من قبل بيئات خارج الخلية المتميزة والتي لها السلائف الحبيبية متميزة التعبير الجيني التواقيع 18. انتشار الأسلاف في oEGL يحدث مع التوزيع الطبيعي للأحجام استنساخ بحيث عندما يتم بشكل فردي وصفت الأسلاف وراثيا في نهاية التطور الجنيني في الماوس، فإنها تؤدي إلى معدل متوسط ​​250-500 ز تالية للتفتلالخلايا العصبية ranule 27،28. انتشار يعتمد على مولد للتفتل يشير SHH من الخلايا العصبية الكامنة وراء العصبية 29-32. وقد تبين القدرة على الرد على SHH أن تعتمد كليا على الخلية التعبير المستقل للعامل النسخ Atoh1، سواء في المختبر 33 والمجراة 34،35. وبالمثل، فقد تبين خروج دورة الخلية والتمايز أن تعتمد على التعبير عن عامل النسخ المصب NeuroD1 36، والتي من المحتمل أن يكون كاظمة مباشر من Atoh1 37. وعلى الرغم من هذا التقدم، والتقدم الكبير في فك رموز أساس بيولوجي خلية من دورة الخلية خروج 38-42، الآلية الجزيئية الأساسية (ق) التي تكمن وراء قرار الخروج من دورة الخلية والانتقال من السلف إلى الخلايا العصبية التفريق، و يرتبط الهجرة عرضية تالية للتفتل في EGL الداخلي فضلا عن التبديل لاحقإلى الهجرة شعاعي، لا تزال غير مفهومة تماما. هذا هو إلى حد كبير بسبب استعصاء التجريبي للEGL: فوات النامية، ويصعب استهداف وراثيا منذ العديد من نفس الجزيئات العصبية هي أيضا في الحياة السلائف الحبيبية في وقت سابق حاسمة في الشفة المعينية. للتغلب على هذه المشكلة، وقد وضعت العديد من الكتاب في الجسم الحي وخارج الحي Electroporation للكوسيلة لاستهداف المخيخ ما بعد الولادة في القوارض 43-48. هنا، نحن الرواد في استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للفي فرخ لدراسة EGL، التي تمثل مزايا كبيرة من حيث التكلفة والراحة. لدينا طريقة Electroporation للوخارج الحي ثقافة شريحة من نسيج دماغ الفرخ يستخدم تشريح الأنسجة الجنينية من يوم 14 الكتاكيت في ذروة EGL الانتشار. هذا الأسلوب يسمح الاستهداف الجيني للEGL بشكل مستقل من الشفة المعينية وسوف يمهد الطريق لتشريح الجيني للانتقال من الحبيبيةالسلف لتالية للتفتل الخلايا العصبية الحبيبية في المخيخ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ (EGL) هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية، ونموذجا ممتازا لدراسة انتشار الخلايا العصبية والتمايز. وبالإضافة إلى ذلك، كانت التعديلات التطورية للقدرة التكاثري من المسؤول عن التوسع الكبير في حجم المخيخ في amniotes، مما يجعل من المخيخ نموذجا ممتازا للدراسات ايفو-DEVO من الدماغ الفقاريات. الخلايا المكونة للEGL، الأسلاف الحبيبية للدماغ، كما تمثل خلية كبيرة من أصل لنخاعي، ورم الخلايا العصبية لدى الأطفال الأكثر انتشارا. بعد التضخيم العبور، السلائف الحبيبية تهاجر شعاعيا في الطبقة الحبيبية الداخلية من المخيخ حيث أنهم يمثلون أكبر عدد من الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات ناضجة. في الفرخ، وذروة EGL الانتشار يحدث في نهاية الأسبوع الثاني من الحمل. من أجل استهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة فيذروة الانتشار، قمنا بتطوير طريقة للتلاعب الجيني من خلال خارج الجسم الحي Electroporation للشرائح المخيخ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج. هذه الطريقة يلخص عدة جوانب هامة من الجسم الحي في الحبيبية تطوير الخلايا العصبية، وسوف يكون من المفيد في خلق فهم شامل للدماغ تكاثر الخلايا الحبيبية والتمايز، وبالتالي التنمية المخيخ، وتطور والمرض.

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام Electroporation للشريحة وثقافة المخيخ من الجنينية يوم 14 فرخ. ويوضح تشريح المخيخ في الشكل 1 ويظهر غرفة Electroporation للاقامة في الشكل 2. نظهر أنه من الممكن electroporate...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج.

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K Views.  King's College London.  الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الد...

Video: Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

السابقين فيفو Perfusion من المشيمة القوارض

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

طريقة الكهربائي في الجسم الحيوي تسليم الحمض النووي بلازميد في Telencephalon حمار وحشي الكبار

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...