This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

全ての動物実験は、テキサスメディカル支店大学の動物実験委員会によって承認された。 非感染およびWNV感染マウスからのDCの単離<ol><li>年齢および性別が一致6-10週齢の野生型C57BL / 6（B6）とのMyD88 - / -マウス。腹腔内（IP）WNV NS4B- P38G変異体の500プラーク形成単位（P​​FU）で接種する。 - / - CO 2を用いたマウス感染後3日目に、B6マウス及びMyD88-を安楽死させる。コントロールとして、両グループの非感染マウスを使用してください。各グループから3匹のマウスを使用してください。 </li><li> 70％エタノールを使用して屠殺したマウスの左側にウェット毛皮と、マウスの左側に沿って前後脚の間の約半分の毛皮を切り取る。体腔を切り開い。鉗子を使用して脾臓を削除します。 RPMIでペトリ皿に脾臓を置きます。 </li><li>に従って抗CD11c磁気ビーズを使用して、脾臓DCを単離する製造元の説明書。 </li></ol> 2.精製とOTIIトランスジェニックマウスのT細胞の標識<ol><li>ナイーブOTIIマウスから収穫1脾臓は、上記のステップ1.2で説明したと2スライドのすりガラス端部の間に脾臓を均質化するように。 14ミリリットルにRPMI培地を加えるを15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。サスペンションは5分間座って、新しい15ミリリットルコニカルチューブにそれの13ミリリットルを転送してみましょう。 </li><li>製造業者の説明書に従ってCD4 + T細胞単離キットを使用して、脾臓CD4 + T細胞を単離する。 </li><li>を50mlコニカルチューブに転送細胞は、PBSで2回洗浄する。再懸 ​​濁し、1ml当たり1×10 6細胞を、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を有するPBS中の細胞とCFSEの0.5モル/ mlに加える。光から保護し、10分間、37℃でインキュベートする。 </li><li> 10％の熱不活化ウシ胎児血清を5ミリリットルの冷完全培地（RPMI-1640を追加し、100分の1巻1000×1000の2-メルカプトエタノール、抗生物質/抗真菌剤、1/100体積L-グルタミンおよび1 / 1,000倍容量）。 </li><li>氷上で5分間インキュベートします。 PBSで細胞を1回洗浄し、2％PFAで0.2×10 6ラベルのCD4 + T細胞を固定し、フローサイトメーターで取得する。 CFSEの基礎レベルを決定するために、このサンプルを使用します。完全培地中の標識細胞の残りを再懸濁。 </li></ol> WNV感染マウスのDCと3。共培養OTII T細胞<ol><li>培養2×10 OTIIマウスの5精製CD4 + T細胞単独で、または野生型もしくはMyD88の精製されたDCと- / -またはOVA残基323-339無し24ウェルプレート中のマウス（2×10 4）（1グラムウェルあたり1mlの完全培地中/ ml）を。 </li><li> 5日間、37℃で細胞をインキュベート。収穫細胞は、（1％FBSを含むPBS）、FACS緩衝液中で2回洗浄すると0.25mlの2％PFAで固定する。ボルテックスすぐに。 </li></ol> インビトロの4。フローサイトメトリー分析&lt;/ em&gt;のT細胞プライミング<ol><li>買収のために、フローサイトメトリーソフトウェアのアイコンをダブルクリックする。 対 SSC-AのFSC-Aと200,000 0上の線形SSC-A、チャンネルを選択0 200,000リニアFSC-Aの密度プロットのために。その後、生細胞にゲートを作成（P2; 図1A参照 ）。 </li><li> CFSEの蛍光強度を分析するために、FL1チャンネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団20,000のイベントを取得する。単独で培養し（ 図1A）OTII細胞のための試料上のマーカーを設定します。 </li><li>野生型のDC（ 図1B）またはMyD88のと共培養OTII細胞のためのサンプルを取得する- / -樹状細胞（ 図1C）と同様の方法で。 </li></ol> 5.絶縁およびサイトカインアッセイ用の脾細胞の刺激<ol><li> steのと同様の手順を用いて、WNV NS4B-P38G変異を有するマウス- / - B6およびMyD88に感染するP 1.1。日、30日8と21ポストのプライマリWNV感染または二次感染後4日目に、野生型WNV株IPの2000 PFUで感染後、再チャレンジ生存マウスでは、脾臓の収集のためにCO 2でマウスを安楽死させる。 注：我々は、各時点についてグループごとに2〜3匹のマウスを使用していました。 </li><li> ステップ1.2＆ステップ2.2で上記のように脾臓細胞の単一細胞懸濁液を作成します。血球計数器を用いて細胞をカウントし、10mlの完全培地中に再懸濁これら。 </li><li> 2.5×10 6細胞/ mlの完全培地で細胞を希釈する。 1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に脾細胞の1ミリリットルを追加します。 </li><li> DMSO中1mg / mlのWNV特異NS4B及びEペプチド（SSVWNATTAとIALTFLAV）を、CD8 + T細胞をシミュレー希釈する。 CD4 + T細胞の刺激のために、DMSO中1mg / mlのWNV特異的NS3およびEペプチド（RRWCFDGPRTNTILEとPVGRLVTVNPFVSVA）を希釈する。 followe細胞へのペプチドの10μlのを追加します。ブレフェルジンの1μlの溶液によるD。コントロールとしてのペプチド処理なしに細胞を使用してください。細胞を混ぜる。 </li><li>チューブのキャップで18 G針で2穴パンチ。 5時間、37℃で細胞をインキュベート。 </li></ol> 6.細胞内サイトカイン染色<ol><li>新しいマイクロ遠心チューブに細胞を移す。 300〜400×gで5分間細胞をスピンし、上清を捨てる。 120μlのFACS緩衝液でピペッティングにより1mlのFACS緩衝液を追加し、300〜400×gで5分間スピンし、再懸濁細胞。 </li><li> 2μlのFcの遮断を追加し、10分間室温で細胞をインキュベートする。各チューブに1ミリリットルFACSバッファーを追加します。 400×G - 300でスピン5分。 </li><li>再懸 ​​濁300μlのFACS緩衝液で細胞をし、3本のチューブ（チューブ当たり約0.8×10 6細胞）にそれらを分割する。 表1に示すように、ラットのIgG-PE染色のために、各培養条件の第一の管を予約する。第二の管の場合、CD4ペプチド処理細胞への抗CD4 APCの3μlを添加、3μペプチド処理なしの細胞に対するCD8ペプチド処理細胞または双方の抗体に対する抗CD8 FITCのリットル。補償染色するための第3のチューブを使用してください。各培養条件については、APC結合CD4、FITC結合CD8またはFL1、FL2及びFL4チャネルの補償コントロールなどの単独のPE-ラベルCD3抗体（チューブあたり3μL）で染色した細胞の3本のチューブを使用しています。 </li><li>簡単にボルテックス細胞。氷上で20分間のままにして、光から保護する。 1.4ミリリットルFACS緩衝液を追加します。 300〜400×gで5分間スピンし、上清を捨てる。 </li><li>細胞ペレット（または簡潔に渦を）破壊すること攪拌する。 250μlの固定/透過化solutionbyのペッティングで細胞ペレットを再懸濁。 20分間室温でインキュベートし、光から保護する。 </li><li> 1.2ミリリットルFACS緩衝液を追加します。 300μlのFACS緩衝液中で300〜400×gで再懸濁細胞でのスピン5分。 注：この時点で、細胞は、さらなる処理のためにBL2ラボに転送することができるか、冷蔵庫に保存し、uのために光から保護3日のp。 </li><li> 500μlのFACSバッファーを追加します。スピン1X透過化/洗浄緩衝液500μl中で300〜400×gで再懸濁細胞で5分。スピン300~400×gで5分間。 </li><li>以前に予約済みチューブのステップ6.3および3.5μlのラットのIgG-PEでCD4のための抗体および/ ​​またはCD8 T細胞マーカーを付加したチューブに3.5μlの抗IFNγ-PEを追加し、100μlの1×パーマ/洗浄で細胞を再懸濁氷上で25分間のIgGコントロールのために、光から保護する。 1X透過化/洗浄緩衝液1.4ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。スピン300~400×gで5分間。 1.4ミリリットル1X透過化/洗浄バッファーを追加することによって、洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 300〜400×gで5分間スピンし、上清をデカント。 FACS緩衝液1.4ミリリットルと、最終的な獲得のためのFACS緩衝液400μlの再懸濁を追加することによって、細胞を洗浄。 </li></ol>細胞内サイトカイン染色の7フローサイトメトリー分析<ol><li> ステップ4.1と同じ取得設定を使用します。クレア生細胞上のゲートTE（P2を、 図2Aを参照）。各グループの補償管を使用して電圧を調整します。 </li><li>二つの新しいドットプロット、 対 FL1のために収集したデータを表示するための1を開きます。 FL2（CD8 対 。IFN-γ）、他方は対 FL4のために収集されたデータを表示することである。 FL2（CD4 VS。IFN-γ）。各サンプルのゲートされ、人口5万のイベントを取得します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus.">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain.">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses.">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li><li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family.">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li><li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways.">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection.">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li><li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells.">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li><li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons.">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li><li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis.">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li><li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+measure+T-cell+responses.">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities.">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li><li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice.">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vgamma4++T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection.">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

WNVは、BL3の病原体である。起因する安全規制に、WNVに感染したサンプルを用いた免疫学的アッセイは、多くの場合、BL3施設または実行するために、より長くて退屈な時に機器の利用可能性によって制限されている。最近の研究では、WNV感染の5中の細胞性免疫応答を研究するための2つのフローサイトメトリーに基づく方法を使用する。両方のアッセイでは、WNV感染細胞を直接またはPF...

西ナイルウイルス（WNV）、神経向性、プラス感知されたフラビウイルスは、新興の公衆衛生上の脅威である。現在、ワクチンは、ヒトでの使用1のために承認されていない。非構造（NS）（b）のタンパク質でP38G置換を有する弱毒WNV株は、野生型WNV NY99株の2以上のマウスには、マウスにおける致死性が、より高い先天性サイトカインおよびT細胞応答を誘導しないことが知られている。 NS4B-P38G変異体で免疫したマウスは、すべての致命的な野生型WNVと二次攻撃から保護された。これは、NS4B-P38G変異体は理想的なワクチン候補に適した特徴を有することを示唆している。 NS4B-P38G変異体は、高い防御適応免疫を誘導する機構は明らかにまだ理解されていない。病原体関連分子パターンを認識するToll様受容体（TLR）は、ウイルス感染に対する自然免疫の開始に重要な役割を果たしている。コアTLRシグナル伝達経路は、骨髄分化一次応答geと利用プライマリアダプタ3,4としてNE 88（MyD88に）。最近の研究では、MyD88のシグナル伝達は、マウス5におけるWNV NS4B- P38G変異感染中の細胞性免疫の発達に重要な役割を果たすことが示された。樹状細胞（DC）は、ウイルス感染の6,7の間に、一次T細胞応答を開始するためのユニークな能力を示す最も重要な抗原提示細胞の一つである。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、長期間持続する防御免疫に寄与し、野生型WNV感染の8,9次宿主の生存のために重要である両方。二つの免疫学的アッセイは、NS4B-P38G変異体に感染したマウスにおけるこれらの細胞の機能を評価するために、本研究に使用した。 - / -マウスで最初に、 インビトロでの T細胞プライミングアッセイは、WNV感染野生型マウス及びMyD88-のDCの抗原提示能力を比較するために利用された。アッセイ、ナイーブCD4の感度を高めるために、&lt;商標&gt; + T細胞は、323、ニワトリオボアルブミン（OVA）ペプチドをVα2/Vβ5TCR特異的に発現OTIIトランスジェニックマウスから単離した- WNV感染したマウスの339 DCは、カルボキシフルオレセインスクシンイミイースターで精製し、共培養した（CFSE OVAペプチドの存在下で）標識CD4 + T細胞。共培養の5日後、細胞を採取し、パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、フローサイトメトリーによって分析した。増殖アッセイは伝統的に、5-ブロモ-2&#39;-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みまたはトリチウム化チミンデオキシリボシド（3 HTdr）10を介して行われている。それにもかかわらず、これらのアッセイは、放射性および/またはバイオセーフティーレベル（BL）WNVの研究が行われている3施設、での特別な設備を必要としてのいずれかである。生体染色色素の蛍光強度CFSEのシリアル半減によるリンパ球増殖のフローサイトメトリー分析は、より一般的に染料をより安定的であるように、免疫学的アッセイにおいて使用されるようになっている均等に、細胞内に取り込まれ、フローサイトメトリーによって容易に検出され、11非放射性である。アッセイはまた、細胞分裂の数を評価する能力を有する。 WNVの研究において、このアッセイを使用する1つの大きな利点は、1〜2％PFAによる感染細胞の固定はBL2実験において、フローサイトメーターでサンプル採取を可能にするWNV 12を不活性化する可能性があることである。 次に、変更された細胞内サイトカイン染色（ICS）手順がNS4B-P38G変異体感染マウスにおけるWNV特異的T細胞応答の調節におけるシグナル伝達のMyD88の役割を研究するために使用された。このアッセイでは、感染したマウスから単離した脾細胞を、WNV特異的なペプチドを用いてインビトロで処理した。ブレフェルジンAは、細胞内サイトカインを保持するために添加した。 5時間のインキュベーション後、細胞を回収し、洗浄し、T細胞サブセットを染色した。次いで、細胞を（IFN）-γおよびフローサイトメトリーによって分析し、インターフェロンのために透過処理、染色、PFAで固定した。細胞は、PFAを含む固定および透過化緩衝液で処理されると、他のフローサイトメトリーに基づくアッセイと同様に、感染したサンプルは、さらなる処理および分析のためBL2室に移すことができる。いくつかの公表された研究では、我々は、WNV感染マウス13,14におけるT細胞エフェクター機能を測定するためにICSを使用している。それは十分に確立さですが、このアッセイの一つの主要な欠点​​は、手順が非常に長いですし、BL3施設内で行わより多くの時間がかかることができることです。ここで、微小遠心管ベースのICS法はより実現可能であることが示された、進行しやすくとBL3研究所内で行うより少ない時間がかかる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11875</td>
			<td>warm up at 37C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD11c magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD4 magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-248</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OVA residue 323-339</td>
			<td>Genscript Corporation</td>
			<td>RP10610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:153px;">Proimmune</td>
			<td>PC0AD-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Brefeldin A solution</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Mouse Fc Blocker</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>14-0161-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">APC-conjugated CD4&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>17-0041-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">FITC-conjugated CD8&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e- bioscience</td>
			<td>11-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Permeabilization/wash buffer</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right">554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">anti-IFNg-PE&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Accuri flow cytometer</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

マウスにおける野生型WNVより生得サイトカインおよびT細胞応答を誘導した弱毒西ナイルウイルス（WNV）、非構造（NS）4B-P38G変異体。最近、骨髄分化因子88（MyD88に）シグナリングがWNV NS4B-P38G変異体感染の間に、初期T細胞プライミングおよびメモリーT細胞の発達に重要であることが示された。本研究では、2つのフローサイトメトリーに基づく方法-アッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ICS）をプライミングin vitroで T細胞は-樹状細胞（DC）およびT細胞の機能を評価するために利用された。 OTIIトランスジェニックマウスのCD4 + T細胞を標識-アッセイプライミングT細胞では、細胞増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）でのマウスの両群からのDCの共培養の後にフローサイトメトリーによって分析した。このアプローチは、伝統よりも有意に改善全体的な感度で増殖するCD4 + T細胞の割合の正確な決定を提供放射性試薬を用いたアルアッセイ。マイクロ遠心チューブシステムは、ICSプロトコルの両方の細胞培養およびサイトカイン染色法に使用した。従来の組織培養プレートベースのシステムと比較して、この修正された手順は、バイオセーフティーレベル（BL）3施設で実行することが容易であった。また、WNV-感染細胞BL3施設外さらなる分析を可能に両方のアッセイにおいて、パラホルムアルデヒドで処理した。全体として、これらのin vitro免疫学的ア ​​ッセイは、効率的にWNV感染の間に細胞性免疫応答を評価するために使用することができる。

- / - OVAペプチドの存在下または非存在下でマウスT細胞プライミングアッセイでは、CFSE標識CD4 + T細胞は、NS4B-P38G変異感染野生型マウス及びMyD88-から精製されたDCと培養した。 5日間またはOVAなしで単独で培養した標識​​されたT細胞は、陰性対照として使用した。 図1Aに示すように、総T細胞は、FL1チャネルで蛍光強度を分析するためにゲートした。マーカーはDC?...

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

8.1K ビュー.  The University of Texas Medical Branch. Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

ビデオ: In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

マウスにおけるγHV68感染の測定

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

免疫・感染学

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

ヒトスジシマカ細胞株における ボルバキア 株 wAlbBの 検出

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...