وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (1 R01 GM095384-01) منحت لغابة Rohwer. نشكر EPICENTRE، وهي شركة البورشيد لتوفير الوصول المبكر إلى مجموعات RIBO-صفر علم الأوبئة. نشكر كافة هاتاي لتصميم وإنتاج حامل أنبوب تنبيذ فائق. نشكر أندرياس هاس وبنيامين نولز للقراءات ومناقشات حاسمة للمخطوطة، ولورين بول لمساعدة عملية التصوير.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics الفيروسية وتتركز الجسيمات الفيروسية باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار أو مركزات حجم الصغيرة. في بعض الحالات، قد لا تكون هناك حاجة إلى تركيز، ولكن تستخدم ما قبل الترشيح أو منخفضة الخطوات سرعة الطرد المركزي لإزالة الخلايا حقيقية النواة والميكروبية. وسيتواصل إثراء لست] الفيروسية وتنقيتها باستخدام التدرج الكثافة تنبيذ فائق 9،41 أو مرشحات صغيرة الحجم (على سبيل المثال، 0.45 ميكرون) لإزالة الخلايا الميكروبية حقيقية النواة والكبيرة 25. وعادة ما يتم تنفيذ كثافة التدرج تنبيذ فائق مع حلول كثيفة ولكن الخاملة مثل السكروز أو السيزيوم كلوريد لعزل والتركيز الجسيمات الفيروسية 41. ويستند الفصل المادي على حجم وكثافة الطفو من الجسيمات الفيروسية. لذلك، واختيار المناسب لحجم مرشح المسام وإعداد دقيق للالتدرجات ضرورية لعزل المجتمعات الفيروسية محددة، ونجاح التأهيل البدني للVLPs يحدد المجتمع معزولة 41 (أي الجسيمات الفيروسية التي لا تمر عبر مرشح أو يدخل في كثافة استخراج لن يتم الكشف في metagenome). بعد العزلة الفيروسية والتركيز، قد يكون هناك تلوث غير الفيروسية الحاضر المواد الجينومية في العينة سواء في شكل الأحماض النووية حرة والجراثيم والخلايا حقيقية النواة. لذا، فمن الأهمية بمكان للتحقق من نقاء الجسيمات الفيروسية في عينات (أرقام 1A و 1B). ويستخدم العلاج الكلوروفورم عادة لليز الخلايا المتبقية، تليها العلاج نوكلياز للحط من الأحماض النووية المجانية قبل استخراج الحمض النووي. وكان التحذير لسير العمل قدم استخدام كثافة الفصل المتدرج لعزل الجزيئات الفيروسية لأنها قد تستبعد الجسيمات الفيروسية يلفها التي قد تكون مزدهرة جدا لدخول التدرج CSCL. بديل &quot;الصيد الجميع&quot; طريقة لحذف separ كثافة التدرجأوجه وعزل DNA المجتمع من 0.45 ميكرون - الرواشح تعامل مع الكلوروفورم والدناز I. هذا النهج هو أيضا مناسبة لاستيعاب حجم عينة صغيرة مثل تلك التي من مسحات أو بلازما الدم. ومع ذلك، فإن هذا قد يؤدي إلى التلوث الجرثومي مقاومة للالكلوروفورم ومبلغ أعلى من الحمض النووي خارج الخلية مقاومة للI الدناز. بروتوكولات التسلسل الحالية تتطلب 1 نانوغرام إلى 1 ميكروغرام من الأحماض النووية لإعداد مكتبة التسلسل حيث توفر عوائد أعلى DNA خيارات أوسع من الخيارات التسلسل. تركيز الحمض النووي من viromes الناتجة غالبا ما يتراوح بين أقل من الحد الكشف لأكثر من 200 نانوغرام / ميكرولتر. كمية الأحماض النووية الفيروسية تعافى قد لا تكون كافية لإعداد مكتبة التسلسل المباشر. في مثل هذه الحالات، والتضخيم الحمض النووي أمر ضروري. رابط التضخيم بندقية المكتبات (LASLs) 2،42،43 وكله تضخيم الجينوم على أساس تعدد التضخيم النزوح (MDA) هي اثنينطرق الأكثر شيوعا لتوليد DNA كافية لالتسلسل. ومن المعروف طرق MDA مثل تلك القائمة على Phi29 DNA بوليميريز تعاني من التحيز التضخيم، ويمكن تضخيم تفضيلي ssDNA وDNA دائري، مما أدى إلى تصنيفية غير الكمي وتوصيف وظيفي 44،45. وقد تبين لإصدار الأمثل للنهج LASLs لإدخال فقط الحد الأدنى من التحيزات، ويعزز حساسية أعلى (لكميات صغيرة من المواد ابتداء)، ويتم تكييف بسهولة لمنصات مختلفة تسلسل 43. ومع ذلك، فإن النهج العديد من الخطوات، يتطلب معدات متخصصة لتقليل الخسائر DNA، ويقتصر على القوالب dsDNA. في المختبر لدينا، وقد تم تكييف هذا النهج بنجاح لتضخيم كمية كشفها وغير قابل للكشف من الحمض النووي المستخرج من lavage- القصبات، VLPs المرجان والبحر المستمدة من المياه (غير منشورة وهرويتز وآخرون 46). تطوير خطوط أنابيب تحليل البيانات لديها CLAكان ssically واحدة من أصعب جوانب التحليل metagenomics الفيروسي بسبب الطبيعة المتنوعة للغاية وغير معروفة إلى حد كبير من المجتمعات الفيروسية. في حين أن هناك ما يقدر بنحو 10 8 التراكيب الوراثية الفيروسية في المحيط الحيوي، حتى الآن قواعد البيانات الفيروسية الحالية احتواء ~ 4،000 الجينومات الفيروسية، وهي عبارة عن 1/100000 من مجموع هذا التنوع الفيروسي تقريبي. لذلك، وعمليات التفتيش القائم على التشابه (مثل BLAST 47) لاحالة التصنيف وظيفية في metagenomes الفيروسي تمتلك التحديات الكامنة. تفشل العديد من متواليات أن هناك أوجه شبه كبيرة لالجينوم في قاعدة البيانات، وبالتالي، تصنف على أنها غير معروفة. على الرغم من عمليات البحث على أساس التماثل هي أهم التطبيقات لتعيين التصنيف وتعمل لتسلسل البيانات، تم وضع النهج البديلة على أساس تحليل قاعدة بيانات مستقلة 48- 50. Fancello وآخرون. 51 تقديم استعراض كاملة من الأدوات والخوارزميات الحسابية المستخدمة في فيراmetagenomics لتر. الميكروبية Metagenomics عادة، فإن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي المستخرج من المجتمعات ناقص التوتر المعالجة تحلل الميكروبية (HL-DNA) تتراوح من 20 نانوغرام إلى 5 ميكروغرام. العائد يعتمد اعتمادا كبيرا على الحالة الصحية للمريض وكمية عينة البلغم التي تم جمعها، وهو ما يفسر الاختلافات ينظر في العائد الكلي للHL-DNA المستخرج في هذه الدراسة (الجدول 2). الخطوات الحاسمة لتوليد تعتمد البيانات تسلسل نوعية جيدة على نوعية المكتبات تسلسل ولدت. ويبين الشكل 2 مجموعة حجم نموذجية لمكتبات التسلسل المتولدة من الحمض النووي الميكروبي المستمدة البلغم-CF باستخدام إجراء تجزئة الحمض النووي القائم على الأنزيمية. حجم مكتبة الأمثل يعتمد على اختيار منصة التسلسل والتطبيق، وبالتالي، يمكن أن يكون الأمثل الإجراء التجزؤ، وإذا لزم الأمر، من خلال النهج البديلة مثل صوتنة وإرذاذ. بالإضافة إلىنتائج تمثيلية المقدمة، ويتضح نجاح الطريقة المعروضة على البلغم CF جمعها من المرضى متعددة عبر نقاط زمنية متعددة أيضا في ليم وآخرون (2012) 9 وليم وآخرون (2014) 10. الدراسات السابقة 9،10 تشير إلى أن كل مريض المرافئ مجموعة فريدة من المجتمع الميكروبي أن التحولات بمرور الوقت، مما يعكس استمرار اللاعبين الرئيسيين في المجتمع في حين من المرجح تقلبات بسبب الاضطرابات مثل العلاج بالمضادات الحيوية. إذا ما كان سبب هذه التقلبات يوميا حتى من دون اضطرابات الخارجية أو نتيجة لإجراءات أخذ العينات وتجهيز العينات، لا يزال في السؤال. وبناء على ميتاجينومية-DNA HL و16S rDNA تحليل amplicon، تظهر أخذ العينات طولية لمدة 7 أيام أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية (يوم 1 و 2 و 3) والحد الأدنى (أرقام 3A و 3B). على مقدمةالدرفلة الجديد من المضادات الحيوية عن طريق الفم مباشرة بعد أخذ العينات يوم 3، وأصبحت التغييرات في ملف تعريف المجتمع على ما يبدو في يوم 4. على الرغم من أن سيبروفلوكساسين المضادات الحيوية يستهدف طائفة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية المعروفة مثل P. الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية، والالتهاب الرئوي العقدية، زادت العلاج الوفرة النسبية للP. الزنجارية في حين خفض النيابة العقدية. وP. melaninogenica. قبل يوم 6، والمجتمع تعافى ببطء إلى بنية المجتمع الانطلاق الأولي. وتشير النتائج إلى أن تقلبات لمحات الميكروبية في مريض واحد أكثر عرضة بسبب الاضطرابات المجتمع في الشعب الهوائية. وبالنظر إلى الاتساق بين ملامح الميكروبية المكتبات 16S rDNA وmetagenomes من DNA HL المشتقة، ونحن استبعد التحيز منشؤها من الاشعال 16S الرنا الريباسي المستخدمة في هذه الدراسة. أحد التفسيرات المحتملة للاختلافات في انحاء 16S rDNA للتصنيفلمحات آل المتولدة من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة (الشكل 3B) قد يكون وجود كميات عالية من أنواع الزائفة. DNA خارج الخلية بعد العلاج بالمضادات الحيوية. ويؤيد ذلك النتائج أن هذه الخلافات كانت الأكثر وضوحا في يوم 7، بعد ثلاثة أيام من العلاج بالمضادات الحيوية، والذي يستهدف الزائفة. بالإضافة إلى آخرين. يستخدم سيبروفلوكساسين عادة كعلاج الخط الأول في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي وP. المزمن العدوى الزنجارية على الرغم من الطيف نشاطها يشمل معظم مسببات الأمراض المرتبطة CF. لقد افترضنا أن العلاج بالمضادات الحيوية تقضي على المجتمعات عرضة بما في ذلك العقدية النيابة. وبالتالي خلق مكانة يشغلها مقاومة P. الزنجارية. الزائفة الزنجارية قد كسب المقاومة من خلال زيادة المجتمعات بيوفيلم ولقد ثبت DNA خارج الخلية ليكون الدعم الهيكلي الرئيسي للعمارة بيوفيلم لها 52. حتى مع رإنه بنية المجتمع استردادها، DNA خارج الخلية قد ظلت في CF البلغم. ولذلك، تشير هذه البيانات إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل الواردة في هذا العمل أن تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن DNA خارج الخلية أيضا المستمدة الميكروبية التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية. Metatranscriptomics A جودة عالية metatranscriptome يجب أن يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) تسلسل وتمثل أخذ العينات غير متحيزة للمحاضر المجتمع (مرنا). نظرا لنصف عمر قصير وكمية محدودة من مرنا، فمن الأهمية بمكان أن البروتوكول، كما وردت هنا، ويقلل من التعامل مع عينة لتحقيق أقصى قدر من عدد من النصوص استردادها. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. وتشمل هذه MICROB إثراء، RIBO-صفر، وعينة محددة ح مطروحybridizations 53 التي تستند التهجين قليل النوكليوتيد، و-ONLY مرنا المجموعة التي تقوم على النشاط الأنزيمي نوكلياز خارجية تستهدف RNA يحتوي على &quot;أحادي 5. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة مناهج لالتخصيب مرنا مثل MessageAmp كيت II-البكتيريا التي polyadenylates تفضيلي، ويضاعف RNA الخطي وتتوفر أيضا. وتستخدم بعض هذه الأساليب (مثل مرنا-ONLY، MICROB E إكسبرس وMessageAmp) في وقت واحد لتحقيق الكفاءة المثلى. ومع ذلك، فإن فعالية كل من هذه الطرق محدودة، وخاصة عند العمل مع المتدهورة جزئيا الريباسي، وكثيرا ما لوحظ في الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من عينات CF. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن استخدامها لتوليد metatranscriptomes تتألف من مرنا حقيقية النواة وبدائيات النواة. وبالإضافة إلى ذلك، أضاف بولي (A) الذيل لتسلسل قد يقلل من كمية البيانات تسلسل مفيدة. والمناطق التي تمتد المبلمر المتجانس تميل إلى أن انخفاض درجات الجودة، جausing عددا كبيرا من يقرأ لتتم تصفيته من قبل التسلسل والبرمجيات بعد التسلسل، ومتوسط ​​طول المفيد قراءة بعد التشذيب قبالة بولي سيتم تخفيض (A) ذيول بشكل كبير 54. التعامل مع المجتمعات الميكروبية CF معقدة وRNA المتدهورة جزئيا (أرقام 4A و 4C)، وأظهرت دراسة سابقة أن لدينا طريقة التهجين التقاط الذهب من قبل عدة RIBO-صفر كان أكثر فعالية في إزالة البشرية والميكروبية الريباسي مقارنة مع الجمع بين العلاج باستخدام مجموعات أخرى 9 (الجدول 3). يسمح البيانات الناتجة التحليل المتزامن لكلا المضيف البشري والنصوص الميكروبية. اعتمادا على المحصول ونوعية RNA، فضلا عن الاختيار النهائي من منصة التسلسل، وكثير من هذه العمليات بما في ذلك خطوة التوليف [كدنا يمكن تبسيط مع الجيل مكتبة التسلسل. على سبيل المثال، RIBO-صفر RNA المعالجة يمكن استخدامها لجعل metatranscriptome التسلسل برةريس باستخدام عدة ScriptSeq RNA تسلسل إعداد المكتبة. يوفر تحليل ميتاجينومية من المجتمعات المرتبطة الحيوان تمثيل شامل للكيان وظيفي شامل يتضمن المضيفة والمجتمعات المرتبطة بها. سير العمل المعروضة هنا هي قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من عينات المرتبطة الحيوان المعقدة، وخاصة تلك التي تحتوي على مخاط سميك، على كميات عالية من الحطام الخلية، والحمض النووي خارج الخلية والبروتينات والمجمعات بروتين سكري، وكذلك الخلايا المضيفة بالإضافة إلى المطلوب الميكروبية الفيروسية و الجسيمات. على الرغم من الجسيمات الفيروسية والجرثومية قد تفقد في كل خطوة، والجسيمات العزل وتنقية ضرورية لتقليل كمية من الحمض النووي المضيف. في حين يوفر بيانات metagenomics إمكانات التمثيل الغذائي للمجتمعات فحصها، metatranscriptomics تكمل هذا من خلال الكشف عن التعبير التفاضلية من الوظائف المشفرة 9. وقد أسفر تقييم شامل للعلم الجينوم والنصوص البيانات الإضافية الجديدةights لديناميات التفاعل المجتمعي ويسهل تطوير وتحسين العلاجات 9،10،55.

<html> وقد تم التحقيق في المجتمعات الفيروسية والجرثومية المرتبطة جسم الإنسان على نطاق واسع في العقد الماضي من خلال تطبيق تقنيات التسلسل 1،2. وقد أدت النتائج إلى الاعتراف الميكروبات أهمية في صحة الإنسان والمرض. وجاءت مبادرة رئيسية من المشروع الإنساني microbiome التي تصف البكتيريا (وبعض العتيقة) المقيمين على جلد الإنسان، وداخل تجاويف الفم والمجاري التنفسية والجهاز البولي التناسلي، والجهاز الهضمي 3. وقد أظهرت الدراسات microbiome مزيد من الخطوط الجوية البشرية السليمة من خلال غسل القصبات (BAL) 4،5 ومسحات البلعوم 4 أن الرئة يمكن أن تكون بمثابة جهاز أخذ العينات البيئية، والنتائج في الاستعمار الميكروبي عابرة في الشعب الهوائية. ومع ذلك، فإن تأثير الاستعمار الميكروبي في السطوح مجرى الهواء ضعاف يمكن أن يؤدي إلى التهابات الرئة الحادة والمزمنة، مثل تلك التي ظهرت في التليف الكيسي (CF) من المرضى. ر &quot;&gt; CF هو مرض وراثي مميت الناجمة عن طفرة في التليف الكيسي عبر الغشاء منظم (CFTR) الجينات 6. هذه الطفرات تؤدي إلى البروتينات CFTR المعيبة التي تؤثر بدورها على نقل أيون بطريق الظهارة عبر سطح قمية من ظهارة. ويؤثر هذا المرض نظم الجهاز متعددة، ولكن الغالبية العظمى من الوفيات والمراضة تعزى إلى أمراض الرئة CF 7. ويوفر CF الرئة نظام بيئي فريد من نوعه للاستعمار الميكروبي. وخلل في نقل أيون يسبب المخاط لبناء في الشعب الهوائية CF، وخلق microenvironments تتكون من الهوائية ، microaerophilic، ومقصورات اللاهوائية الراسية التي كتبها ثابت الغنية بالمغذيات سطح الغشاء المخاطي. تسهل هذه البيئة الاستعمار وانتشار الميكروبات، بما في ذلك الفيروسية والبكتيريا والفطريات. الحادة والالتهابات الرئوية المزمنة الميكروبية يؤدي إلى استجابات مناعية مستمرة ولكن غير فعالة، مما أدى إلى إعادة عرض واسعة مجرى الهواء، وفقدان القدرة الرئوية، وpulmo في نهاية المطاففشل نارى. المجتمعات البكتيرية المرتبطة CF الرئة وقد وصفت جيدا باستخدام كل الأساليب التي تعتمد على ثقافة والثقافة المستقلة، والتي تشمل استخدام 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) التسلسل الجيني 8 و metagenomics بندقية 9،10. النهج القائم على الرنا الريباسي-16S قادر على تميز مجموعة واسعة من الأنواع الميكروبية والتقاط تحولات واسعة في تنوع المجتمع. ومع ذلك، فإنه يقتصر في قرارها في تحديد المجتمعات (تلخيصها في كلايسون وآخرون. 2010 11 و) والتنبؤات من إمكانات التمثيل الغذائي تقتصر على تلك الوظائف العامة المعروفة لالأصناف التي تم تحديدها. ولذلك، 16S الرنا الريباسي طرق التسلسل الجيني غير كافية لالضرورية التصنيفية والوظيفية دقة تحليلية من المجتمعات الميكروبية المتنوعة الموجودة في CF الرئتين. النهج ميتاجينومية الموصوفة هنا يكمل النهج القائم على الرنا الريباسي-16S، يتغلب على حدودها، وتمكن وسيلة فعالة نسبيالتحليل كل من التصنيف المجتمع الميكروبي ومحتويات الوراثية في CF الرئتين. DNA الميكروبات المعزولة من عينات المرتبطة الحيوان غالبا ما يحتوي على كمية كبيرة من الحمض النووي المضيف. تحتوي البلغم أو أنسجة الرئة عينات CF عادة كمية كبيرة من الحمض النووي البشري الصادرة عن العدلات في الاستجابة المناعية، في كثير من الأحيان أكثر من 99٪ من إجمالي DNA 12-14. ورغم أن بعض الخلايا البشرية سليمة قد تكون موجودة، ومعظم هذه DNA هو حر في حل أو كثف على سطح الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود شمعات لزجة استثنائي المخاط، والحطام الخلوي، وغيرها من الملوثات غير معروفة تزيد من تعقيد عزل الخلايا الميكروبية. تم اختبار عدة طرق لالمستنفدة هذه عينات من الحمض النووي البشري، بما في ذلك التدرجات Percoll إلى الإنسان منفصل عن الخلايا الميكروبية 15، والمعاملة مع الدناز I، إيثيديوم بروميد monoazide أن تتحلل بشكل انتقائي DNA البشري 16، وعدة MolYsis، مع كل نجاح محدود.<html> حتى الآن إجراء تنقية الحمض النووي الميكروبي الأكثر فعالية لCF البلغم وكان التعديل من عملية وصفها بريتنستاين وآخرون (1995) 17. هذا النهج، والمعروف هنا كما منخفض التوتر طريقة تحلل (HL)، يستخدم مزيجا من β المركابتويثانول للحد من الميوسين السندات ثاني كبريتيد، تحلل منخفض التوتر من الخلايا حقيقية النواة، والدناز I علاج DNA للذوبان 9. وعلى الرغم من عدم وجود بدائل أثارت طريقة HL بعض المخاوف نظرا ل(ط) التحيزات المحتملة الناتجة عن تحلل غير المرغوب فيها من الميكروبات و (ب) ما إذا كانت التقلبات الملحوظة في تكوين المجتمع 9،10 هي قطعة أثرية من الاختلافات المرتبطة تجهيز العينات. بالإضافة إلى توليد metagenomes بندقية، نعالج هذه القضايا من خلال مقارنة ملامح الجينات 16S الرنا الريباسي من الحمض النووي DNA الكلي والجراثيم المستخرجة من طريقة HL باستخدام نفس مجموعة من عينات البلغم التي تم جمعها من مريض واحد في سبعة أيام متتالية. والأنف والحنجرة &quot;&gt; وبالمقارنة مع المجتمعات الميكروبية، وتوصيف المجتمعات الفيروسية المرتبطة مع الحيوانات محدود 18،19 اتسمت المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية فقط الحد الأدنى 20 - 22 أول دراسة ميتاجينومية تميز DNA المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية أظهرت أن معظم الفيروسات المرتبطة CF الرئتين هي فاجات 20، وكانت إمكانات التمثيل الغذائي من فج في CF والأفراد غير CF-اختلافا كبيرا. على وجه التحديد، قامت المجتمعات فج في الأفراد CF الجينات تعكس التعديلات المضيف البكتيرية لفسيولوجيا CF الهوائية، وأظهرت البكتيرية الفوعة 20. ميتاجينومية الدراسات اللاحقة للفيروسات في أنسجة الرئة CF التنوع المكاني واضح في المجتمعات الفيروسية بين المناطق التشريحية 22. وبالإضافة إلى ذلك، تؤوي الأنسجة CF الرئة أدنى التنوع الفيروسي لوحظ حتى الآن في أي نظام إيكولوجي 22. وكانت معظم الفيروسات التي تم تحديدها فاجاتمع احتمال أن تصيب مسببات الأمراض CF. ومع ذلك، تم الكشف أيضا الفيروسات مثل فيروس الهربس حقيقية النواة، الفيروسات الغدية، والفيروسات الورم الحليمي البشري (HPV). في حدث واحد، حيث لوحظت الخراجات في أنسجة الرئة أثناء تشريح، تم استرداد أكثر من 99٪ من الجينوم الورم الحليمي البشري، على الرغم من أن المريض تم تشخيص أبدا مع الورم الحليمي الرئوي أو سرطان. هذا يدل على أن التنوع الفيروسي الحاضر يعكس ليس فقط من شدة تلف الأنسجة، ولكن يمكن أيضا أن يعرض ويفسر مرض uncharacterized الأساسي. بروتوكولات الموصوفة هنا توفر طريقة بسيطة، لكنها قوية لعزل الجزيئات الفيروسية مثل (VLPs) من العينات التي تتكون من كميات كبيرة من المخاط السميك، المضيف والخلايا الميكروبية، DNA مجانا، فضلا عن الحطام الخلية. واستكمالا لmetagenomics، يتم استخدام metatranscriptomics لمراقبة ديناميكية في التعبير الجيني في جميع أنحاء المجتمع الميكروبي والمضيف 9،23. في هذه الحالة، سواء الميكروبية وملتحقار مرنا تحتاج إلى أن يتم اختيار تفضيلي. منذ لا مذيل بعديد الأدينيلات من mRNAs البكتيرية، لا يمكن استغلال مرنا طريقة المنسدلة مقرها بنسبة ضئيلة من DT. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن أن تستخدم في عينات المرتبطة المضيفة إذا ما يعرف العينات تحتوي على كميات كبيرة من مرنا حقيقية النواة. كثير من العينات المرتبطة الحيوان، بما في ذلك CF البلغم، وتحتوي على كثافة عالية من الخلايا، بالإضافة إلى كميات كبيرة من الحطام الخلوي وnucleases التي تشمل RNases. ولذلك، مهمة صعبة أخرى هي لمنع تدهور RNA واسعة النطاق خلال metatranscriptome المعالجة. في معظم الحالات، الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من البلغم CF هو المتدهورة جزئيا، مما يحد من التطبيقات المصب وفائدة من الحمض النووي الريبي مشتقة. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. فعالية هذه النهج ولكن يقتصر، وخاصة عند العمل مع متدهورة جزئيا الريباسي 9،24. الأساليب المستخدمة هنا تسمحإد لاسترجاع الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا مناسبة للكفاءة التحويلية الإجمالية إزالة الرنا الريباسي. وقد تجلى المقارنة المباشرة من كفاءة في إزالة الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا المقارنة بين اثنين من مجموعات مختلفة من قبل ليم وآخرون (2012) 9. وعموما، فإن الهدف من هذا المخطوط هو توفير مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد metagenomes بندقية الفيروسية والجرثومية، وmetatranscriptome، من عينة المرتبط حيوان واحد، وذلك باستخدام عينة البلغم الناجم عن كمثال على ذلك. وينبغي أن تتضمن سير العمل مختبر الجزيئية مناطق منفصلة قبل وبعد التضخيم للحد من التلوث المتبادل. أساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أنواع أخرى مثل عينة الأنسجة 22، البلعوم والفم والبلعوم مسحات 25، غسيل القصبات (BAL) والمرجان (بيانات غير منشورة). يجب معالجة كل عينة فور جمع وخصوصا عندما metagenomics الميكروبية والتقىوالمطلوب atranscriptomics الدراسات. إذا تم تجميد العينات، أنه يحد من عزل الخلايا الميكروبية سليمة لmetagenomes الميكروبي عن تجميد يحتمل تعطيل سلامة الخلية. ومع ذلك، لا يمنع تجميد metatranscriptomics والعزلة الفيروسية، ولكن نوعية من الحمض النووي الريبي وكمية من الجسيمات الفيروسية تعافى قد تتأثر من خلال عملية تجميد ذوبان الجليد. من المهم أن نلاحظ أن البلغم قد خدم يسببها كمصدر أساسي للعينات في العديد من الدراسات المرتبطة مع المرضى CF الكبار والأمراض الرئوية المزمنة الأخرى 26،27 كما BAL يمكن أن يكون الغازية أيضا. في دراساتنا، تم جمع عينات البلغم مع طريقة أخذ العينات دقيق وثابت، أي بعد غسول الفم والشطف من تجويف الفم باستخدام محلول ملحي معقم للحفاظ على تلوث الميكروبات عن طريق الفم داخل عينات البلغم إلى أدنى حد ممكن.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

إمكانية الوصول إلى الإنتاجية العالية التسلسل قد أحدثت ثورة العديد من مجالات علم الأحياء. من أجل فهم أفضل المجتمعات الفيروسية والميكروبية المصاحبة المضيفة، وقد تم تطوير سير عمل شامل لاستخراج DNA و RNA. سير العمل في وقت واحد يولد metagenomes الفيروسية والجرثومية، وكذلك metatranscriptomes، من عينة واحدة للجيل المقبل من التسلسل. اقتران هذه النهج يوفر لمحة عامة عن كل من الخصائص التصنيفية وظائف المجتمع المشفرة. طرق عرض استخدام التليف الكيسي (CF) البلغم، وهو نوع العينة إشكالية، لأنه لزج بشكل استثنائي ويحتوي على كمية عالية من mucins، DNA العدلات الحرة، وغيرها من الملوثات غير معروفة. بروتوكولات الموصوفة هنا تستهدف هذه المشاكل وبنجاح استعادة الحمض النووي الفيروسي والجرثومي مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي البشري. لاستكمال الدراسات metagenomics، تم تحسين بروتوكول metatranscriptomics لاسترداد كل من الجراثيمومرنا المضيف الذي يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) متواليات. ويقدم لمحة عامة عن خصائص البيانات لتكون بمثابة مرجعية لتقييم نجاح الأساليب. تم جمع عينات البلغم CF إضافية أيضا إلى (ط) تقييم اتساق ملامح microbiome عبر سبعة أيام متتالية داخل مريض واحد، و (ثانيا) مقارنة اتساق النهج ميتاجينومية إلى القائم على التسلسل الجيني RNA الريباسي 16S. وأظهرت النتائج أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية كان في حده الأدنى، وكانت ملامح تصنيف البكتيريا الشائعة المرتبطة CF-مماثل إلى حد كبير بين المكتبات 16S rDNA وmetagenomes المتولدة من تحلل منخفض التوتر (HL) DNA -derived. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين 16S rDNA ملامح تصنيفية ولدت من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة تشير إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن أيضا extracellul الميكروبية المشتقةDNA AR التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Views.  San Diego State University.  باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

تنقية DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام Miniprep Qiagen كيت

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

إجمالي تشريح المعدة من جراد البحر ، Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

وهناك طريقة HPLC Lectin لإثراء هضميدات انتقائية الغليكوزيلاتي من العينات البيولوجية المعقدة

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.