Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1 R01 GM095384-01) atribuído à Floresta Rohwer. Agradecemos Epicentro, uma empresa Illumina para fornecer acesso antecipado a kits Ribo-Zero Epidemiologia. Agradecemos Mark Hatay para a concepção e produção do suporte de tubos de ultracentrifugação. Agradecemos Andreas Haas e Benjamin Knowles para leituras críticas e discussões sobre o manuscrito, e Lauren Paul para auxiliar o processo de filmagem.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics virais As partículas virais são concentradas utilizando polietileno glicol (PEG) ou pequenos concentradores de volume. Em alguns casos, pode não ser necessária concentração, mas pré-filtração ou passos de centrifugação de baixa velocidade são usadas para remover as células eucarióticas e microbianas. Os lisados ​​virais será enriquecido e purificado utilizando ultracentrifugação de gradiente de densidade de 9,41 ou filtros de tamanho pequeno (por exemplo, 0,45 mm) para remover as células microbianas e eucarióticas grandes 25. Ultracentrifugação de gradiente de densidade é tipicamente realizada com soluções densos mas inertes, tais como sacarose ou cloreto de césio para isolar e concentrar as partículas virais 41. A separação física é baseada no tamanho e densidade de flutuação de partículas virais. Portanto, a escolha adequada do tamanho de poro do filtro e a rigorosa preparação de gradientes são essenciais para isolar as comunidades virais específicos, como o sucesso da recuperação físicaVLP determina a comunidade isolada 41 (isto é, partículas virais que não passam através do filtro ou queda na densidade de extracção não serão detectados no metagenome). Após o isolamento e concentração viral, pode haver contaminação material genómico não-viral presente na amostra, tanto na forma de ácidos nucleicos livres e microbiana e células eucarióticas. Portanto, é crítico para verificar a pureza de partículas virais em amostras (Figuras 1A e 1B). Um tratamento de clorofórmio é comumente utilizado para lisar as células remanescentes, seguido por tratamento com nuclease para degradar ácidos nucleicos livres antes da extracção do ácido nucleico. Uma advertência ao fluxo de trabalho apresentados foi a utilização de separação por gradiente de densidade para isolar partículas virais, uma vez que podem excluir partículas virais com invólucro que possam ser muito flutuante para entrar no gradiente de CsCl. Uma alternativa &quot;catch-all&quot; método é omitir a separ gradiente de densidadeção e isolar o DNA da comunidade dos 0,45 mm - filtrados tratados com clorofórmio e ADNase I. Esta abordagem é também apropriado para acomodar pequenos volumes de amostras, tais como aqueles a partir de esfregaços de sangue ou plasma. No entanto, isto pode resultar na contaminação bacteriana resistente ao clorofórmio e maior quantidade de ADN extracelular ADNase I resistente. Protocolos de seqüenciamento atuais requerem 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para a preparação biblioteca sequenciamento de DNA em que os rendimentos mais elevados proporcionar uma escolha mais ampla de opções de sequenciamento. A concentração de ADN de viromes geradas muitas vezes varia entre o limite inferior de detecção de mais do que 200 ng / mL. A quantidade de ácidos nucleicos virais recuperados podem ser insuficientes para a preparação da biblioteca de sequenciação directa. Em tais casos, a amplificação do ácido nucleico é essencial. Linker amplificação espingarda bibliotecas (LASLs) 2,42,43 e amplificação do genoma inteiro com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os doismétodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para sequenciamento. MDA métodos tais como aqueles baseados em phi29 polimerase de ADN são conhecidas por sofrer de viés de amplificação, e pode amplificar ADNcs e preferencialmente de ADN circular, resultando em taxonómico não quantitativo e caracterização funcional 44,45. Foi demonstrado uma versão optimizada do LASLs abordagem para introduzir apenas desvios mínimos, promove uma maior sensibilidade (para pequenas quantidades de material de partida), e é facilmente adaptado para diferentes plataformas de sequenciação 43. No entanto, a abordagem tem muitas etapas, requer equipamento especializado para minimizar a perda de DNA, e é limitado a modelos de dsDNA. No nosso laboratório, esta abordagem foi adaptada com sucesso para amplificar quantidade detectável e indetectável de DNA extraído a partir de lavage- broncoalveolar, e coral- VLP derivadas de água do mar (não publicadas e Hurwitz et ai. 46). Desenvolver pipelines de análise de dados tem classically sido um dos aspectos mais desafiadores da análise metagenômica viral devido à natureza altamente diversificada e em grande parte desconhecida das comunidades virais. Embora haja um número estimado de 10 8 genótipos virais na biosfera, até à data bases de dados virais atuais contêm ~ 4.000 genomas virais, o que é cerca de 1/100000 dessa diversidade viral total aproximado. Portanto, pesquisas baseadas em similaridade (como BLAST 47) para atribuição taxonômica e funcional em metagenomes virais possuem desafios inerentes. Muitas sequências de deixar de ter semelhanças significativas para genomas no banco de dados e, portanto, são classificados como desconhecido. Apesar de pesquisas baseadas em homologia são as aplicações mais importantes para a atribuição de taxonomia e função para a sequência de dados, abordagens alternativas com base na análise independente do banco de dados foram desenvolvidos 48- 50. Fancello et al. 51 fornecer uma revisão completa de ferramentas computacionais e algoritmos usados ​​em Viral metagenômica. Microbial Metagenomics Tipicamente, a quantidade total de DNA extraído a partir de comunidades microbianas tratados com lise hipotónica (HL-DNA) na gama de 20 ng a 5 mg. O rendimento é altamente dependente do estado de saúde do paciente e a quantidade de amostra de expectoração recolhida, o que explica as variações observadas na produção total de células HL-DNA extraído neste estudo (Tabela 2). Os passos críticos para gerar dados de sequência de boa qualidade dependem da qualidade de bibliotecas de sequenciação geradas. A Figura 2 mostra um intervalo de tamanho típico para as bibliotecas de sequenciação geradas a partir de ADN microbiano derivado de expectoração CF utilizando um procedimento de fragmentação de ADN baseada em enzimática. O tamanho óptimo biblioteca é dependente da escolha da plataforma de sequenciação e aplicação, e, por conseguinte, o processo de fragmentação pode ser optimizado, se necessário, através de métodos alternativos, tais como sonicação e a nebulização. Além deos resultados representativos apresentados, o sucesso do método apresentado na expectoração CF recolhidos a partir de vários doentes em vários pontos de tempo é também ilustrado na Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Estudos anteriores 9,10 sugerem que cada paciente abriga um conjunto exclusivo de comunidade microbiana que muda ao longo do tempo, refletindo assim a persistência dos principais jogadores dentro da comunidade enquanto as flutuações são provavelmente devido a perturbações, tais como tratamentos com antibióticos. Se essas flutuações ocorrem diariamente, mesmo sem perturbações externas ou devido ao processo de amostragem e processamento de amostras, ainda está em questão. Com base na metagenômico HL-ADN e análise amplicão ADNr 16S, a amostragem de 7 dias longitudinal mostra que a variação diária de perfis microbianas sem perturbação antibiótico (Dia 1, 2, e 3) foi mínima (Figuras 3A e 3B). Após a introduçãoprodução de antibióticos orais imediatamente após a amostragem Dia 3, mudanças no perfil da comunidade tornou-se evidente no dia 4. Enquanto o antibiótico ciprofloxacina atinge um amplo espectro de bactérias patogénicas conhecidas, tais como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Streptococcus pneumoniae, o tratamento aumentou a abundância relativa de P. aeruginosa, enquanto diminui o Streptococcus spp. e P. melaninogenica. By Day 6, a comunidade recuperou lentamente para a estrutura inicial da comunidade de partida. Os resultados sugerem que as flutuações de perfis microbianos dentro de um único paciente é mais provável devido a perturbações da comunidade nas vias aéreas. Dada a consistência entre os perfis microbianos de bibliotecas 16S rDNA e metagenomes de DNA HL-derivada, que descartou os preconceitos provenientes dos primers 16S rRNA utilizados neste estudo. Uma possível explicação para as diferenças observadas em toda 16S rDNA taxonômicoperfis al gerados a partir de ADN total e HL-ADN derivado (Figura 3B) pode ser a presença de quantidades elevadas de Pseudomonas spp. ADN extracelular após o tratamento antibiótico. Isto é apoiado pelas descobertas de que estas diferenças foram mais aparentes no dia 7, três dias após o tratamento antibiótico, que tem como alvo Pseudomonas spp. em adição aos outros. A ciprofloxacina é comumente usada como tratamento de primeira linha em pacientes com FC e P. crônica infecção aeruginosa, embora o seu espectro de atividade inclui a maioria dos patógenos associados à FC. Trabalhamos com a hipótese de que o tratamento com antibióticos erradica comunidades sensíveis, incluindo Streptococcus spp. e, portanto, criar um nicho preenchido por P. resistente aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa pode ganhar resistência, através do aumento de suas comunidades de biofilme e DNA extracelular foi mostrado para ser o principal suporte estrutural de sua arquitetura biofilme 52. Mesmo quando tele recuperou a estrutura da comunidade, DNA extracelular pode ter permanecido no CF escarro. Portanto, estes dados sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem apresentados neste fluxo de trabalho potencialmente beneficiar não só na remoção do ADN humano derivada, mas também ADN extracelular microbiana derivada que podem deturpar os perfis microbianas reais. Metatranscriptomics A alta qualidade metatranscriptome deve conter relativamente poucas sequências de RNA ribossomal (rRNA) e representam uma amostragem imparcial das transcrições da comunidade (mRNA). Devido à semi-vida curta e limitada quantidade de ARNm, é crítico que o protocolo, como apresentado aqui, reduz o manuseamento da amostra para maximizar o número de transcritos recuperados. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. Estes incluem Microb Enrich, Ribo-Zero, e específicas de cada amostra h subtrativoybridizations 53 que são baseados em hibridação de oligonucleótido, e o ARNm-kit APENAS que se baseia na actividade enzimática do RNA alvo contendo uma exonuclease &#39;monofosfato 5. Além disso, várias abordagens para enriquecimento de mRNA, tais como o MessageAmp Kit II-Bactérias que preferencialmente polyadenylates e amplifica ARN linear também estão disponíveis. Alguns destes métodos (por exemplo, de mRNA-ONLY, Microb E Xpress eo MessageAmp) são usadas simultaneamente para máxima eficiência. No entanto, a eficácia de todas estas abordagens estão limitadas, especialmente quando se trabalha com rRNA parcialmente degradado, como frequentemente observado no ARN total extraído de amostras de FC. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser usado para gerar metatranscriptomas consistindo de ARNm tanto eucarióticas e procarióticas. Além disso, o (A) da cauda poli adicionado às sequências pode reduz a quantidade de dados de sequências úteis. Regiões com trechos homopoliméricas tendem a ter menores escores de qualidade, causing um número significativo de lê para ser filtrados por sequenciação e software de pós-sequenciamento, e a duração média de leitura útil após o corte fora de poli (A) caudas serão significativamente reduzidos em 54. Lidar com as comunidades microbianas CF complexos e RNA parcialmente degradado (Figuras 4A e 4C), nosso estudo anterior mostrou que o método de captura de hibridização pelo kit Ouro Ribo-Zero foi mais eficaz na remoção tanto rRNA humano e microbiana em comparação com os combinam tratamentos com outros kits 9 (Tabela 3). Os dados resultantes permite a análise simultânea de ambos hospedeiro humano e transcritos microbianas. Dependendo do rendimento e qualidade do RNA, assim como a escolha final da plataforma de sequenciamento, muitos desses processos, incluindo o passo a síntese de cDNA podem ser simplificados, com geração biblioteca seqüenciamento. Por exemplo, o ARN tratado Ribo-Zero pode ser usado para fazer a sequenciação metatranscriptome libraries utilizando o kit RNA-Seq ScriptSeq Biblioteca Preparação. Análise metagenômica de comunidades associadas a animais fornece uma representação abrangente da entidade funcional global que inclui o acolhimento e de suas comunidades associadas. O fluxo de trabalho aqui apresentado é adaptável a uma variedade de amostras associado a animais complexos, especialmente aqueles que contêm muco espesso, grandes quantidades de resíduos celulares, o DNA extracelular, proteínas e complexos de glicoproteína, bem como células hospedeiras para além do microbiano e viral desejado partículas. Mesmo que as partículas virais e microbianas podem ser perdidos a cada passo, as partículas de isolamento e purificação são essenciais para minimizar a quantidade de ADN do hospedeiro. Enquanto os dados metagenomics fornece potenciais metabólicas das comunidades examinados, metatranscriptomics complementar esta revelando a expressão diferencial de funções codificadas 9. Uma avaliação abrangente dos dados genómica e transcrições rendeu novas insireitos à dinâmica das interações com a comunidade e facilita o desenvolvimento de terapias melhorando 9,10,55.

<html> Comunidades virais e microbianas associadas com o corpo humano têm sido investigados extensivamente na última década, através da aplicação de tecnologias de sequenciamento 1,2. Os resultados conduziram ao reconhecimento dos micróbios importância na saúde humana e da doença. A principal iniciativa partiu do projeto humano microbiome que descreve as bactérias (e alguns archaea) residentes na pele humana, e dentro de cavidades orais, vias respiratórias, trato urogenital e do tracto gastrointestinal 3. Mais estudos microbioma de saudáveis ​​vias respiratórias humanas através de lavado bronco-alveolar (BAL) 4,5 e swabs de nasofaringe 4 demonstraram que o pulmão pode servir como um dispositivo de recolha de amostras ambientais, resulta na colonização microbiana transitória nas vias aéreas. No entanto, o impacto da colonização microbiana em superfícies das vias respiratórias com deficiência pode levar a infecções pulmonares graves e crónicos, tais como as observadas em pacientes de fibrose cística (FC). t &quot;&gt; CF é uma doença genética letal causada pela mutação no regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) 6. Estas mutações dão origem a proteínas CFTR defeituoso que por sua vez afecta o transporte de iões transepitelial através da superfície apical do epitélio. A doença afecta múltiplos sistemas orgânicos, mas a maioria de mortalidade e morbidade é atribuível à doença pulmonar FC 7. A CF pulmão fornece um ecossistema único para a colonização microbiana. O defeito no transporte de íons provoca muco para acumular-se nas vias aéreas CF, criando microambientes que consistem em aeróbia , microaerofilia, e compartimentos anaeróbios ancorados por uma superfície mucosa rico em nutrientes estática. Esta ambiente facilita a colonização e proliferação de micróbios, incluindo bactérias, vírus, e fungos. aguda e infecções microbianas pulmonares crónicas levam a respostas imunitárias constantes mas ineficaz, resultando em extensa remodelação das vias respiratórias, a perda de capacidade pulmonar, e, finalmente, pulmoinsuficiência pulmonar. Comunidades bacterianas associadas com a CF de pulmão foram bem descritas por meio de abordagens cultura-dependentes e independentes de cultivo, que incluem usando 16S RNA ribossomal (rRNA) sequenciamento gene 8 e metagenomics espingarda 9,10. A abordagem baseada em rRNA 16S é capaz de caracterizar uma vasta gama de espécies microbianas e capturar grandes mudanças na diversidade comunidade. No entanto, ele é limitado em sua resolução na definição das comunidades (resumidos na Claesson et al. 11, 2010) e as previsões de potenciais metabólicas se limitam a essas funções gerais conhecidos para a taxa identificados. Portanto, 16S rRNA métodos de sequenciação do gene são insuficientes para a precisão analítica taxonômica e funcional necessária das diversas comunidades microbianas presentes nos pulmões de FC. A abordagem metagenômica descrito aqui complementa a abordagem baseada em rRNA 16S, supera suas limitações, e permite uma maneira relativamente eficazpara analisar tanto a taxonomia comunidade microbiana e conteúdo genéticas nos pulmões com FC. ADN microbiana isolada a partir de amostras associado a animais, muitas vezes contém uma grande quantidade de ADN do hospedeiro. Expectoração ou amostras de tecido de pulmão com FC geralmente contêm uma grande quantidade de ADN libertado pelos neutrófilos humanos na resposta imune, muitas vezes, maior do que 99% do DNA total de 12 - 14. Embora algumas células humanas intactas pode estar presente, a maior parte deste ADN é livre em solução ou adsorvido à superfície de micróbios. Além disso, a presença de tampões de muco viscoso excepcionalmente, detritos celulares e outros contaminantes desconhecidos complicam ainda mais o isolamento de células microbianas. Vários métodos foram testados para empobrecer a estas amostras de ADN humano, incluindo gradientes de Percoll a humano a partir de células microbianas separado 15, o tratamento com DNase I, o brometo de etídio monoazide para degradar selectivamente DNA humano 16, e o kit MolYsis, tudo com sucesso limitado.<html> Até à data, o processo mais eficiente de purificação de ADN microbiano para expectoração de FQ foi uma modificação do processo descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Esta abordagem, aqui conhecido como método de lise hipotónico (HL), utiliza uma combinação de β-mercaptoetanol para a redução de mucina ligações dissulfureto, lise hipotónica de células eucarióticas, e tratamento com DNase I de ADN solúvel 9. Apesar da falta de alternativas ao método HL levantou algumas preocupações devido a (i) possíveis vieses resultantes da lise indesejada de micróbios e (ii) se as flutuações observadas na composição da comunidade 9,10 são um artefato de variações associadas com o processamento da amostra. Para além da geração de metagenomes espingarda, que abordar estes problemas, comparando os perfis de genes de rRNA 16S e o ADN total extraído a partir de DNA microbiano do método HL utilizando o mesmo conjunto de amostras de expectoração recolhidos a partir de um único paciente em sete dias consecutivos. ent &quot;&gt; Em comparação com as comunidades microbianas, a caracterização das comunidades virais associados com animais é limitado 18,19 As comunidades virais em CF das vias aéreas só foram caracterizadas minimamente 20 -.. 22 O primeiro estudo metagenômico caracterizar o DNA de comunidades virais em CF das vias aéreas mostraram que a maioria dos vírus associados com os pulmões com FC são fagos 20. O potencial metabólico de fago na FQ e indivíduos sem FC foi significativamente diferente. Especificamente, as comunidades de fagos em indivíduos com FC realizada genes reflectora de adaptações hospedeiras bacterianas para a fisiologia de CF das vias aéreas, e virulência 20. metagenomic estudos subsequentes bacterianas do vírus no tecido pulmonar FC demonstrou heterogeneidade espacial distinto de comunidades virais entre as regiões anatômicas 22. Além disso, o tecido pulmonar FC abrigou a diversidade viral menor observado até agora em qualquer ecossistema 22. A maioria dos vírus identificados foram fagoscom o potencial para infectar patógenos CF. No entanto, os vírus eucarióticos como o vírus do herpes, adenovírus e vírus do papiloma humano (HPV) foram também detectadas. Em um caso, onde foram observados quistos no tecido do pulmão durante a dissecção, mais de 99% de um genoma de vírus do papiloma humano foi recuperado, mesmo que o paciente nunca foi diagnosticado com um papiloma ou carcinoma pulmonar. Isso indica que a diversidade viral presente reflete não só a gravidade dos danos nos tecidos, mas também pode expor e explicar uma doença uncharacterized subjacente. Os protocolos descritos aqui fornecer uma maneira simples, mas poderosa para isolar partículas virais (VLPs) a partir de amostras que consistem em grandes quantidades de muco espesso, de acolhimento e células microbianas, DNA livre, bem como restos celulares. Complementando metagenômica, metatranscriptomics é usado para monitorar a dinâmica na expressão gênica em toda a comunidade microbiana e o anfitrião 9,23. Neste caso, tanto microbiana e host ARNm devem ser preferencialmente seleccionado. Uma vez que os mRNAs não estão poliadenilados bacterianas, um ARNm método suspenso baseado em oligo-dT, não pode ser explorado. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser utilizado em amostras associadas hospedeiras-se as amostras são conhecidas por conter grandes quantidades de ARNm eucariota. Muitas amostras associado a animais, expectoração de FQ, contêm uma elevada densidade de células, para além de grandes quantidades de detritos celulares e nucleases que incluem as RNases. Assim, outro desafio é evitar uma forte degradação do RNA durante metatranscriptome processamento. Na maioria dos casos, o RNA total extraído de expectoração CF é parcialmente degradado, o que limita as aplicações a jusante e utilidade do ARN derivado. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. A eficácia dessas abordagens se limita, contudo, especialmente quando se trabalha com parcialmente degradada rRNA 9,24. Os métodos empregados aqui permitired para a recuperação de RNA total parcialmente degradada adequado para jusante remoção total rRNA eficiente. A comparação directa da eficiência de remoção de rRNA a partir de ARN total parcialmente degradado comparando dois conjuntos diferentes foi ilustrada por Lim et ai. (2012) 9. No geral, o objetivo deste artigo é o de fornecer um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar metagenomes espingarda virais e microbianas, e um metatranscriptome, a partir de uma única amostra associada ao animal, utilizando amostra de escarro induzido como um exemplo. Fluxo do laboratório molecular deverá incluir as áreas de pré e de pós-amplificação separados para minimizar a contaminação cruzada. Os métodos são facilmente adaptáveis ​​a outros tipos de amostras, tais como o tecido 22, nasofaringe e orofaringe cotonetes 25, a lavagem broncoalveolar (BAL) e de coral (dados não publicados). Cada amostra deve ser processado imediatamente após a coleta, especialmente quando metagenomics microbianas e conheceuatranscriptomics estudos são desejados. Se as amostras foram congeladas, que limita o isolamento de células microbianas intactas para metagenomes microbianos como o congelamento potencialmente romper a integridade da célula. No entanto, o congelamento não exclui metatranscriptomics e isolamento viral, mas a qualidade do ARN e da quantidade de partículas virais recuperados podem ser afectadas pelo processo de congelação-descongelação. É importante notar que a expectoração induzida tem servido como fonte primária de amostras em muitos estudos associados a pacientes adultos e outras doenças pulmonares crônicas 26,27 como BAL pode ser muito invasivo. Em nossos estudos, amostras de escarro foram coletadas com um método de amostragem cuidadosa e consistente, ou seja, na sequência de bochechos e lavagem da cavidade oral, utilizando solução salina estéril para manter a contaminação micróbios orais dentro das amostras de escarro para um mínimo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

A acessibilidade de high-throughput seqüenciamento revolucionou muitas áreas da biologia. A fim de entender melhor as comunidades microbianas associadas virais e do hospedeiro, um fluxo de trabalho abrangente para a extração de DNA e RNA foi desenvolvido. O fluxo de trabalho ao mesmo tempo gera metagenomes virais e microbianas, assim como metatranscriptomas, a partir de uma única amostra para o sequenciamento de próxima geração. O acoplamento destas abordagens fornece uma visão geral de ambas as características taxonómicas e as funções de comunidade codificado. Os métodos apresentados usar Fibrose Cística (FC) expectoração, um tipo de amostra problemático, porque é extremamente viscosa e contém uma quantidade elevada de mucinas, ADN livre de neutrófilos, e outros contaminantes desconhecidos. Os protocolos descritos aqui direcionar esses problemas e com sucesso recuperar DNA viral e microbiana com a contaminação de DNA humano mínima. Para complementar os estudos Metagenômica, um protocolo metatranscriptomics foi otimizado para recuperar tanto microbianae mRNA host que contém relativamente poucas seqüências de RNA ribossômico (rRNA). Uma visão geral das características dos dados é apresentada para servir de referência para avaliar o sucesso dos métodos. Amostras adicionais CF escarro também foram coletadas para (i) avaliar a consistência dos perfis microbioma em sete dias consecutivos dentro de um único paciente, e (ii) comparar a consistência da abordagem metagenômica para a sequenciação à base de gene 16S RNA ribossomal. Os resultados mostraram que a flutuação diária das perfis microbianas sem perturbação antibiótico foi mínimo e os perfis de taxonomia das bactérias comuns associadas CF eram altamente semelhantes entre as bibliotecas 16S rDNA e metagenomes gerados a partir do DNA -derived lise hipotônica (HL). No entanto, as diferenças entre os perfis taxonómicas 16S rDNA gerado a partir de ADN total e HL-ADN derivado sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem em beneficiar não só a remoção do ADN de origem humana, mas também extracellul-microbiana derivadaDNA ar que podem deturpar os perfis microbianos reais.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K visualizações.  San Diego State University.  Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais. 

Vídeo: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Biologia

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissecação bruta do Estômago da lagosta, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...