This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة تكساس الفرع الطبي. 1. عزل البلدان النامية من الفئران غير المصابة والمصابين بحمى غرب النيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباراة السن ونوع الجنس 6-10 أسابيع من العمر، من النوع البري C57BL / 6 (B6) وMyD88 - / - الفئران. تطعيم داخل الصفاق (IP) مع 500 لوحة تشكيل وحدة (PFU) من بحمى غرب النيل NS4B- P38G متحولة. في يوم 3 بعد العدوى، الموت ببطء MyD88 B6 و- / - الفئران مع CO 2. استخدام الفئران غير المصابة من كلا الفريقين والضوابط. استخدام ثلاثة الفئران من كل مجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفراء الرطب على الجانب الأيسر من الماوس ضحى باستخدام الايثانول 70٪ وخفض بعيدا الفراء على طول الجانب الأيسر من الفأرة، حوالي منتصف الطريق بين الأمام والخلف الساقين. قطع فتح تجويف الجسم. إزالة الطحال باستخدام ملقط. وضع الطحال في طبق بيتري مع RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البلدان النامية الطحال باستخدام حبات مغناطيسية مكافحة CD11c وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 2. تنقية ووسمها T خلايا من الفئران المعدلة وراثيا OTII <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الطحال واحدة من الماوس OTII السذاجة كما هو موضح في الخطوة 1.2 أعلاه والتجانس الطحال بين طرفي بلوري من شريحتين. نقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة RPMI متوسطة تصل إلى 14 مل. السماح للتعليق الجلوس لمدة 5 دقائق ونقل 13 مل منه إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا CD4 + T الطحال باستخدام CD4 + T العزلة خلية عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني مع ألبومين المصل البقري 0.5٪ (BSA) في 1 × 10 6 خلايا لكل مل، وإضافة 0.5 ميكرومول / مل من CFSE. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومحمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل المتوسطة كاملة البارد (RPMI-1640 مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني، 1/100 المجلدالمضادات الحيوية / antimycotics، 1/100 المجلد L-الجلوتامين و 1 / 1،000 المجلد 1،000 × 2-المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وتحديد 0.2 × 10 6 المسمى خلايا CD4 + T في 2٪ PFA والحصول على تدفق عداد الكريات. استخدام هذه العينة لتحديد مستوى القاعدية من CFSE. إعادة تعليق ما تبقى من الخلايا المسمى في المتوسط ​​كاملة. </li></ol> 3. المشارك الثقافة OTII الخلايا التائية مع البلدان النامية من المصابين بحمى غرب النيل الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة 2 × 10 5 تنقية خلايا CD4 + T من الفئران OTII وحدها أو مع البلدان النامية المنقى من النوع البري أو MyD88 - / - الفئران (2 × 10 4) في 24 لوحة جيدا مع أو بدون OVA بقايا 323-339 (1 ز / مل) في 1 مل المتوسطة الكامل لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام. حصاد الخلايا، ويغسل مرتين في FACS العازلة (PBS مع 1٪ FBS) وإصلاح في 0.25 مل 2٪ PFA. دوامة فورا. </li></ol> 4. تحليل تدفق الخلوي في المختبر &lt;/ م&gt; T خلية الاشعال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشراء، انقر نقرا مزدوجا فوق الرمز التدفق الخلوي البرمجيات. لمؤامرة الكثافة الخطي FSC-A مقابل الخطي SSC-A، قنوات مختارة 0 إلى 200،000 في FSC-A و0 إلى 200،000 في SSC-A. ثم إنشاء بوابة على الخلايا الحية (P2؛ انظر الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل كثافة مضان من CFSE، فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 20،000 الأحداث على السكان بوابات. انشاء علامة على عينات لخلايا OTII مثقف وحدها (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات لخلايا OTII شارك في تربيتها مع من النوع البري البلدان النامية (الشكل 1B) أو MyD88 - / - البلدان النامية (الشكل 1C) بطريقة مشابهة. </li></ol> 5. عزل وتحفيز Splenocytes لخلوى فحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب B6 وMyD88 - / - الفئران مع بحمى غرب النيل NS4B-P38G متحولة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الظريفص 1.1. في يوم 30 بعد الإصابة، وإعادة التحدي على قيد الحياة الفئران بعام 2000 PFU من النوع البري بحمى غرب النيل السلالة الملكية الفكرية وفي أيام 8 و 21 إصابة بحمى غرب النيل في مرحلة ما بعد الأساسي أو في يوم 4 التالية العدوى الثانوية، الموت ببطء الفئران مع CO 2 لجمع الطحال . ملاحظة: استخدمنا 2-3 الفئران في كل مجموعة عن كل نقطة زمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تعليق خلية واحدة من splenocytes كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2 و 2.2 خطوة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعادة تعليق عليها في 10 مل المتوسطة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع المتوسطة كاملة إلى 2.5 × 10 6 خلية / مل. إضافة 1 مل من splenocytes في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمحاكاة خلايا CD8 + T، وتمييع NS4B وE الببتيدات بحمى غرب النيل محددة (SSVWNATTA وIALTFLAV) إلى 1 ملغ / مل في DMSO. لتحفيز خلايا CD4 + T، وتمييع NS3 وE الببتيدات بحمى غرب النيل محددة (RRWCFDGPRTNTILE وPVGRLVTVNPFVSVA) إلى 1 ملغ / مل في DMSO. إضافة 10 ميكرولتر من الببتيدات على الخلايا اتباعها!د بنسبة 1 ميكرولتر من Brefeldin حل. استخدام الخلايا من دون علاج الببتيدات والضوابط. مزيج من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة اثنين من الثقوب مع G إبرة 18 في الحد الأقصى من الأنبوب. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. </li></ol> 6. بين الخلايا تلطيخ خلوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي الجديد. تدور خلايا لمدة 5 دقائق على 300-400 x ج وتصب قبالة طاف. إضافة 1 مل FACS العازلة، وتدور 5 دقائق على 300-400 x ج واعادة تعليق الخلايا قبل pipetting مع 120 ميكرولتر FACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر التيسير مانع واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة 1 مل FACS العازلة لكل أنبوب. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة وتقسيمها إلى ثلاثة أنابيب (حوالي 0.8 × 10 6 خلايا في أنبوب). كما هو مبين في الجدول رقم 1، نحتفظ أنبوب الأول من كل شرط الثقافة لالفئران مفتش-PE تلطيخ. لأنبوب الثاني، إضافة 3 ميكرولتر من مكافحة CD4 APC إلى CD4 الببتيدات المعالجة الخلايا، 3 μلتر من مكافحة CD8 FITC إلى الخلايا المعالجة الببتيدات CD8 أو كليهما الأجسام المضادة لخلايا من دون علاج الببتيدات. استخدام أنبوب ثالث لتعويض تلطيخ. لكل حالة والثقافة، واستخدام ثلاثة أنابيب الخلايا ملطخة APC-مترافق CD4، CD8 FITC مترافق أو PE- المسمى الأجسام المضادة CD3 وحده (3 ميكرولتر في أنبوب) والضوابط التعويض عن FL1، FL2 وقنوات FL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا دوامة لفترة وجيزة. ترك على الجليد لمدة 20 دقيقة وحمايتها من الضوء. إضافة 1.4 مل FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج وتصب قبالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم لعرقلة بيليه خلية (أو لفترة وجيزة الدوامة). اعادة تعليق الخلية بيليه في 250 ميكرولتر تثبيت / permeabilization solutionby pipetting ل. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، وحماية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.2 مل FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج و resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة. ملاحظة: عند هذه النقطة، والخلايا يمكن نقلها إلى مختبر BL2 لمزيد من المعالجة أو تخزينها في الثلاجة وحمايتها من الضوء لأجلكp لثلاثة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من 1X العازلة permeabilization / غسل. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر 1X بيرم / غسيل، إضافة 3.5 ميكرولتر مكافحة IFNγ-PE إلى أنبوب أضاف سابقا مع الأجسام المضادة للCD4 و / أو CD8 T علامات خلية في الخطوة 6.3 و 3.5 ميكرولتر الفئران مفتش-PE في أنبوب محفوظة من أجل السيطرة مفتش لمدة 25 دقيقة على الجليد وحماية من الضوء. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1.4 مل من 1X العازلة permeabilization / غسل. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س. كرر الخطوة غسل بإضافة 1.4 مل 1X permeabilization / غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور 5 دقائق على 300-400 x ج وصب طاف. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1.4 مل من العازلة FACS واعادة تعليق في 400 ميكرولتر من العازلة FACS لاقتناء النهائي. </li></ol> 7. تحليل تدفق الخلوي من بين الخلايا تلطيخ خلوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإعدادات اكتساب نفس كما في الخطوة 4.1. بجمعية العقاراتالشركة المصرية للاتصالات بوابة على الخلايا الحية (P2؛ انظر الشكل 2A). ضبط الفولتية باستخدام أنابيب التعويض عن كل مجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح اثنين نقطة جديدة المؤامرات، واحدة لعرض البيانات التي تم جمعها لFL1 مقابل. FL2 (CD8 مقابل. IFN-γ)، والآخر هو لعرض البيانات التي تم جمعها لFL4 مقابل. FL2 (CD4 مقابل. IFN-γ). اكتساب 50،000 الأحداث للسكان بوابات من كل عينة. </li></ol>

<ol>
	<li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus.">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain.">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses.">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li><li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family.">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li><li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways.">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection.">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li><li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells.">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li><li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons.">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li><li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis.">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li><li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+measure+T-cell+responses.">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities.">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li><li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice.">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vgamma4++T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection.">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

بحمى غرب النيل هو الممرض BL3. بسبب لوائح السلامة والمقايسات المناعية مع عينات المصابة بحمى غرب النيل وغالبا ما تقتصر من قبل توافر المعدات في BL3 مرافق أو أكثر طويلة ومملة لأداء. في دراسة حديثة، استخدمنا طريقتين القائم على التدفق الخلوي لدراسة الخلية بوساطة الاستجابات ا...

فيروس غرب النيل (بحمى غرب النيل)، وهو موجه للعصب، بالإضافة إلى لمست-الفيروسة المصفرة، يشكل تهديدا للصحة العامة الناشئة. حاليا، وقد تمت الموافقة على أي لقاحات للاستخدام البشري 1. سلالة بحمى غرب النيل الموهن، التي لديها إجراء تبديل P38G في ابنيوي (NS) البروتين 4B، ومن المعروف للحث على أي الفتك في الفئران ولكن السيتوكينات أعلى الفطرية واستجابات الخلايا T في الفئران من النوع البري بحمى غرب النيل NY99 سلالة 2. تحصين الفئران مع متحولة NS4B-P38G كانت كلها محمية من التحدي الثانوي مع قاتلة من النوع البري بحمى غرب النيل. وهذا يوحي بأن متحولة NS4B-P38G لديها ميزات مناسبة لمرشح اللقاح المثالي. الآليات التي متحولة NS4B-P38G يدفع عالية على التكيف الحصانة الواقية ليست مفهومة بشكل واضح حتى الان. تول مثل مستقبلات (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، وتلعب دورا أساسيا في الشروع في المناعة الفطرية للعدوى الفيروسية. مسار الأساسية TLR إشارات يستخدم استجابة التمايز الابتدائي الدم النخاعي جنرال الكتريكشمال شرق 88 (MyD88) كما محول الأساسي 3،4. في دراسة حديثة، تبين MyD88 الإشارات للعب دورا هاما في تطوير خلايا مناعة بوساطة خلال العدوى بحمى غرب النيل متحولة NS4B- P38G في الفئران 5. خلايا تغصنية (DCS) هي واحدة من الخلايا العارضة للمستضد أهم واظهار قدرة فريدة لبدء T الأساسي استجابات الخلايا خلال العدوى الفيروسية 6،7. CD4 + CD8 + T والخلايا على حد سواء يساهم في مناعة وقائية طويلة الأمد ومهمة من أجل البقاء المضيف التالية من النوع البري الإصابة بحمى غرب النيل 8،9. واستخدمت اثنين من المقايسات المناعية في هذه الدراسة لتقييم وظائف هذه الخلايا في NS4B-P38G متحولة إصابة الفئران. أولا، تم استخدام وفتيلة فحص في المختبر T الخلية لمقارنة قدرة العارضة للمستضد من البلدان النامية من المصابين بحمى غرب النيل من النوع البري وMyD88 - / - الفئران. لزيادة حساسية الفحص، ساذج CD4 &lt;سوب&gt; + تم عزل خلايا T OTII من الفئران المعدلة وراثيا والتي تعبر محددة Vα2 / Vβ5 TCR للألبومين البيض والدجاج (OVA) الببتيد 323 - 339. وتنقيته من البلدان النامية بحمى غرب النيل الفئران المصابة، وشارك في تربيتها مع carboxyfluorescein succinimidyl عيد الفصح (CFSE ) -labeled خلايا CD4 + T في وجود OVA الببتيد. بعد 5 أيام من شارك في الثقافة، وكان حصاد الخلايا وثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA) وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد أجريت فحوصات التكاثري تقليديا من خلال إدماج 5-برومو-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) أو معالج بالتريتيوم ديوكسي ريبوزيد الثايمين (3 HTdr) 10. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات إما المشعة و / أو في حاجة إلى معدات خاصة على مستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق، حيث يتم إجراء دراسات بحمى غرب النيل. تحليل تدفق cytometric من انتشار الخلايا اللمفاوية التي كتبها بمقدار النصف التسلسلي للكثافة مضان من صبغ الحيوي أصبح CFSE أكثر شيوعا المستخدمة في المقايسات المناعية كما أن الصبغة هي أكثر ثابتوأدرجت بالتساوي في الخلايا، والكشف بسهولة عن طريق التدفق الخلوي، وغير امشع 11. لديه الفحص أيضا القدرة على تقييم عدد من انقسامات الخلية. واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الاختبار في الدراسات بحمى غرب النيل هو أن تثبيت للخلايا المصابة 1-2٪ PFA يمكن إبطال مفعول بحمى غرب النيل 12، مما سيمكن الحصول على عينة مع تدفق عداد الكريات في مختبر BL2. وبعد ذلك، تم استخدام إجراء تعديل الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) لدراسة دور MyD88 الإشارات في تنظيم بحمى غرب النيل استجابات الخلايا T محددة في NS4B-P38G الفئران المصابة متحولة. في هذا الاختبار، وعولج splenocytes معزولة عن الفئران المصابة بحمى غرب النيل في المختبر مع الببتيدات محددة. وأضيف Brefeldin والإبقاء على السيتوكينات داخل الخلية. بعد 5 ساعة الحضانة، تم حصاد الخلايا، وغسلها وملطخة للT مجموعات فرعية الخلية. تم خلايا ثم ثابتة في PFA، permeabilized وملطخة للفيروسات (IFN) -γ وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.كما هو الحال مع غيرها من تدفق الفحص القائمة على الخلوي، مرة واحدة يتم التعامل مع الخلايا مع تثبيت وعازلة permeabilization تحتوي على PFA، والعينات المصابة يمكن نقلها إلى مختبر BL2 لمزيد من المعالجة والتحليل. في العديد من الدراسات المنشورة، وقد استخدمنا ICS لقياس وظائف T المستجيب الخلايا في الفئران المصابة بحمى غرب النيل 13،14. على الرغم من انها راسخة، عيب رئيسي واحد من هذا الاختبار هو أن هذا الإجراء هو طويل جدا ويمكن أن يكون أكثر استهلاكا للوقت عندما يؤديها داخل مرافق BL3. هنا، تبين وجود طريقة ICS أساس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة لتكون أكثر جدوى، وأسهل على المضي قدما وأقل استهلاكا للوقت عندما تتم داخل مختبر BL3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11875</td>
			<td>warm up at 37C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD11c magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD4 magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-248</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OVA residue 323-339</td>
			<td>Genscript Corporation</td>
			<td>RP10610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:153px;">Proimmune</td>
			<td>PC0AD-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Brefeldin A solution</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Mouse Fc Blocker</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>14-0161-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">APC-conjugated CD4&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>17-0041-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">FITC-conjugated CD8&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e- bioscience</td>
			<td>11-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Permeabilization/wash buffer</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right">554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">anti-IFNg-PE&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Accuri flow cytometer</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

فيروس غرب النيل الموهن (بحمى غرب النيل)، وابنيوي (NS) 4B-P38G متحولة، التي يسببها خلوى أعلى الفطري واستجابات الخلايا T من النوع البري بحمى غرب النيل في الفئران. في الآونة الأخيرة، النخاعي عامل التمايز 88 تم عرض (MyD88) يشير إلى أن تكون مهمة لالأولي فتيلة الخلايا T والتنمية خلية ذاكرة T خلال بحمى غرب النيل NS4B-P38G العدوى متحولة. في هذه الدراسة، وهما تتدفق على أساس أساليب الخلوي - في المختبر T خلية فتيلة فحص وتلطيخ خلوى داخل الخلايا (ICS) - استخدمت لتقييم الخلايا الجذعية (DCS) وظائف الخلايا التائية. في الخلية T فتيلة الفحص، تم تحليل تكاثر الخلايا التدفق الخلوي التالية ثقافة مشتركة من البلدان النامية من كلا المجموعتين من الفئران مع استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) - وصفت خلايا CD4 + T OTII من الفئران المعدلة وراثيا. قدم هذا النهج تحديد دقيق لنسبة تكاثر الخلايا CD4 + T مع تحسن كبير في الحساسية الشاملة من التقليدآل المقايسات مع الكواشف الإشعاعية. تم استخدام نظام أنبوب microcentrifuge في كل إجراءات زراعة الخلايا وتلطيخ خلوى البروتوكول ICS. بالمقارنة مع النظام القائم على لوحة زراعة الأنسجة التقليدية، وكان هذا الإجراء تعديل أسهل للأداء على المستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق. وعلاوة على ذلك، تم علاج WNV- الخلايا المصابة مع امتصاص العرق في كل من المقايسات، والتي مكنت مزيد من التحليل خارج مرافق BL3. عموما، هذه المقايسات المناعية في المختبر يمكن استخدامها لتقييم كفاءة الاستجابات المناعية الخلوية خلال العدوى بحمى غرب النيل.

في فحص الخلايا التائية فتيلة، كانت CFSE المسمى خلايا CD4 + T مثقف مع البلدان النامية المنقى من NS4B-P38G المصابة متحولة من النوع البري وMyD88 - / - الفئران في وجود أو عدم وجود الببتيدات OVA. خلايا T وصفت مثقف وحدها مع أو بدون OVA لتم استخدام 5 أيام والضوابط السلبية. كما هو مب...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection at JoVE.com

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

8.1K Views.  The University of Texas Medical Branch. Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Video: In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

بي ار بي كنهج جديد للوقاية من العدوى: إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; الخصائص المضادة للميكروبات من PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...