Yazarlar yardım flow sitometri James Oesterling teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (R01-CA178380, ZY) ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Doktora Sonrası eğitim bursu (5T32CA009035-37, LWY) bir hibe ile desteklenmiştir.

Bu protokolde hayvanların kullanımı Fox Chase Kanser Merkezi&#39;nde Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Göstergeler, Çözümler ve lameller 1. Hazırlık <ol><li> # 5 ince forseps temiz iki takım, 7. bir set ince kavisli forseps, büyük bir cerrahi makas, bir Microdissecting makas, bir spatula ve bir delikli kaşık. Kendi kendine yapışan bir sterilizasyon kese ve otoklav içindeki aletleri yerleştirin. Kullanıma hazır olana kadar kese aletleri tutun. </li><li> % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözelti hazırlayın. <ol><li> Kabarcıklar ortaya çıkıncaya kadar steril Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 50 ml 1.5 g agarozun Add mikrodalga ve ısı yerleştirin. Tüm agaroz kadar girdap içinde eritildi ve yeniden ısıtma çözülene. Kümeleri görüldüğünde ısıtmadan önce bir karıştırma çubuğuna sahip olan çözüm karıştırın. </li><li> Bir 37 ° C su banyosunda solüsyon deposu kadar gerekli. </li><li> Uzun süreli Saklama Sistemi İçine ay boyunca oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de gelecekte kullanılmak üzere agaroz çözüm saklayın. Sıvılaştırılması için mikrodalga ısıtın. Agaroz çözeltinin tekrar ısıtılması için ılık steril damıtılmış su ile başlangıç ​​ağırlığı korumak için ısıtmadan önce şişeyi tartın. </li></ol></li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 2 papain temelli hücre ayrılması için aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ol><li> Steril fenol kırmızı DPBS ihtiva eden papain (100 U / ml), sistein (0.2 mg / ml) ve DNAse (250 U / ml) ile bir papain çözeltisi. </li><li> Büyükbaş hayvan serum albümini ile bir ovomukoid çözeltisi (BSA, 8 mg / ml), soya fasulyesi tripsin önleyici (8 mg / ml)) ve DNaz (250 U / ml) steril kırmızı olmayan fenol ihtiva eden DPBS. Filtre hem çözümler sterilize ve fenol kırmızı içeren DPBS orijinal rengini geri dönmek için pH ayarlamak. </li></ol></li><li> Hücre kültürü ortamı (NB / B27) hazırlanması: 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin,% 1 penisilin-streptomisin (P / S), B27 eki ile bir bazal ortam ek. FilteR, sterilize ve ışıktan korur. Kullanımdan önce, 37 ° C&#39;de ve ortam% 5 CO2 dengelenmesi. </li><li> FACS tamponu hazırlayın:% 5 fetal sığır serumu, DPBS (FBS). 47.5 ml DPBS 2.5 ml FBS ekleyin. </li><li> Poli-D-lisin (PDL) kaplı lamelleri hazırlayın. <ol><li> Otoklav Yeni cam lamelleri. </li><li> Kaplayın PDL lamelleri (steril damıtılmış su içinde 100 ug / ml) ve 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir ve gece boyunca oda sıcaklığı. </li><li> Yıkama steril damıtılmış su ile lamelleri. NB / B27 medya ile bir kez yıkayın. Lamelleri kullanmak için önce doku kültürü kaputu tamamen kurumasını bekleyin. </li></ol></li></ol> Doku Dilimleri 2. Diseksiyon ve Hazırlık <ol><li> Diseksiyon gününde, emici bir ped ile% 70 etanol ve kapak ile diseksiyon alanı silin. </li><li> Sterilizasyon kesesinden diseksiyon aletleri çıkarın. Buz soğuk, buz üzerinde küçük bir petri ve yere steril DPBS /% 1 P / S ekleyin. </li><li> Decapitate P4 Math1-GFBüyük cerrahi makas ile P / Nestin-OBP fare yavrular sonra ince kavisli bir forseps ile kafa basılı tutun. Cilt kaldırın ve yavaşça ince forseps daha sonra bir spatula kullanarak kafatası beyin kepçe ve DPBS /% 1 P / S içeren Petri kabı aktarmak # 5 ile kafatasını soymaya. <ol><li> # 5 ince forseps kullanarak, dikkatli bir beynin geri kalanından beyincik ayrı. Mümkün olduğunca çabuk bir defada bir yavru incelemek için emin olun. </li><li> Moleküler ve işlevsel analiz için yeterli lif düğümlerinin elde edilmesi için 8 cerebella az toplayın. </li></ol></li><li> % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisiyle 2 x 2 x 2 cm büyüklüğünde bir gömme kalıp doldurun. Agaroz sıcaklığı fazla 37 ° C olduğundan emin olun. </li><li> Laboratuar doku yavaşça dabbing beyincik fazla sıvıyı çıkarın. Dikey konumda kalıba beyincik yerleştirin. Hızlı bir şekilde katılaşmasına izin vermek için buz üzerinde kalıp yerleştirin. Blok başına ~ 4 cerebella kullanın. </li><li> Li edinintitreşimli bıçak vibratom ile Ving doku bölümleri. Bir jilet ile serebellası içeren agaroz blok Trim. Dikey konumda yönlendirilmiş cerebella ile vibratome plakasına agaroz blok tutkal. </li><li> Altında buz-soğuk steril DPBS&#39;de / 1% P / S ve yer buz ile vibratome tepsiyi doldurun. <ol><li> Beyincik tüm uzunluğu boyunca 600 um kesitler halinde kesilmiştir. Delikli bir kaşık kullanarak buz tepsiden bölümleri toplayın. Buz üzerinde DPBS /% 1 P / S ile dolu bir Petri tabağına yerleştirin bölümleri. </li></ol></li></ol> 3. Mikrodisseksiyon ve Hücre Ayrılma <ol><li> Bir floresan mikroskop altında doku dilim içeren Petri kabı yerleştirin. <ol><li> Dikkatle (Şekil 1 &#39;de noktalı çizgi bakınız) CFP + moleküler tabakası ve GFP + EGL arasında kesilmesi yoluyla ince pensler kullanılarak bir serebellar bölümün geri kalanından ayırmak EGL. Neden olacaktır, moleküler tabakanın herhangi bir bölümünü dahil değil dikkatli olunNestin-ifade Bergmann glia kontaminasyon. </li><li> Mümkün olduğunca çabuk bu adımı tamamlayın ve hücre ölümünü önlemek için buz üzerinde doku tutun. </li><li> Bir sonraki aşamaya geçmeden önce dokuyu çevreleyen agaroz çıkarın. </li></ol></li><li> Daha önce tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tarif edildiği gibi 2 papain tabanlı bir protokol kullanarak microdissected EGL doku Digest. <ol><li> FACS üzerinden CFP-pozitif hücrelerin toplanması için FACS tampon hücreleri yeniden askıya. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Sıralama ve Kaplama <ol><li> Uygun bir CFP filtresini içeren ve buz üzerinde FACS tamponu hücreleri toplamak sitometresi steril, yüksek hızlı akışı kullanılarak CFP floresan için sıralama hücreleri. Her P4 beyincik yaklaşık 100.000 NEPS edinin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri. Daha fazla deney için moleküler analiz veya kültür için hemen hücreleri kullanır. </li><li> Kültür hücreleri, önceden ısıtılmış NB / B27 m hücreleri yeniden askıyaPDL kaplı lamelleri edia ve plaka daha önce 2 nitelendirdi. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan yöntem mikrodiseksiyon moleküler ve fonksiyonel analizlerde kullanım için canlı hücreler saf bir popülasyonu izole etmek mümkün ilk işlemdir. Li ve ark. 9 ile gösterildiği gibi, Bu yöntemle elde edilen NEP kültürlenmiştir ve çeşitli deneyler dahil edilir ve olduğu gibi yüksek saflıkta, aynı zamanda mikro-dizi analizi için de kullanılabilir edilebilir. Bu mikrodisseksiyon tekniğiyle ustalaşmanın zaman çok önemlidir....

Beyincik, çok hücreli bir katman, her biri farklı hücre tiplerinde meydana gelir. Moleküler tabaka ve purkinje katman sırasıyla Bergmann glia ve purkinje nöronları içeren ise gelişme sırasında, EGL granül nöron öncüleri (kişi başına milli geliri) çoğalan içerir. Beyincik içinde derin nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) ve oligodendrositleri 1 içeren beyaz madde, yatıyor. Sonic dikenli proteini (Shh) serebellar gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı ve özellikle de, kendi reseptörü olan yamalı (PTC), Shh, 2-4, sinyal bir negatif düzenleyicisi bağlanarak kişi başına milli geliri çoğalmasını teşvik eder. Sus sinyal anormal aktivasyonunun Medulloblastom (MB), çocuklarda 5,6 en sık görülen kötü huylu beyin tümörü oluşturur. Ptc mutant MB transgenik fare modelleri MB çalışma için güçlü araçlar vardır ve insan MB 7,8 benzeyen tümörler gelişebilir. Kullanarak bufarenin, bu kişi başına milli geliri kirpi tipi MB 7 kökenli hücre olduğu keşfedildi. Ayrıca, ek olarak kişi başına milli geliri, yakın zamanda da MB ortaya çıkmasına neden olabilir gelişen beyincikte de EGL içinde nöronal progenitörlerin benzersiz bir popülasyonu tespit ettik. Bu hücreler, tip VI filaman protein Nestin yüksek seviyelerde ifade etmek ve NEP 9 olarak adlandırılır. NEP EGL derin bölümü içinde yer alan ve sadece yenidoğan serebellar gelişme sırasında geçici olarak mevcut olurlar. Onlar kişi başına milli geliri olarak granül hücre soyu kararlıdır ama onlar sakin ve Math1, konvansiyonel kişi başına milli geliri 10 köklü bir işaretleyici ifade yok gibi farklıdır edilmektedir. Buna ek olarak, NEP onları MB tümörogenez için yeni bir kökeni yapar Şşş sinyal yolunun 9 aktivasyonu sonrası MB yol daha verimli kişi başına milli geliri verir. Biz daha önce mikrodisseksiyon tekniği ile doğum sonrası 4. günde (P4) de serebellar EGL gelen NEPS izoleburada 9 nitelendirdi. Dokunun direkt mikroskopik ile mikrodiseksiyon serebellar EGL belirli diseksiyon sağlar. Nestin da serebellar beyaz cevher ve moleküler tabaka 1,7,11,12 Bergmann glia ile NSC&#39;lerde ifade ve analizleri etkileyebilecek gibi o, bu hücreler dahil edilmemesi çok önemliydi gibi bu gereklidir. Microdissected dokudan izole edilen hücreler moleküler analiz için hemen kullanılabilir ya da daha fazla uygulama için kültürlenebilir. Özellikle EGL Microdissecting yardımcı olmak için ve daha fazla nepler arıtmak için Math1-GFP (yeşil floresan protein) farenin Nestin-CFP (mavi floresan protein) fareler ile çaprazlandı. Math1 spesifik kişi başına milli geliri ve GFP ifadesi ile anlatılmak istenen, transkripsiyon faktörü EGL 9,13 açıkça görülebilir. Nestin-CFP farenin CFP nükleer şeklinde ifade ve kolayca moleküler tabakanın 9,14 olarak görselleştirilebilir. Birlikte, GFP ve CFP ifade EGL mikrodiseksiyonu için sınırlarını oluşturmak (Şekil 1). CFP pozitif NEP daha sonra kesilmiş EGLs enzimatik ayrışma sonrasında, FACS ile izole edilmiştir. Şu anda, EGL hücreleri izole etmek için en çok kullanılan yöntem, tüm beyincik dokusuna 15,16 Percoll gradient santrifüjleme. Ancak bu metot, tam olarak moleküler tabakanın beyaz maddeden Nestin + hücre popülasyonlarının dahil yapamaz ve dolayısıyla neps çalışma için kullanılamaz. Ilgi hücreleri çıkarmak için lazer enerjisinin transferini kullanan lazer yakalama mikrodiseksiyon, heterojen bir doku 17,18 içinde belirli hücreleri izole etmek için kullanılabilir, ancak yakalanan hücreleri sadece DNA, RNA ve proteinin geri kazanılması için kullanılan ve değildir başka bir yöntemdir edebilmek yetiştiriciliğine. Bu protokol, özellikle EGL gelen NEP&#39;lerin bir canlı, saf bir nüfusunu yalıtmak için bir yol sağlar.Bu teknik aynı zamanda tanınan anatomik mimari veya flüoresan etiketli hücre / alanlara sahip farklı doku türlerine uygulanabilir. Bu nedenle, hücre izolasyon protokolleri, bu yeni mikrodiseksiyon tekniği içeren en büyük avantajı, hücreler, doku komşu kirletici ortadan kaldırmak için özel doku bölgeleri izole edilebilir ve hücreler, diğer uygulamalar için veya kültür analizi için hemen elde edilebilmesidir.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Mikrodisseksiyon bir doku spesifik bölgelerini izole ve komşu bölgelerde hücresel kaynaklardan kirlenmeyi ortadan kaldırabilir yeni bir tekniktir. Bu yöntem, ilk çalışmada kullanılmıştır Nestin salgılayan progenitorlar (döküntüler), serebellar dış germinal tabakadan (EGL) hücrelerin yeni tespit edilen bir popülasyon. Floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) ile kombinasyon halinde kullanılması mikrodiseksiyon, neps saf nüfus serebellumda EGL geleneksel granül nöron habercilerden ve diğer kirletici Nestin salgılayan hücrelerin ayrı olarak toplanmıştır. Mikrodiseksiyonu olmadan, NEP&#39;lerin fonksiyonel analizleri gibi Percoll santrifüj ve lazer yakalama mikrodiseksiyon olarak kullanılabilir mevcut yöntemleri ile mümkün olmazdı. Bu teknik aynı zamanda tanınan bölgeleri veya floresan ile etiketlenmiş ya da hücreleri içeren çeşitli dokularda kullanılmak için de uygulanabilir. Bu microdissectio en önemlisi büyük bir avantajdırn, teknik izole edilmiş canlı hücreler ve başka tarif edilen yöntemler ile mümkün değil ayrıca deney için kültürlenebilir olmasıdır.

Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, serebellar dilim hangi serebellar EGL GFP ifade kişi başına milli geliri hakim ve moleküler tabaka CFP pozitif glial hücreler tarafından zenginleştirilmiş P4 Math1 GFP / Nestin-CFP farelerden hazırlandı. (Şekil 1A kesikli hattı boyunca) EGL derin kısmında bulunan lif düğümlerini izole etmek için, dilimler EGL ve moleküler tabaka arasında microdissected edildi. Disseke EGLs (Şekil 1B) daha sonra...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Görüntüleme.  Temple University Health System.  Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir. 

Video: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Biyoloji

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Nörobilim

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Fare Primer Serebellar Granül Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Doğum Sonrası Fare Beyinciğinden Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Nöral Hücrelere Farklılaşması

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...