Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) Forest Rohwer ausgezeichnet unterstützt. Wir danken Epicentre, ein Illumina Unternehmen für die Bereitstellung frühzeitigen Zugang zu Ribo-Zero Epidemiologie Kits. Wir danken Mark Hatay für das Design und die Herstellung der Ultrazentrifuge Rohrhalter. Wir danken Andreas Haas und Benjamin Knowles für kritische Lesungen und Diskussionen des Manuskripts und Paul Lauren zur Unterstützung der Dreharbeiten.

The authors have nothing to disclose.

Viral Metagenomics Viruspartikel konzentriert werden unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) Fällung oder kleinvolumigen Konzentratoren. In einigen Fällen kann die Konzentration nicht benötigt werden, aber pre-Filtration oder langsame Zentrifugation Schritte werden verwendet, um eukaryontische mikrobielle Zellen zu entfernen. Viral Lysate weiter angereichert und mit Dichtegradientenzentrifugation 9,41 oder kleiner Größe Filter (zB 0,45 um) zu eukaryotischen und großen mikrobiellen Zellen 25 zu entfernen. Gereinigt werden Dichtegradientenzentrifugation wird typischerweise mit dichten aber inerten Lösungen, wie Saccharose oder Cäsiumchlorid zur Isolierung und Konzentration viraler Partikel 41 durchgeführt. Physikalische Trennung wird von der Größe und Auftriebsdichte von viralen Partikel. Daher richtige Wahl der Filterfeinheit und der strengen Vorbereitung der Gradienten sind unerlässlich, um spezifische virale Isolation der Gemeinden, wie der Erfolg der physischen WiederherstellungVLPs bestimmt die Gemeinschaft isoliert 41 (dh Viruspartikel, die nicht durch den Filter oder fallen in den Entnahmedichte bestehen, werden nicht in der Metagenom erkannt werden). Nach virale Isolation und Konzentration kann es sein kontaminierenden in der Probe sowohl in Form von freien Nukleinsäuren und mikrobielle und eukaryotischen Zellen nicht-viralen vorliegenden genomischen Materials. Daher ist es wichtig, die Reinheit des Viruspartikeln in Proben (1A und 1B) zu verifizieren. Eine Chloroform-Behandlung wird üblicherweise verwendet, um die verbleibenden Zellen, gefolgt von Nukleasebehandlung um freie Nucleinsäuren vor der Extraktion von Nukleinsäuren abbauen lysieren. Eine Einschränkung auf die dargestellte Arbeitsablauf war der Einsatz von Dichtegradiententrennung, um virale Partikel zu isolieren, wie es umhüllten Viruspartikeln, die zu Auftriebs die CsCl Gradienten betreten können, auszuschließen. Eine Alternative &quot;Catch-all&quot; Verfahren ist es, den Dichtegradienten getr weglassenation und zu isolieren, die Community-DNA aus den 0,45 um - Filtrate mit Chloroform und DNase I. Dieser Ansatz behandelt wird, ist es angezeigt, einen kleinen Probenvolumina, wie sie aus Abstrichen oder Blutplasma unterzubringen. Jedoch kann dies in Chloroform-resistenten bakteriellen Kontamination und höhere Menge an DNase I beständigen extrazelluläre DNA führen. Aktuelle Sequenzierungsprotokolle erfordern 1 ng bis 1 ug von Nukleinsäuren zur Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung wodurch höhere DNA-Ausbeuten eine größere Auswahl an Optionen Sequenzierung. Die DNA-Konzentration der erzeugten viromes oft im Bereich von unterhalb der Nachweisgrenze von mehr als 200 ng / &amp; mgr; l. Die Höhe der viralen Nukleinsäuren erholt reicht möglicherweise nicht zur direkten Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung sein. In solchen Fällen ist die Nukleinsäure-Amplifikation von wesentlicher Bedeutung. Linker Verstärkung Schrotflinte-Bibliotheken (LASLs) 2,42,43 und Amplifikation des gesamten Genoms auf der Basis mehrerer Displacement Amplification (MDA) sind die beidenVerfahren am häufigsten verwendet werden, um ausreichende DNA für die Sequenzierung zu erzeugen. MDA Verfahren, wie sie anhand von Phi29 DNA-Polymerase ist bekannt, dass aus der Amplifikation spannt leiden und können bevorzugt amplifizieren ssDNA und kreisförmige DNA, was zu einer nicht quantitativen taxonomischen und funktionelle Charakterisierung 44,45. Eine optimierte Version des LASLs Ansatz hat sich gezeigt, dass nur minimale Verzerrungen einführen, fördert die höhere Empfindlichkeit (für kleine Mengen an Ausgangsmaterial), und ist leicht für verschiedene Sequenzierplattformen 43 angepasst. Jedoch weist der Ansatz viele Schritte, erfordert spezielle Ausrüstung, um DNA Verlust zu minimieren, und ist auf dsDNA Vorlagen. In unserem Labor wurde dieser Ansatz erfolgreich eingerichtet ist, nachweisbar und nicht nachweisbaren Menge von bronchoalveolären lavage-, Korallen-und seewasser abgeleitete VLPs (unveröffentlicht und Hurwitz et al. 46) extrahierte DNA zu amplifizieren. Entwicklung von Datenanalyse-Pipelines hat classically einer der schwierigsten Aspekte der Virus Metagenom-Analyse aufgrund der sehr unterschiedlichen und weitgehend unbekannten Natur der viralen Gemeinden. Zwar gibt es schätzungsweise 10 8 viralen Genotypen in der Biosphäre bis heute aktuellen Virendatenbanken enthalten ~ 4.000 viralen Genomen, die etwa 1 / 100.000 dieser ungefähren Gesamt virale Vielfalt ist. Daher Ähnlichkeit basierte Suchen (wie BLAST 47) für taxonomische und funktionelle Zuordnung der Virus Metagenomen besitzen inhärente Herausforderungen. Viele Sequenzen nicht zu signifikanten Ähnlichkeiten mit Genomen in der Datenbank haben, und deshalb werden als unbekannt eingestuft. Obwohl Homologie-basierte Suchanfragen sind die wichtigsten Anwendungen für die Zuordnung von Taxonomie und funktionieren, um Daten zu sequenzieren, wurden alternative Ansätze, die auf datenbankunabhängige Analyse entwickelt 48- 50. Fancello et al. 51 eine vollständige Überprüfung des Rechentools und Algorithmen in Vira verwendetl Metagenomik. Mikrobielle Metagenomics Typischerweise liegt die Gesamtmenge an DNA aus hypotonische Lyse behandelt Mikroorganismengemeinschaften (HL-DNA) extrahiert im Bereich von 20 ng bis 5 ug. Die Ausbeute ist stark abhängig von den Gesundheitszustand und die Menge der Sputumprobe gesammelt, welche die Variationen in der Gesamtausbeute in dieser Studie (Tabelle 2) extrahiert HL-DNA gesehen erklärt des Patienten. Die entscheidenden Schritte zur Erzeugung guter Qualität Sequenzdaten verlassen sich auf die Qualität der Sequenzierungsbibliotheken generiert. Abbildung 2 zeigt eine typische Größenbereich für die Sequenzierungsbibliotheken von CF Sputum abgeleitete mikrobielle DNA, die unter Verwendung eines enzymatischen-basierte DNA-Fragmentierung Verfahren. Die optimale Größe der Bibliothek ist abhängig von der Wahl des Sequenzierungsplattform und der Anwendung, und daher kann das Fragmentierungsverfahren optimiert werden, falls erforderlich, durch alternative Methoden wie Ultraschallbehandlung und Vernebelung. Zusätzlich zudie dargestellten repräsentativen Ergebnissen, der Erfolg des vorgestellten Verfahrens auf CF Sputum von mehreren Patienten über mehrere Zeitpunkte erfasst werden auch in Lim et al (2012). 9 dargestellt, und Lim et al. (2014) 10. Frühere Studien deuten darauf hin, 9,10, dass jeder Patient birgt eine einzigartige Reihe von mikrobiellen Gemeinschaft, die im Laufe der Zeit verschiebt, wodurch das Fortbestehen der Hauptakteure in der Gemeinschaft widerspiegelt, während Schwankungen dürften wegen Störungen wie Antibiotika. Ob diese Schwankungen auftreten, täglich auch ohne äußere Störungen oder aufgrund von Stichprobenverfahren und Probenverarbeitung, ist immer noch in Frage. Basierend auf der HL-DNA metagenomic und 16S rDNA Amplikon Analyse zeigt die 7-Tage-Längs Abtastung, dass die tägliche Schwankung des mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Perturbation (Tag 1, 2 und 3) war minimal (3A und 3B). Nach IntroHerstellung von oralen Antibiotika unmittelbar nach dem 3. Tag Probenahme wurde Änderungen in der Community-Profil offensichtlich an Tag 4. Während das Antibiotikum Ciprofloxacin zielt auf ein breites Spektrum an bekannten bakteriellen Erreger wie P. aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae, erhöhte die Behandlung der relativen Häufigkeit von P. aeruginosa während die Verringerung der Streptococcus spp. und P. melaninogenica. Mit dem 6. Tag, die Gemeinschaft wieder langsam in die Anfangsstartgemeinschaftsstruktur. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Schwankungen der mikrobiellen Profile innerhalb eines einzelnen Patienten mit größerer Wahrscheinlichkeit aufgrund Community Störungen in den Atemwegen. Angesichts der Kohärenz zwischen den mikrobiellen Profile der 16S rDNA Bibliotheken und Metagenomen von HL-abgeleitete DNA, auszuschließen wir die Vorurteile von den in dieser Studie verwendeten 16S-rRNA-Primer Ursprung. Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomische gesehenal Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA (3B) erzeugt wird, kann die Anwesenheit von hohen Mengen von Pseudomonas spp. extrazelluläre DNA nach der Behandlung mit Antibiotika. Dies wird durch die Ergebnisse gestützt, dass diese Unterschiede wurden am Tag 7 am deutlichsten, drei Tage nach der Behandlung mit Antibiotika, die Pseudomonas spp abzielt. neben anderen. Ciprofloxacin ist allgemein als First-Line-Behandlung bei Patienten mit CF und chronischer P. verwendet aeruginosa-Infektion, obwohl seine Wirkungsspektrum umfasst die meisten CF-assoziierter Krankheitserreger. Wir nahmen an, dass die Behandlung mit Antibiotika rottet anfälliger Gemeinschaften einschließlich Streptococcus spp. und damit die Schaffung einer Nische durch resistente P. gefüllt aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kann Widerstand durch Erhöhung der Biofilmgemeinschaften zu gewinnen und die extrazelluläre DNA wurde gezeigt, daß die wichtigsten strukturellen Unterstützung seiner Biofilmarchitektur 52 sein. Schon als ter Gemeinschaftsstruktur wiederhergestellt, extrazelluläre DNA kann auf der CF-Sputum geblieben. Deshalb lassen diese Daten vermuten, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte in diesem Arbeitsablauf dargestellt potentiell nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch auf Basis mikrobieller extrazellulären DNA, die die tatsächliche mikrobielle Profile verdrehen kann. Metatranscriptomics Eine hochwertige metatranscriptome sollte relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthalten und stellen eine unvoreingenommene Probenahme der Gemeinschaft Transkripte (mRNA). Aufgrund der kurzen Halbwertszeit und begrenzte Menge an mRNA, ist es entscheidend, dass das Protokoll, wie es hier dargestellt, minimiert Probenhandhabung, die Anzahl von Transkripten gewonnen maximieren. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Dazu gehören Microb Enrich, Ribo-Zero und probenspezifische subtraktiven hybridizations 53, die auf Oligonukleotid-Hybridisierung und der mRNA-ONLY-Kit, das auf Exonuklease enzymatische Aktivität Ziel RNA eine 5&#39;-Monophosphat enthält, basiert beruhen. Außerdem sind auch verschiedene Ansätze zur mRNA Anreicherungen wie MessageAmp II-Bakterien Kit, das vorzugsweise polyadenylates und verstärkt linearen RNA vorhanden. Einige dieser Verfahren (beispielsweise mRNA-ONLY, Microb E Xpress und MessageAmp) gleichzeitig für eine optimale Effizienz verwendet. Allerdings ist die Wirksamkeit aller dieser Ansätze begrenzt sind, besonders beim Arbeiten mit teilabgebauten rRNA, wie oft in Gesamt-RNA aus CF Proben extrahiert beobachtet. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation kann nicht zur metatranscriptomes bestehend sowohl eukaryontische als auch prokaryontische mRNA zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Poly (A) -Schwanz hinzugefügt, um die Sequenzen kann die Menge an nützlichen Sequenzdaten reduziert. Regionen mit Homo Strecken tendenziell niedrigere Qualität Partituren haben, cAStarten eine bedeutende Anzahl von Lesevorgängen, die von Sequenzierung und Post-Sequenzer-Software, und die durchschnittliche Nutzungsleselänge nach dem Schneiden aus Poly gefiltert werden (A) Schwanz deutlich 54 reduziert werden. Der Umgang mit komplexen CF mikrobieller Gemeinschaften und teilweise abgebauten RNA (4A und 4C), unsere frühere Studie zeigte, dass die Hybridisierungs-Capture-Methode durch die Ribo-Zero Gold-Kits war wirksamer bei der Entfernung von Mensch und Mikroben rRNA im Vergleich zu den zu kombinieren Behandlungen mit anderen Kits 9 (Tabelle 3). Die sich ergebenden Daten ermöglicht die gleichzeitige Analyse von sowohl menschlichen Wirt und mikrobielle Transkripte. In Abhängigkeit von der Ausbeute und Qualität der RNA sowie ultimative Wahl für Sequenzierungsplattform, können viele dieser Prozesse einschließlich der cDNA-Synthese mit Schritt Sequenzierung Bibliothek Generation gestrafft werden. Beispielsweise kann Ribo-Zero behandelten RNA verwendet werden, um metatranscriptome Sequenzierung Waage machenries mit ScriptSeq RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kit. Metagenom-Analyse von Tier-assoziierten Gemeinden bietet eine umfassende Darstellung des Gesamtfunktionseinheit, die den Host und die zugehörigen Gemeinden umfasst. Die hier vorgestellte Arbeitsablauf ist an eine Vielzahl von komplexen Tierassoziierten Proben, insbesondere solche, zähen Schleim, große Mengen von Zelltrümmern, extrazellulären DNA, Protein und Glycoprotein-Komplexe, sowie Wirtszellen neben dem gewünschten viralen und mikrobiellen enthalten Partikel. Obwohl virale und mikrobielle Partikel können bei jedem Schritt verloren werden Partikel der Isolierung und Reinigung sind für die Menge der Wirts-DNA zu minimieren. Während die Metagenomik Daten bietet metabolische Potentiale der untersuchten Gemeinden metatranscriptomics diese ergänzen durch die Enthüllung der differentiellen Expression von codierten Funktionen 9. Eine umfassende Beurteilung der Genomik und Transkripte Daten neu ins ergabüge auf die Dynamik der Gemeinschaft Interaktionen und erleichtert die Entwicklung von Therapien verbessern 9,10,55.

<html> Virus- und Bakteriengemeinschaften mit dem menschlichen Körper verbunden sind ausführlich in den letzten zehn Jahren durch den Einsatz von 1,2-Sequenzierungstechnologien untersucht. Die Ergebnisse wurden auf die Anerkennung der Bedeutung Mikroben im menschlichen Gesundheit und Krankheit geführt. Die große Initiative kam von der Normalflora-Projekt, das die Bakterien beschrieben (und einigen Archaeen), die sich auf der menschlichen Haut und in Mundhöhle, Atemwege, des Urogenitaltraktes und Magen-Darm-3. Weitere microbiome Studien von gesunden menschlichen Atemwege durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) 4,5 und Nasen-Rachen-Abstrichen 4 haben gezeigt, dass die Lunge als Umweltprobenahmevorrichtung, führt zu transienten mikrobiellen Besiedlung der Atemwege dienen. Allerdings können die Auswirkungen der mikrobiellen Besiedlung in beeinträchtigt Atemwegsoberflächen zu schweren und chronischen Infektionen der Lunge, wie sie bei zystischer Fibrose (CF) Patienten gesehen führen. t &quot;&gt; CF ist eine tödliche Krankheit, die durch genetische Mutation in Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) -Gen 6 verursacht wird. Diese Mutationen führen zu fehlerhaften CFTR-Proteine, die sich ihrerseits auf den transepithelialen Ionentransport durch die apikale Oberfläche des Epithels. Die Krankheit betrifft mehrere Organsysteme, aber die Mehrheit der Mortalität und Morbidität ist auf CF Lungenerkrankung 7. Der CF Lunge bietet ein einzigartiges Ökosystem für mikrobielle Besiedlung. Der Defekt in Ionentransport verursacht Schleim in den Atemwegen CF aufzubauen, wodurch Mikroumgebungen bestehend aus Aerobic- , mikroaerophilen und anaeroben Abteile durch eine statische nährstoffreichen Schleimhautoberfläche verankert. Diese Umgebung ermöglicht die Ansiedlung und Vermehrung von Mikroben, wie Viren, Bakterien und Pilze. Akute und chronische Lungen mikrobiellen Infektionen führen zu konstant, aber unwirksam Immunantworten, was zu umfangreiche Umbau der Atemwege, Verlust der Lungenkapazität und letztlich Pulmonary Versagen. Bakteriengemeinschaften mit der CF-Lunge verbunden sind gut beschrieben mit beiden Kultur-abhängigen und kulturunabhängige Ansätze, die mit 16S ribosomale RNA (rRNA) Gensequenzierung 8 und Schrotflinte Metagenomik 9,10 umfassen. Das 16S-rRNA-basierten Ansatz in der Lage, eine breite Palette von Mikrobenarten zu charakterisieren und zu erfassen breiten Verschiebungen Community Vielfalt. Es wird jedoch in seiner Entschließung bei der Festlegung der Gemeinschaften begrenzt (in Claesson et al zusammengefasst. 2010 11) und die Vorhersagen von Stoffwechselpotentiale zu diesen allgemeinen Funktionen für die Taxa identifiziert bekannte begrenzt. Daher sind 16S-rRNA-Gen-Sequenzierungsverfahren nicht ausreichend für die notwendige taxonomische und funktionelle analytische Genauigkeit der verschiedenen Mikroben in CF Lunge vorhanden Gemeinden. Die hier beschriebene Metagenom-Ansatz ergänzt die 16S-rRNA-basierten Ansatz, überwindet seine Grenzen, und ermöglicht eine relativ effektive Artum sowohl die mikrobielle Gemeinschaft Taxonomie und genetische Inhalte in CF Lungen analysieren. Mikrobielle DNA aus Tierassoziierte Proben isoliert enthält häufig eine große Menge an Wirts-DNA. CF Sputum oder Lungengewebeproben enthalten üblicherweise eine große Menge von Human-DNA durch Neutrophile bei der Immunreaktion freigesetzt wird, häufig mehr als 99% der Gesamt-DNA von 12 bis 14. Obwohl einige intakte humane Zellen vorhanden sein können, die meisten dieser DNA frei in Lösung oder an der Oberfläche der Keime adsorbieren. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von außerordentlich viskose Schleimpfropfen, Zelltrümmern und anderen unbekannten Verunreinigungen weiter zu komplizieren Isolierung von mikrobiellen Zellen. Mehrere Verfahren wurden zur Abreicherung diese Proben menschlicher DNA, einschließlich Percoll Gradienten verschiedener menschlicher aus mikrobiellen Zellen 15, die Behandlung mit DNase I, Ethidiumbromid Monoazid um selektiv menschliche DNA 16 und die MolYsis Kit, alle mit begrenztem Erfolg verschlechtern getestet.<html> Um eine möglichst wirkungsvolle mikrobiellen DNA Reinigungsverfahren für CF Sputum Termin wurde eine Modifikation der von Breitenstein et al beschriebenen Verfahren (1995). 17. Dieser Ansatz, der hierin als hypotonische Lyse (HL) Verfahren bekannt ist, verwendet eine Kombination von β-Mercaptoethanol Mucin Disulfidbindungen hypotonische Lyse von eukaryotischen Zellen und DNase I-Behandlung von löslichen DNA 9 reduzieren. Trotz des Mangels an Alternativen der HL Verfahren Anlass zu Bedenken wegen (i) mögliche Verzerrungen von unerwünschten Lyse von Mikroben und (ii) resultierenden, ob die beobachteten Schwankungen der Gemeinschaft Zusammensetzung 9,10 sind ein Artefakt der Varianten mit der Probe assoziiert ist. Zusätzlich zu der Erzeugung von Shotgun metagenomes sprechen wir diese Probleme durch Vergleich der 16S-rRNA-Gen-Profile der gesamten DNA und der HL-Methode unter Verwendung des gleichen Satzes von Sputum-Proben von einem Patienten in sieben aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt extrahierte mikrobielle DNA. ent &quot;&gt; Im Vergleich zu mikrobiellen Gemeinschaften, ist die Charakterisierung von viralen Gemeinden mit Tieren verbunden begrenzte 18,19 Die viralen Gemeinden in CF Atemwege haben nur minimal 20 gekennzeichnet worden -.. 22 Die erste Metagenom-Studie die Charakterisierung der DNA von viralen Gemeinden in CF Atemwege zeigten, dass die meisten Viren mit CF Lunge assoziiert sind Phagen 20. Die metabolische Potential des Phagen in CF und nicht-CF Individuen signifikant verschieden war. Insbesondere die Phage Gemeinschaften in Einzelpersonen CF geführt Gene reflektierende bakterieller Wirts Anpassungen an die Physiologie des CF Atemwege, und bakteriellen Virulenz 20. Im Anschluss Metagenom-Untersuchungen von Viren in CF Lungengewebe zeigten deutliche räumliche Heterogenität der Virus Gemeinden zwischen anatomischen Regionen 22. Darüber hinaus hegte CF Lungengewebe die niedrigste bisher in jedem Ökosystem 22 beobachtet virale Vielfalt. Die meisten Viren identifiziert wurden Phagenmit dem Potential, CF Pathogenen zu infizieren. Jedoch wurden eukaryotischen Viren, wie Herpes-Viren, Adenoviren und menschlichen Papilloma-Viren (HPV) erkannt. In einem Fall, wo Zysten im Lungengewebe wurden bei der Präparation beobachtet wurde, wurde mehr als 99% eines menschlichen Papillomavirus-Genom gewonnen, obwohl der Patient noch nie mit einem Lungen Papillom oder Karzinom diagnostiziert. Dies zeigt, dass die Virus bestehenden Vielfalt spiegelt nicht nur die Schwere der Gewebeschädigung, kann aber auch aussetzen und zu erklären, eine zugrunde liegende nicht charakterisierte Krankheit. Die hier beschriebenen Protokolle bieten eine einfache, aber leistungsfähige Methode, um Virusähnlichen Partikeln (VLPs) von Proben, die von großen Mengen zähen Schleim, Host und mikrobiellen Zellen, freie DNA sowie Zelltrümmer aus isolieren. Ergänzend Metagenomik ist metatranscriptomics verwendet, um die Dynamik in der Genexpression in der mikrobiellen Gemeinschaft und dem Host 9,23 überwachen. In diesem Fall werden sowohl mikrobielle und Host mRNA müssen bevorzugt ausgewählt werden. Da bakterielle mRNAs nicht polyadenyliert kann ein Oligo-dT-basierten mRNA-Pulldown-Verfahren nicht genutzt werden. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation nicht in Host-assoziierte Proben verwendet werden, wenn die Proben bekannt, große Mengen von eukaryotischen mRNA enthält. Viele Tierassoziierte Proben, einschließlich CF Sputum, enthalten eine hohe Dichte der Zellen zusätzlich zu hohe Mengen von Zelltrümmern und Nukleasen, die RNasen einschließen. Daher ist eine weitere Herausforderung umfangreiche RNA-Abbau während der Verarbeitung zu verhindern metatranscriptome. In den meisten Fällen ist der Gesamt-RNA aus CF Sputum extrahiert teilabgebauten, Begrenzen der nachfolgenden Anwendungen und Nutzen des abgeleiteten RNA. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Die Wirksamkeit dieser Ansätze ist jedoch begrenzt, vor allem bei der Arbeit mit teilweise abgebaut rRNA 9,24. Die hier eingesetzten Verfahren erlaubened für das Abfragen von partiell abgebaute Gesamt-RNA für eine effiziente nachgeschaltete Gesamt rRNA Entfernung. Direkter Vergleich der Effizienz in rRNA Entfernung aus teilabgebauten gesamten RNA Vergleich von zwei verschiedenen Kits wurde von Lim et al veranschaulicht. (2012) 9. Insgesamt ist es das Ziel dieses Manuskripts zu einem kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1), um virale und mikrobielle shotgun metagenomes erzeugen und eine metatranscriptome bereitzustellen, aus einem einzigen Tier assoziierten Probe unter Verwendung induzierter Sputumprobe als Beispiel. Molekulare Labor-Workflow sollten getrennt vor und nach Verstärkung Bereiche umfassen, um eine Kreuzkontamination zu minimieren. Die Methoden sind einfach an anderen Probentypen wie Gewebe 22, Nasen-Rachen-und Oropharynxabstriche 25, Bronchiallavage (BAL) und Korallen (unveröffentlichte Daten). Jede Probe sollte sofort nach der Entnahme verarbeitet vor allem, wenn mikrobielle Metagenomik und eingehalten werdenatranscriptomics Studien erwünscht. Wenn die Proben eingefroren, schränkt sie die Isolierung der intakten mikrobiellen Zellen auf mikrobielle Metagenomen das Einfrieren möglicherweise zu einer Störung der Zellintegrität. Allerdings bedeutet Gefrieren nicht metatranscriptomics und Virusisolierung, aber die Qualität der RNA und der Menge von Viruspartikeln gewonnen kann durch die Frost-Tau-Prozeß betroffen auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass induzierten Sputum hat als primäre Quelle der Proben in vielen Studien mit erwachsenen CF-Patienten und anderen chronischen Lungenerkrankungen 26,27 verbunden als BAL kann zu invasiv werden serviert. In unseren Studien wurden Sputum-Proben mit einer sorgfältigen und konsistenten Methode, dh, nach Mundwasser und Spülen der Mundhöhle mit steriler Kochsalzlösung zur oralen Mikroorganismen Kontamination innerhalb der Sputum-Proben auf ein Minimum gesammelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

Die Zugänglichkeit der Hochdurchsatz-Sequenzierung hat viele Bereiche der Biologie revolutioniert. Um Host-assoziierten viralen und mikrobiellen Gemeinschaften besser zu verstehen, wurde ein umfassendes Workflow für die DNA- und RNA-Extraktion entwickelt. Der Workflow gleichzeitig erzeugt viralen und mikrobiellen Metagenomen sowie metatranscriptomes, aus einer einzigen Probe für Next-Generation-Sequencing. Die Kopplung dieser Ansätze bietet einen Überblick über sowohl die taxonomischen Eigenschaften und den Community-Funktionen codiert. Die vorgestellten Methoden Mukoviszidose (CF) Sputum, eine problematische Probentyp, weil es außerordentlich zäh und enthält hohe Menge an Schleimstoffen, frei von Neutrophilen DNA und andere unbekannte Verunreinigungen. Die hier beschriebenen Protokolle zielen diese Probleme und erfolgreich wiederherzustellen viralen und mikrobiellen DNA mit minimaler menschlicher DNA-Kontamination. Um die Metagenomik Studien zu ergänzen, wurde eine metatranscriptomics Protokoll optimiert, um sowohl die mikrobielle erholenund Host-mRNA, die nur relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthält. Eine Übersicht über die Datenmerkmale wird präsentiert, um als Referenz für die Beurteilung des Erfolgs der Methoden dienen. Zusätzliche CF Sputum-Proben wurden auch auf (i) die Konsistenz der microbiome Profile in sieben aufeinander folgenden Tagen zu bewerten innerhalb eines einzelnen Patienten, und (ii) Vergleichen der Konsistenz von Metagenom-Ansatz zu einer ribosomalen 16S-RNA-Gen-basierte Sequenzierung gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine tägliche Schwankung mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Störung war minimal und die Taxonomie Profile der gemeinsamen CF-assoziierten Bakterien waren sehr ähnlich zwischen den 16S rDNA-Bibliotheken und metagenomes vom hypotonische Lyse (HL) stammenden DNA erzeugt. Jedoch sind die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomischen Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA erzeugt vorschlagen, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch mikrobielle extracellular DNA, die die tatsächlichen mikrobiellen Profile falsch darstellen kann.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Aufrufe.  San Diego State University.  Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren. 

Serie: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Forschung

Biologie

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Gross Dissection der Magen der Lobster, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

A Lectin HPLC-Methode zur selektiven glykosylierte Peptide aus komplexen biologischen Proben Enrich

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...