עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1 R01 GM095384-01) הוענק ליער Rohwer. אנו מודים Epicentre, חברת Illumina למתן גישה מוקדמת לערכות Ribo-אפס לאפידמיולוגיה. אנו מודים למארק Hatay לעיצוב והייצור של בעל צינור ultracentrifugation. אנו מודים אנדריאס האס ובנימין נואלס לקריאה ודיונים של כתב היד קריטיים, ולורן פול לסיוע לתהליך הצילום.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics ויראלי חלקיקים נגיפיים מרוכזים באמצעות פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) או ריכוז נפח קטן. במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך בריכוז, אבל מראש סינון או צעדי צנטריפוגה במהירות נמוכים משמשים להסרת תאים האיקריוטים וחיידקים. lysates ויראלי יהיה מועשר יותר ומטוהר באמצעות ultracentrifugation צפיפות שיפוע 9,41 או מסנני גודל קטנים (למשל, 0.45 מיקרומטר) להסרת תאי חיידקים האיקריוטים וגדולים 25. ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבוצע בדרך כלל עם פתרונות צפופים אבל אינרטי כגון כלוריד סוכרוז או צזיום לבודד ולהתרכז חלקיקים נגיפיים 41. הפרדה פיזית מבוססת על הגודל וצפיפות קלילה של חלקיקים נגיפיים. לכן, בחירה נכונה של גודל נקבובית מסנן וההכנה הקפדנית של מילויים הן חיוניים לבודד את הקהילות נגיפיות ספציפיות, כמו ההצלחה של ההתאוששות הפיסית שלVLPs קובע את הקהילה מבודדת 41 (כלומר, חלקיקים נגיפיים שאינו עוברים דרך המסנן או נפילה בתוך צפיפות החילוץ לא יזוהה בmetagenome). לאחר בידוד וריכוז נגיפיים, ייתכנו זיהום נוכחי חומר הגנומי שאינו נגיפי במדגם הן בצורה של חומצות גרעין וחופשיות של חיידקים ותאים האיקריוטים. לכן, זה קריטי כדי לוודא את טוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (איורים 1 א ו -1 B). טיפול כלורופורם משמש בדרך כלל לlyse תאים הנותרים, ואחריו טיפול nuclease להשפיל חומצות גרעין חופשיות לפני מיצוי חומצות גרעין. אזהרה לעבודה שהוצגה הייתה השימוש בהפרדת שיפוע צפיפות לבודד חלקיקים נגיפיים כפי שהוא עשוי לכלול חלקיקים נגיפיים עטפו שעשויה להיות קליל מדי כדי להזין את שיפוע CsCl. חלופי &quot;לתפוס את כל-&quot; השיטה היא להשמיט separ שיפוע הצפיפותation ולבודד את ה- DNA הקהילה מ0.45 מיקרומטר - filtrates טופל בכלורופורם וDNase I. גישה זו היא גם מתאים כדי להתאים כרכי מדגם קטנים כמו אלה ממטליות או פלזמה דם. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של DNA תאי DNase I-עמיד. פרוטוקולי רצף הנוכחיים דורשים 1 ng עד 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין להכנת ספריית רצף לפי תשואות DNA גבוהות יותר לספק מבחר רחב יותר של אפשרויות סידור. ריכוז ה- DNA של viromes נוצר לעתים קרובות נע בין מתחת לסף הגילוי ליותר מ -200 ng / μl. הסכום של חומצות גרעין נגיפיות התאוששו עשוי להיות מספיק להכנת ספריית רצף ישירה. במקרים כאלה, הגברה חומצות גרעין היא חיונית. ספריות הגברה רובה לינקר (LASLs) 2,42,43 והגברת הגנום כולו מבוססת על הגברה עקירה מרובה (מד&quot;א) הן שנישיטות נפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק עבור סידור. שיטות מד&quot;א כגון אלה המבוססים על DNA פולימרז Phi29 ידועות סובלות מהטיות הגברה, ואולי מעדיפים להגביר ssDNA וDNA המעגלי, וכתוצאה מכך המיון שונה שאינו כמותיים ואפיון פונקציונלי 44,45. גרסה מותאמת של גישת LASLs הוכח להציג רק הטיות מינימליות, מקדמת רגישות גבוהה יותר (לכמויות קטנות של חומר מוצא), והוא מותאם בקלות לפלטפורמות שונות רצף 43. עם זאת, יש לו את הגישה שלבים רבים, דורשת ציוד מיוחד כדי להקטין את איבוד DNA, ומוגבל לתבניות dsDNA. במעבדה שלנו, גישה זו הותאמה בהצלחה להגברת כמות לזיהוי וגילוי של DNA שחולץ מlavage- רונכואלוואולרית, VLPs coral- וים-נגזרים המים (לא פורסם והורביץ et al. 46). יש לפתח צינורות ניתוח נתונים CLAssically היה אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של ניתוח metagenomics הנגיפי בשל האופי המגוון מאוד וידוע ברובם של קהילות ויראלי. אמנם יש 10 8 גנוטיפים מוערכים נגיפיים בביוספרה, למאגרי מידע נגיפיים הנוכחיים תאריך להכיל ~ 4,000 הגנום נגיפי, שזה בערך 1 / 100,000 של גיוון נגיפי כולל משוער זה. לכן, חיפושים מבוססי דמיון (כגון תפציץ 47) למשימה הטקסונומי ופונקציונלית בmetagenomes הנגיפי יש אתגרים הגלומים. רצפים רבים נכשלים יש קווי דמיון משמעותיים לגנומים באתר, ולכן, מסווגים כידועים. למרות חיפושים מבוססי הומולוגיה הם היישומים החשובים ביותר לצורך קביעת טקסונומיה ולתפקד רצף נתונים, גישות חלופיות המבוססות על ניתוח של מסדי נתונים עצמאיים פותחו -48 50. Fancello et al. 51 מספקים סקירה של כלים חישוביים ואלגוריתמים המשמשים בVira מלאהmetagenomics l. החיידקים metagenomics בדרך כלל, את הסכום הכולל של ה- DNA שחולץ מקהילות hypotonic טופל תמוגה חיידקים (HL-DNA) נע בין 20 ng עד 5 מיקרוגרם. התשואה תלויה מאוד במצב בריאותו של המטופל ואת כמות מדגם ליחה שנאסף, מה שמסביר את השינויים ראו בתשואה הכוללת של HL-DNA שחולץ במחקר זה (טבלה 2). השלבים הקריטיים כדי להפיק נתונים רצף איכות טובה להסתמך על האיכות של ספריות רצף שנוצרו. איור 2 מציג מגוון גודל אופייני לספריות רצף שנוצרו מה- DNA של חיידקים שמקורם בכיח CF באמצעות הליך פיצול ה- DNA מבוסס האנזימטית. גודל הספרייה האופטימלי תלוי בבחירה של פלטפורמת רצף ויישום, ולכן, יכול להיות מותאם הליך הפיצול, במידת צורך, דרך גישות חלופיות כגון sonication ועִרפּוּל. בנוסף לתוצאות הנציג הציגו, ההצלחה של השיטה המוצגת בכיח CF שנאסף מחולים מרובים על פני נקודות זמן מרובות היא גם מאוירת באל Lim et. (2012) 9 וLim et al. (2014) 10. מחקרים קודמים 9,10 מציעים שכל חולה מטפח קבוצה ייחודית של קהילת חיידקים שעוברת לאורך זמן, ובכך משקף את ההתמדה של השחקנים המרכזיים בקהילה תוך תנודות צפויות עקב הפרעות כגון טיפולים אנטיביוטיים. אם תנודות אלה מתרחשות מדי יום גם ללא הפרעות חיצוניות או בשל שיטת דגימה ועיבוד מדגם, עדיין בשאלה. בהתבסס על metagenomic HL-DNA וניתוח amplicon 16S rDNA, דגימת אורך 7 הימים מראה כי התנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיות (יום 1, 2, ו -3) היה מינימאלי (איורים 3 א ו 3 ב &#39;). על introduction של אנטיביוטיקה דרך הפה מייד לאחר דגימת יום 3, שינויים בפרופיל הקהילה התבררו ביום 4. בעוד ציפרופלוקסצין האנטיביוטיקה מיועד למגוון רחב של חיידקים פתוגנים ידועים כגון P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, ודלקת ריאות Streptococcus, הטיפול הגדילו את השפע היחסי של P. aeruginosa תוך הפחתת spp Streptococcus. ופ melaninogenica. לפי יום 6, הקהילה התאוששה לאט למבנה קהילת המוצא הראשוני. התוצאות מצביעות על כך שתנודות של פרופילים של חיידקים בתוך מטופל אחד יש סיכוי גבוה יותר בשל הפרעות קהילה בדרכי הנשימה. בהתחשב בעקביות בין פרופילי חיידקים של ספריות 16S rDNA וmetagenomes מDNA נגזר HL, שללנו ההטיות שמקורן בפריימרים 16S rRNA שימשו במחקר זה. הסבר אפשרי אחד להבדלים לראות פני הטקסונומית 16S rDNAפרופילי אל שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 3) עשויים להיות הנוכחות של כמויות גבוהות של spp Pseudomonas. DNA תאי לאחר הטיפול האנטיביוטי. זו נתמכת על ידי הממצאים שההבדלים אלה היו בולטים ביותר ביום 7, שלושה ימים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, אשר מטרות spp Pseudomonas. בנוסף לאחרים. ציפרופלוקסצין משמש בדרך כלל כטיפול הקו הראשון בחולים עם CF ופ הכרוני זיהום aeruginosa למרות שהספקטרום של פעילותה כולל את רוב פתוגנים הקשורים CF. חוקרים שערנו כי הטיפול האנטיביוטי מבטל קהילות רגישות כולל spp Streptococcus. ולכן יצירת נישה מולא על ידי פ &#39;עמיד aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa עשוי להרוויח התנגדות באמצעות הגדלת קהילות biofilm וDNA תאי הוכח להיות התמיכה המבנית העיקרית של אדריכלות biofilm 52. אפילו כtהוא מבנה הקהילה התאושש, DNA תאי אולי נשאר בכיח CF. לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שתמוגה hypotonic ושלבי הכביסה שהוצגו בעבודה זו עשויה להיות תועלת בכך שלא להסיר את ה- DNA המופק רק בני האדם, אבל DNA תאי גם הנגזרות של חיידקים שעלולות לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל. Metatranscriptomics איכות גבוהה metatranscriptome צריכה להכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA) ומייצגת דגימה משוחדת של תמלילי הקהילה (mRNA). בשל זמן מחצית החיים קצרים וכמות מוגבלת של mRNA, זה קריטי, כי הפרוטוקול, כפי שהוצג כאן, ממזער טיפול מדגם כדי למקסם את המספר של תמלילים התאוששו. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. אלה כוללים MICROB להעשיר, Ribo-אפס, ומדגם ספציפי h תוסףybridizations 53 המבוססים על הכלאת oligonucleotide, וmRNA בלבד הערכה המבוססת על RNA מיקוד הפעילות האנזימטית exonuclease מכיל monophosphate 5 &#39;. בנוסף, מספר גישות למוספים לmRNA כגון ערכת II-החיידקים MessageAmp שמעדיף polyadenylates ומגביר RNA ליניארי זמינות גם. חלק מהשיטות הללו (למשל, mRNA בלבד, Xpress MICROB E וMessageAmp) משמש במקביל ליעילות אופטימלית. עם זאת, היעילות של כל הגישות הללו מוגבלות, במיוחד כשעובדים עם rRNA המושפל באופן חלקי, כפי שנצפה לעתים קרובות בסך RNA שחולץ מן דגימות CF. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בם כדי ליצור metatranscriptomes מורכב משני mRNA אוקריוטים ופרוקריוטים. בנוסף, פולי הזנב () הוסיף לרצפים רשאי מפחית את כמות נתוני רצף שימושיים. אזורים עם מתיחות homopolymer נוטים לקבל ציוני איכות נמוכות יותר, גausing מספר משמעותי של קורא ליסונן על ידי רצף ותוכנה שלאחר רצף-, ואורך הקריאה השימושי הממוצע לאחר זמירה מפולי זנבות () יקטנו באופן משמעותי 54. התמודדות עם קהילות מורכבות של חיידקים CF ו- RNA המושפל באופן חלקי (איורים 4 א ו4C), המחקר הקודם שלנו הראה כי שיטת הכלאה-ידי לכידת ערכת זהב Ribo-Zero הייתה יותר יעילה בהסרת שני rRNA האדם וחיידקים בהשוואה לטיפולים משלבים שימוש ב ערכות אחרות 9 (לוח 3). נתונים כתוצאה מאפשר ניתוח מקביל של שני מארח אנושי ותמלילים של חיידקים. בהתאם לתפוקה והאיכות של RNA, כמו גם בחירה אולטימטיבית של פלטפורמת רצף, רב של תהליכים אלה כוללים את צעד סינתזת cDNA יכול להיות יעיל עם דור ספריית רצף. לדוגמא, RNA טופל Ribo-אפס יכול לשמש להכנת libra רצף metatranscriptomeריס באמצעות ערכת ScriptSeq RNA-Seq ספריית הכנה. ניתוח metagenomic של הקהילות הקשורים לבעלי חיים מספק ייצוג מקיף של הישות התפקודית הכוללת הכוללת את המארח והקהילות הקשורים אליו. העבודה שהוצגה כאן היא להתאמה למגוון של דוגמאות הקשורים לבעלי חיים מורכבים, במיוחד אלה המכילים ריר סמיך, כמויות גבוהות של פסולת תא, DNA תאי, חלבון ומתחמי גליקופרוטאין, כמו גם תאי מארח בנוסף לחיידקים ויראליים והרצויים חלקיקים. למרות שחלקיקים נגיפיים וחיידקים עלולים ללכת לאיבוד בכל שלב, חלקיקי בידוד וטיהור חיוניים כדי למזער את כמות ה- DNA מארח. בעוד נתוני metagenomics מספק פוטנציאל המטבולי של הקהילות שנבדקו, metatranscriptomics להשלים זאת על ידי חושף את ביטוי ההפרש של פונקציות מקודדות 9. הערכה מקיפה של נתונים גנומיקה ותמלילים הניבה תוספות חדשותights לדינמיקה של אינטראקציה קהילתית ומקל על פיתוח טיפולים לשיפור 9,10,55.

<html> קהילות ויראלי וחיידקים הקשורים לגוף האדם נחקרו בהרחבה בעשור האחרון באמצעות היישום של טכנולוגיות רצף 1,2. התוצאות הובילו להכרה בחשיבות החיידקים בבריאות ומחלות של בני אדם. היוזמה העיקרית הגיעה מהפרויקט האנושי Microbiome המתאר את החיידקים (וגם כמה חיידקים קדומים) המתגורר בעור אדם, ובתוך חלל פה, דרכי הנשימה, בדרכי מין ושתן, ומערכת עיכול 3. מחקרי Microbiome נוספים של דרכי הנשימה של אדם בריא באמצעות שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) 4,5 ומטליות אף ולוע 4 הראו כי הריאות יכולות לשמש כמכשיר דגימה סביבתי, תוצאות בקולוניזציה של חיידקים חולפים בדרך הנשימה. עם זאת, ההשפעה של קולוניזציה חיידקים במשטחים בדרכי נשימה לקויה יכולה לגרום לזיהומי ריאות חמורים וכרוניים, כגון אלה שראו בסיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים. t &quot;&gt; CF הוא מחלה גנטית קטלנית הנגרמת על ידי המוטציה בסיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור (CFTR) גן 6. מוטציות אלה להצמיח חלבוני CFTR פגומים שבתורו משפיע על הובלת יון transepithelial פני משטח הפסגה של האפיתל. המחלה פוגעת מספר רב של מערכות איברים, אבל הרוב המכריע של תמותה ותחלואה מיוחסת למחלת ריאות CF 7. CF הריאות מספקת מערכת אקולוגית ייחודית להתיישבות חיידקים. הפגם בהובלת יון גורם ריר לבנות בדרכי נשימת CF, יצירת מייקרו-הסביבות מורכבות של אירובי , Microaerophilic, ותאים אנאירוביים מעוגנים על ידי משטח הרירי עשירים בחומרים מזין סטטי. סביבה זו מאפשרת התישבות ושגשוגם של חיידקים, כולל, חיידקים, ופטריות נגיפיות. אקוטי וזיהומי חיידקי ריאה כרוניים להוביל לתגובות חיסוניים קבועות, אבל לא אפקטיביות, וכתוצאה מכך שיפוץ נרחב בדרכי נשימה, אובדן כושר ריאות, ובסופו pulmoכישלון nary. קהילות חיידקים הקשורים לריאות CF תוארו גם באמצעות שני גישות תלויות התרבות ותרבות העצמאית, הכוללים שימוש ב16S RNA ריבוזומלי (rRNA) רצף של גנים 8 וmetagenomics רובה 9,10. הגישה מבוססת-rRNA 16S היא מסוגלת לאפיין מגוון רחב של מינים של חיידקים וללכוד משמרות רחבות במגוון קהילה. עם זאת, הוא מוגבל בהחלטתה בהגדרת הקהילות (מסוכם בClaesson et al. 2010 11) והתחזיות של פוטנציאלי חילוף חומרים מוגבלות לפונקציות הכלליות אלה ידועים למינים שזוהו. לכן, שיטות לקביעת רצף גן 16S rRNA אינן מספיקות לדיוק האנליטי הטקסונומי ופונקציונלי ההכרחי של קהילות חיידקים השונות הנמצאות בריאות CF. גישת metagenomic המתוארת כאן משלימה את הגישה מבוססת-rRNA 16S, מתגברת על המגבלות שלו, ומאפשרת דרך יעילה יחסיתכדי לנתח את שתי טקסונומיה קהילת חיידקים ותוכן גנטי בריאות CF. DNA של חיידקים שבודדו מהדגימות הקשורים לבעלי חיים לעתים קרובות מכיל כמות גדולה של DNA מארח. דגימות כיח או רקמת הריאה CF מכילות בדרך כלל כמות גדולה של DNA האנושי שפורסמה על ידי נויטרופילים בתגובה החיסונית, לעתים קרובות יותר מ- 99% של ה- DNA הכולל 12 - 14. למרות שחלק מתאים אנושיים שלמים יכולים להיות נוכחים, רוב ה- DNA הזה הוא חופשי בפתרון או את הספיחה של חיידקים. בנוסף, הנוכחות של תקעים צמיגים במיוחד ריר, סלולרית פסולת ומזהמים ידועים אחרים לסבך עוד יותר את הבידוד של תאי חיידקים. כמה שיטות נבדקו למדלדלות דגימות אלה של ה- DNA האנושי, כוללים שיפועי Percoll לאדם נפרד מתאי חיידקים 15, הטיפול בDNase אני, ethidium ברומיד monoazide להשפיל DNA האנושי 16, וערכת MolYsis, כל עם הצלחה מוגבלת באופן סלקטיבי.<html> עד כה הליך טיהור DNA של חיידקים היעילים ביותר לליחת CF כבר שינוי של התהליך שתואר על ידי Breitenstein et al. (1995) 17. גישה זו, במסמך הידוע בשם שיטת hypotonic תמוגה (HL), משתמשת בשילוב של β-mercaptoethanol כדי להפחית אג&quot;ח mucin דיסולפיד, תמוגה hypotonic של תאים האיקריוטים, ואני DNase טיפול בDNA המסיס 9. למרות חוסר חלופות שיטת HL העלתה חששות בשל (i) הטיות אפשריות הנובעות מתמוגה לא רצויה של חיידקים ו( ii) אם התנודות שנצפו בהרכב קהילת 9,10 הם תוצר של תנודות הקשורות לעיבוד המדגם. בנוסף לדור של metagenomes רובה, אנו לטפל בבעיות אלה על ידי השוואת הפרופילים גנטי 16S rRNA של DNA הכולל וDNA של חיידקים שחולץ מן שיטת HL באמצעות אותה הקבוצה של דגימות כיח שנאספו ממטופל אחד על פני שבעה ימים רצופים. אף אוזן גרון &quot;&gt; בהשוואה לקהילות חיידקים, האפיון של קהילות נגיפיות הקשורים לבעלי חיים הוא מוגבל 18,19 קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF יש רק מאופיינות מינימאלית 20 -.. 22 המחקר metagenomic הראשון המאפיין את ה- DNA של קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF הראה כי רוב הווירוסים הקשורים לריאות CF הם פאגים 20. הפוטנציאל המטבולי של הפאג בCF ויחידים שאינם CF היה שונה באופן משמעותי. באופן ספציפי, קהילות הפאג באנשי CF נשאו גנים רעיוני של עיבודי מארח חיידקים לפיסיולוגיה של דרכי הנשימה CF, ומחקרי חיידקי ארסיות 20. לאחר metagenomic של וירוסים ברקמת הריאה CF הפגינו ההטרוגניות המרחבית שונה של קהילות נגיפיות בין אזורים אנטומיים 22. בנוסף, רקמת הריאה CF טיפחה את המגוון הנגיפי הנמוך ביותר שנצפה עד כה בכל מערכת אקולוגית 22. רוב הווירוסים שזוהו היו פאגיםעם הפוטנציאל להדביק פתוגנים CF. עם זאת, וירוסים האיקריוטים כגון herpesviruses, אדנו-וירוסים, ווירוסי הפפילומה אנושיים (HPV) היו גם זוהו. באירוע אחד, שבו ציסטות ברקמת הריאה נצפו במהלך נתיחה, יותר מ 99% מהגנום וירוס הפפילומה אנושי היה התאושש, למרות שהמטופל מעולם לא אובחן עם הפפילומה או קרצינומה של ריאות. זה מצביע על כך הווה הגיוון הנגיפי משקף לא רק את חומרת נזק לרקמות, אלא גם עלול לחשוף ולהסביר מחלה uncharacterized בסיסית. הפרוטוקולים שתוארו כאן מספקים דרך פשוטה, אך רבת עוצמה לבודד את חלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs) מדגימות שמורכבות מכמויות גדולות של ריר סמיך, מארח ותאי חיידקים, DNA החופשי, כמו גם פסולת תא. משלים metagenomics, metatranscriptomics משמש כדי לפקח על הדינמיקה בביטוי גנים ברחבי קהילת החיידקים והמארח 9,23. במקרה זה, שני חיידקים והוזt mRNA צריך להיבחר באופן מועדף. מאז mRNAs חיידקים אינם polyadenylated, לא ניתן לנצל שיטה נפתחת mRNA מבוסס אוליגו-DT. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בדגימות הקשורים מארח אם הדגימות ידועות מכילות כמויות גדולות של mRNA אוקריוטים. דוגמאות רבות הקשורים בבעלי חיים, כוללים ליחה CF, מכילות צפיפות גבוהה של תאים בנוסף לסכומים גבוהים של פסולת הסלולר וnucleases הכוללים RNases. לכן, עוד משימה מאתגרת היא למנוע השפלה RNA נרחבת במהלך metatranscriptome עיבוד. ברוב המקרים, רנ&quot;א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי, המגביל את היישומים ושירות במורד הזרם של RNA נגזר. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. היעילות של גישות אלה עם זאת מוגבל, במיוחד כשעובדים עם אופן חלקי מושפל 9,24 rRNA. השיטות המועסקות כאן לאפשרed לאחזור של רנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי המתאים להסרה מוחלטת rRNA במורד הזרם יעיל. השוואה ישירה של היעילות בהסרת rRNA מרנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי השוואת שתי ערכות שונות שהומחש על ידי אל Lim et. (2012) 9. בסך הכל, המטרה של כתב היד הזה היא לספק סט שלם של פרוטוקולים (איור 1) כדי ליצור metagenomes רובה נגיפי וחיידקים, וmetatranscriptome, ממדגם הקשורים לבעלי חיים יחיד, תוך שימוש במדגם ליחה נגרם כדוגמא. עבודה מעבדה מולקולרית צריכה לכלול אזורים נפרדים הגברה לפני ואחרי כדי למזער את הזיהום צולב. השיטות להתאמה בקלות לסוגי מדגם אחרים, כגון רקמה 22, אף ולוע ומטליות לוע תחתונים 25, שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ואלמוגים (נתונים שלא פורסמו). כל דגימה צריכה להיות מעובד מייד עם אוסף במיוחד כאשר metagenomics חיידקים ונפגשהמחקרי atranscriptomics הם רצויים. אם הדגימות הוקפאו, הוא מגביל את הבידוד של תאי חיידקים שלמים לmetagenomes חיידקים כהקפאת פוטנציאל לשבש את שלמות התא. עם זאת, הקפאה אינה מונעת metatranscriptomics ובידוד נגיפי, אבל איכות של RNA וכמות חלקיקים נגיפיים התאוששו עשויה להיות מושפע בתהליך ההפשרה הקפאה. חשוב לציין כי ליחה מושרה שימשה כמקור העיקרי של דגימות במחקרים רבים הקשורים לחולי CF מבוגרים ומחלות ריאה כרוניות אחרות 26,27 כBAL יכול להיות פולשני מדי. במחקרים שלנו, דגימות כיח נאספו עם שיטה זהירה ועקבית דגימה, כלומר, מי פה הבא ושטיפה של חלל הפה באמצעות תמיסת מלח סטרילית כדי לשמור על זיהום חיידקים אוראליים בתוך דגימות הליחה למינימום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

הנגישות של רצף תפוקה גבוהה יש מהפכה בתחומים רבים של ביולוגיה. על מנת להבין טוב יותר קהילות נגיפיות וחיידקים הקשורים מארח, עבודה מקיפה להפקת DNA ו- RNA פותחה. העבודה במקביל יוצרת metagenomes נגיפי וחיידקים, כמו גם metatranscriptomes, ממדגם יחיד עבור סידור הדור הבא. הצימוד של גישות אלה מספק סקירה של שני מאפייני המיון השונים ופונקציות הקהילה מקודדת. שיטות שהוצגו להשתמש סיסטיק פיברוזיס ליחה (CF), סוג מדגם בעייתי, משום שהוא צמיג במיוחד ומכיל כמות גבוהה של mucins, DNA נויטרופילים חופשי, ומזהמים אחרים לא ידועים. הפרוטוקולים שתוארו כאן למקד את הבעיות הללו והצלחה לשחזר DNA הנגיפי וחיידקים עם זיהום הדנ&quot;א אנושי מינימאלי. כדי להשלים את לימודי metagenomics, פרוטוקול metatranscriptomics היה מותאם להתאושש שני החיידקיםוmRNA מארח המכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA). סקירה של מאפייני הנתונים מוצגת ללשמש כנקודת התייחסות להערכת ההצלחה של השיטות. דגימות כיח CF נוספות גם נאספו ל( i) להעריך את העקביות של פרופילי Microbiome על פני שבעה ימים רצופים בתוך מטופל בודד, וכן (ii) להשוות את העקביות של גישת metagenomic לסידור המבוסס על גן 16S RNA ריבוזומלי. התוצאות הראו כי תנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיקה היו מינימליות ופרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA תמוגה hypotonic (HL) -derived. עם זאת, ההבדלים בין פרופילי מיון שונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL מציעים שתמוגה hypotonic והצעדים הכביסה ליהנות בלא הסרת DNA האדם נגזר בלבד, אלא גם של חיידקים שמקורם בextracellulDNA ar שעלול לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Views.  San Diego State University.  שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

טיהור פלסמיד דנ"א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus