وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجائزة: R01EY022084 / S1 (KMC)، T32EY007145 (HS) وP30EY014104. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم دعم إضافي من قبل الليونز صندوق ماساتشوستس العين أبحاث (KMC) والجائزة الخاصة إجابات من البحوث للوقاية من العمى (لKMC).

تم التعامل مع جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في بيان الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها في ماساتشوستس العين والأذن المستوصف جنة رعاية الحيوان. قبل يوم من التجربة: 1. إعداد أنابيب لغرفة تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الجانب الوداجي، ربط 1 سم PE10 أنابيب البولي ايثيلين ل6 سم أنابيب السيليكون تليها 5 سم أنابيب البولي ايثيلين. بالنسبة للجانب السباتي، وإعداد بالمثل إلى الجانب الوداجي مع إضافة T-أنبوب داخل أنبوب السيليكون 6 سم حوالي 1.5 سم بعيدا عن 1 سم أنابيب البولي ايثيلين (الشكل 1A، B). من أجل إدراج T-أنبوب، وتوسيع أنبوب السيليكون باستخدام ملقط غرامة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل أحد طرفي من 10 سم من أنابيب السيليكون إلى محول الضغط ثم أدخل الطرف T من ليالي السباتيبيئة تطوير متكاملة T-أنبوب إلى الطرف الآخر. ضمان الاتصال مواقع ضيقة وتسرب مجانا. تطبيق قطعة مستطيلة صغيرة من parafilm حول المكان الذي يناسب أنابيب معا، وإذا لزم الأمر، لمنع تسرب (الشكل 1C). </li></ol> 2. طلاء الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البروتين طلاء السطح البطانية (على سبيل المثال، P selectin، التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، الأوعية الدموية التصاق الخلية البروتين-1 (VCAM-1)) في 0.1٪ BSA. كمبدأ توجيهي، 1 ميكروغرام من البروتين في 200 ميكرولتر BSA يكفي لمعطف 4-5 غرف. باستخدام حقنة 1 مل متصلة إبرة 25 G، ولبث كل غرفة (0.04 X 0.4 × 50 ملم) مع بروتين طلاء السطح البطانية. تخزين غرف المغلفة في أنبوب 15 مل عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> في يوم من التجربة: 3. إعداد غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غرف المغلفة من 4 ° C وتوصيل أنابيب الوداجي والسباتي على كل جانب. ختم connectiالإضافات التي تمتد بعناية قطعة مستطيلة صغيرة من parafilm حول المكان الأنابيب يلتقي الغرفة. باستخدام حقنة، وملء الغرفة وأنابيب بنسبة 0.1٪ BSA (تحقق من وجود تسرب). احتضان لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق بيتري 35 ملم لعقد الغرفة عن طريق قطع الشقوق على كل جانب من الطبق. تحقيق الاستقرار في غرفة في الشقوق. ثم استخدم قطرة صغيرة من السيليكون ليضعوا الغرفة إلى الطبق في موقع حقق. تأكد من أن الغرفة هو مستوى من خلال النظر تحت المجهر. السماح للسيليكون لتجف لمدة 15 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 60 مل قفل المحاقن مع الهيبارين والاتصال إلى محول الضغط. قم بتوصيل محول الضغط على أنابيب السباتي في الترتيب التالي: محول، وأنابيب السيليكون، وT-الأنبوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 سم PE50 بين أنابيب السيليكون متصلا محول وT-أنبوب لتأمين الاتصال. تمرير أنابيب السيليكون الشريان السباتي عن طريق المشبك الضغط (1D الشكل). تشغيل 100USP الهيبارين ترولاف أنابيب وغرفة حتى عدم وجود فقاعات الهواء. </li></ol></li></ol> 4. إعداد البرامج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد البرنامج، قم بتشغيل الكمبيوتر، المجهر، وجهاز مختبر مفتوح. انقر مرتين على تطبيق جناح لايكا (LAS) (أو ما يعادلها) وإعداد مجلد لحفظ الفيديو: تصفح → → اكتساب فيلم → تحديد تسلسل من لقطات (لقطات = 15، وقت التسجيل = 30 ثانية، وفترات = 15 ثانية) ثم انقر فوق علامة &quot;+&quot; للتأكيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسجيل ضغط تدفق فتح LabChart (أو ما يعادلها) ملف وتنسيق اسم الملف إلى مجلد التسجيل في الخطوة 4.1 أعلاه. </li></ol> 5. إجراء العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس القديم الأسبوع 8-10 باستخدام مزيج من الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (6 ملغ / كلغ) حقن داخل peritoneally (IP). تأكد من أن يتم تحقيق التخدير العميق في غضون 5-10 دقيقة عن فقدان دواسة الانسحاب لا ارادي. إذا لزم الأمر، الأيزوفلورينتسليمها عن طريق قناع الوجه يمكن أن تعطى حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين تحت التخدير، ضع وسادة تحت الاحترار القفص وتعيين إلى 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. بمجرد تأكيد التخدير السليم، ضع الماوس في موقف بطني ومعطف العينين مع مرهم باسيتراسين لمنع جفاف العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، حلق الشعر في موقع شق باستخدام شفرة حلاقة وتنظيف شامل للموقع مع الكحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تخدير كامل تأمين الحيوان مع الشريط حفظ الماوس في موقف بطني. فضح منطقة الرقبة مع مقص وإزالة الغدة الدرقية لفضح القصبة الهوائية والأوعية (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الشريان السباتي حتى يتعرض بشكل كامل مع الحرص على عدم تلف العصب المبهم (الشكل 2B). أضعاف قطعة من الخيط وتمرير ينحني تحت الشريان السباتي ثم قطع في منعطف لذلك هناك الآن 2 قطعة من الخيط تحت الشريان السباتي. حلقة كل خياطة في عقدة (لا تشديدعقدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء لفضح حبل الوريد الأيسر (الشكل 2C)، وإعداد الغرز بنفس الطريقة (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل أنابيب إلى الأوعية الدموية الماوس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعالج بالهيبارين الماوس عن طريق حقن 1 مل من الهيبارين IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشديد خياطة العليا على الشريان السباتي. وضع المشبك سفينة منخفضة كما يمكن أن تذهب على الشريان السباتي (الشكل 3A). استخدام ملقط لعقد الشريان عن طريق خياطة العليا وإجراء شق صغير، حوالي 1/8 من محيط الشريان، وذلك باستخدام microscissors (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير أنابيب الشريان السباتي من خلال العقدة الثانية في خياطة العليا وإلى شق المحرز في الشريان. ربط قبالة أقل خياطة بحيث يتم اغلاق الشريان حول أنابيب (ينبغي بذل عدة عقدة لضمان وجود ختم ضيق، الشكل 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء لإدخال الوريد الوداجي أنابيب (السفينةليست هناك حاجة المشبك للجانب الوداجي، الشكل 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار تدفق عن طريق الإفراج عن المشبك السفينة. إذا كان هناك أي تسرب تحريك الماوس لالمجهر وتوصيل أنابيب السباتي والوريد الوداجي إلى أنابيب الغرفة (انظر الفيديو المرفق للتظاهر من إجراء العمليات الجراحية). </li></ol></li></ol> 6. تسجيل المتداول السرعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح المشبك السباتي لملء غرفة، مما يجعل الدائرة مع نظام الدورة الدموية الماوس. يسمح الدم أن تعمم لمدة 3-5 دقائق حتى يتسنى للظروف تدفق استقرار. وخلال فترة الانتظار من 3-5 دقائق، وضبط مرحلة المجهر بحيث الغرفة هو مستوى واحدة من نهاية إلى أخرى مع الهدف المجهر وحافته موازية مع تسجيل الفيديو نافذة على الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بيتري المعدلة تحتوي على غرفة الزجاج مع الماء ثم خفض الهدف الغمر بالماء 10X في طبق حتى أن الخلايا التي تتدفق من خلال غرفة مرئية.قد يكون شدة الضوء إلى تعديل للعرض كاف من الخلايا. عموما أقل كثافة هو أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المشبك على أنابيب بحيث محول يقرأ ثابت 30 ملم زئبق، ربط لضغط تدفق الفسيولوجية المتوسط، أو كما تريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;ابدأ&quot; لبدء تسجيل كل من الفيديو والضغط مع أول مرور الوقت على مقربة من نهاية الوريد والتحرك ضد تدفق نحو نهاية السباتي حتى الانتهاء. ملاحظة: العديد من الشروط طلاء باستخدام جزيئات الالتصاق مختلفة يمكن دراستها في نفس الماوس باستخدام غرف متعددة. فقط يتم تسجيلها غرفة واحدة في وقت واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من التسجيل، وإغلاق صمام في موقع المدخلات، ووقف تدفق الدم. إزالة غرفة وتناسب غرفة جديدة (المغلفة مع جزيء التصاق مختلفة) إلى الدائرة باستخدام ملقط غرامة في يد واحدة وملقط مخدد في اليد الأخرى. استئناف تسجيل للغرفة جديدة كما هو موضح في الخطوات6،1-6،4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء كل الفئران عن طريق CO 2 الاختناق تليها خلع الحبل الشوكي في نهاية التجربة. والمحطة، وبالتالي، والموت الرحيم الإجراء الفئران عن طريق خلع الحبل الشوكي في نهاية التجربة. </li></ol> 7. تفسير نتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البيانات المسجلة استخدام &quot;M TrackJ&quot; البرنامج المساعد لبرنامج يماغيج 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملف إلى تدرج الرمادي التي حدد ملف → استيراد → → تحويل AVI إلى تدرج الرمادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توحيد الأطر التي حدد → → صورة الملكية → أدخل الفترات الزمنية الإطار (ط) → العالمية. حساب فترات إطار بقسمة مجموع مدة الفيديو (عادة 30 ثانية) من قبل عدد من الإطارات في فيديو واحد (كما هو موضح في الزاوية العليا من صورة J نافذة الفيديو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تدفق كل الكريات البيض التي حدد البرنامج المساعد → M TrackJ → اضافة مسارات → اختيار الكريات البيض→ تتبع ذلك مع كل إطار لمدة 15 - 20 ثانية → دمج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 7.4 لجميع الكريات البيض في الرأي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد متوسط ​​المتداول سرعة من الكريات البيض التي حدد مقياس → تظهر عمودين → نسخ كافة M TrakJ: اليسروع في جدول بيانات. العمود المسمى &quot;يعني V&quot; هو المتداول الكريات البيض تقاس بالبكسل / ثانية. تحويل إلى ميكرون / ثانية عن طريق قسمة 2/3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البيانات تسليط الضوء على الضغط والتصدير في جدول بيانات وإجراء العملية الحسابية التالية: ΔP (ملم زئبق) و ر (داين / سم 2) للمقارنة بين كل المجموعة التجريبية. مرة واحدة محسوبة، نسخ البيانات إلى برنامج موشور عن الرسوم البيانية. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

عملية التوظيف الكريات البيض هي خطوة حاسمة في الاستجابة الالتهابية. أنه ينطوي على هجرة الكريات البيض من الدورة الدموية نحو الأنسجة المستهدفة، حيث أنها قادرة على ممارسة وظيفة المستجيب الخاصة بهم. تجنيد الكريات البيض هو جزء لا يتجزأ في مجموعة متنوعة من الحالات الالتهابية مثل ويحات تصلب الشرايين، واحتشاء عضلة القلب، ونقص التروية / ضخه، وجراحة زرع 1، وكذلك متعددة العصبية التهابات الجهاز العصبي المركزي الشروط المتعلقة 10-12،20،24،25. نظرا لتنوع الظروف المرض الذي يمتد التوظيف الكريات البيض، توفر غرفة microflow autoperfused أداة لا غنى عنها والسماح للمحقق القدرة على دراسة ديناميكيات الهجرة الكريات البيض. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطوير مجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر لدراسة ديناميات الكريات البيض خلية التصاق 26. للأسف، كل هذه المقايسات تتطلب استخراجالكريات البيض من الدم، وإدخال تفعيل الميكانيكية. للحصول على أقرب إلى البيئة في الجسم الحي، أدلى التعديلات لجمع عينات الدم الكامل والسيطرة على ظروف تدفق الدورة الدموية 16،17. هنا، نحن تمديد التقدم السابقة في هذا المجال من خلال ربط غرفة المغلفة لنظام الدورة الدموية الماوس. ونحن قادرون على تنظيم تدفق الدم إلى مجموعة وفيزيولوجي ودراسة ديناميات الكريات البيض المتداول. غرفة المغلفة يعطينا القدرة على دراسة التفاعلات الكريات البيض مع جزيئات الالتصاق محددة. لأن النظام يعمل كوحدة تشغلها الماوس الحية، فإنه يحاكي بشكل وثيق بالبيئة الطبيعية، مما يسمح لنا لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطانية في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المناعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يتيح لنا الاستفادة من عدة نماذج الماوس الوراثية المتاحة. في حين أن النظام لا تكرار تماما البيئة في الجسم الحي، لأنها توفر منبرا لدراسة specifiعناصر ج من الكريات البيض في ظل الظروف الفسيولوجية، وهو إنجاز لم يكن ممكنا في السابق. على الرغم من هذا يأخذنا خطوة أقرب إلى بيئة أكثر الفسيولوجية هناك قيود على النظام. فإنه لا تكرار تماما مصفوفة 3D معقدة من الأوعية الدموية لذلك نحن قادرون فقط لتقييم عناصر معينة من التفاعلات الكريات البيض التي تقتصر على طلاء الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ بعناية كبيرة لضمان وجود نظام مغلق لتداول الماوس وذلك باتباع جميع الخطوات المذكورة في البروتوكول. سوف إدخال فقاعات الهواء تؤثر بشكل كبير على دقة واستنساخ التجارب. في حين وصفنا استخدام غرفة Autoperfused Microflow لتقييم ديناميات المتداول الكريات البيض الإجراء لديه القدرة على أن يشخص من قبل محققين لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض. على سبيل المثال، الخلايا السرطانية metastasize بالإعراب عن العديد من integrins المشتركة بين الكريات البيض. Studyinز ديناميات المتداول في الإعداد الذي يحاكي بشكل وثيق بيئة في الجسم الحي يمكن أن تساعد في معرفتنا، وربما التنبؤ، لطبيعة الغازية من الخلايا السرطانية معينة. نهج واحد ممكن أن يكون في الجمع بين تقنية وضع العلامات لخلايا السرطان، مثل GFP 27، جنبا إلى جنب مع مقايسة غرفة تدفق لتتبع ديناميات المتداول من الخلايا السرطانية معربا عن GFP. ونظرا لمرونة طلاء الغرفة مع مجموعة متنوعة من المواد وربط غرف متعددة لنفس الماوس سيكون من المثير أن نرى كيف يتم تعديل هذا الإجراء لاستخدامها في مختبرات أخرى في تركيبة مع الفئران المعدلة وراثيا ونماذج المرض. تقنية وصفنا هنا يمس فقط على إمكانية تطبيق أوسع نطاقا التي يقتصر فقط بواسطة إبداع المحقق.

الالتهاب هو استجابة الجسم للإصابة والعالمية هو خطوة حاسمة في كل وظيفة نظام المناعة الفطرية والتكيفية. ردا على إصابة و / أو محفزات للالتهابات، والخلايا البطانية upregulate جزيئات الالتصاق محددة؛ هذا يؤدي إلى تسرب للكريات البيض من خلال البطانة الاوعية الدموية الدقيقة، وخاصة في الأوردة الشعرية بعد. وتبدأ هذه العملية مع الربط من الكريات البيض الحرة المتدفقة في مجرى الدم على البطانة. المتداول مستقر وراسخ التصاق الكريات البيض، وهذا بدوره يؤدي إلى التهجير وإفراز العوامل السامة للخلايا، متابعة هذه يربطون 1،2. ومن المعروف Selectins للتوسط في الخطوات الأولى من سلسلة 3-5. integrins هي المسؤولة عن خطوات لاحقة من التصاق شركة والتهجير 1،6-8. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير الكريات البيض وجزيئات الالتصاق البطانية لها أدوار حيوية في النماذج الحيوانية للإصابة نقص التروية ضخهوالربو والصدفية، والتصلب المتعدد، والضمور البقعي المرتبط بالعمر 9-12. في ظل هذه الظروف، وأساء توجيه الاستجابة الالتهابية لمهاجمة الجسم المرء، مما أدى إلى انهيار الأنسجة السليمة. القائمة الأدوية المضادة للالتهابات (مثل غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات، القشرية، أو وكلاء العلاج الكيميائي آخر) تحمل خطر الآثار الجانبية الشديدة مع استخدام على المدى الطويل 13. ولذلك، فإنه من مصلحة كبيرة لديهم الأدوات المناسبة، مع القدرة على تحديد جزيئات بأمراض محددة، والتي يمكن في نهاية المطاف أن تستهدف لها تأثير مضاد للالتهابات المطلوب في حين تبقى غير سامة 14. استخدمت الموجودة في أساليب المختبر مثل ثابت التصاق الكريات البيض فحص في وقت مبكر عام 1976 15. وقد استخدمت غرفة تدفق موازية لأول مرة في المختبر في عام 1987 لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق. في هذه التجارب، وحفز هومان تم perfused لالكريات البيض النوى (PMNs) من الدم الوريدي على أحادي الطبقة من الخلايا الأولية الإنسان الوريد السري البطانية (HUVECs). للسيطرة على الأوضاع تدفق الدورة الدموية، كان يعمل في جامعة هارفارد مضخة جهاز حقنة 16. بدلا من ذلك، لتجنب عزلة مصطنعة الكريات البيض، تم استخدام الدم كله في مزيج مع الغرفة الزجاجية المغلفة مع جزيئات الالتصاق يجمد 17. لتجنب التحفيز الكريات البيض ودراسة ميكانيكيا تفاعلها مع جزيئات الالتصاق في ظل الظروف الفسيولوجية تقريبية، وهو خارج الحي autoperfused، خارج الجسم، وقد وضعت الدائرة الشريانية 16. في هذه الدائرة، يتدفق الدم بين الحق العام الشريان السباتي الأيسر والوريد الوداجي الخارجي للماوس يعيش تحت التخدير، مما يسمح للتفاعل PBLs الأم داخل غرفة زجاجية microflow المغلفة مع جزيئات الالتصاق واحدة أو يجمد المشترك. والميزة الرئيسية لهذا التنفسيم هو القدرة على توظيف الفئران المعدلة وراثيا، والتي يتم التلاعب مسارات التهابات مباشرة أو غير مباشرة. بالإضافة إلى ذلك، هناك القدرة على تحديد مساهمة معزولة من جزيئات التصاق الكريات البيض إلى التهاب، وخالية من تفعيل الخارجي، في ظل ظروف التدفق. تطبيق منظم تدفق عند نقطة مدخلات غرفة التدفق يوفر مجموعة واسعة من الاختلافات التجريبية لقوى القص لتقليد إما الشرياني أو الوريدي أنظمة 18-22. نحن هنا وصف بتفصيل كبير بروتوكول بشأن إعداد وأداء المجراة سابقا autoperfused microflow غرفة الفحص.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

التفاعلات الكريات البيض البطانية هي الأحداث في وقت مبكر والحاسمة في الالتهاب الحاد والمزمن، ويمكن، عندما dysregulated، توسط إصابة الأنسجة مما يؤدي إلى تلف المرضي الدائم. المقايسات التقليدية الحالية تسمح للتحليل الكريات البيض جزيئات الالتصاق إلا بعد استخراج الكريات البيض من الدم. وهذا يتطلب الدم على الخضوع لعدة خطوات قبل الكريات البيض الدموية المحيطية (PBLs) يمكن أن يكون جاهزا للتحليل، والتي بدورها يمكن أن تحفز PBLs التأثير على نتائج البحوث. وautoperfused فحص غرفة التدفق الصغيرة، ومع ذلك، يسمح للعلماء لدراسة الكريات البيض في وقت مبكر ديسريغولاتيون الوظيفي باستخدام تدفق النظامية على فأرة الحاسوب الحية في حين وجود حرية التلاعب غرفة المغلفة. من خلال نموذج المرض، والتعبير الوظيفي للالكريات البيض جزيئات الالتصاق يمكن تقييم وكميا في غرفة الزجاج الصغيرة المغلفة مع يجمد جزيئات الالتصاق البطانية خارج الحي. في هذا النموذج، يتدفق الدمبين الحق العام الشريان السباتي الأيسر والوريد الوداجي الخارجي للماوس يعيش تحت التخدير، والسماح للتفاعل PBLs الأم في الغرفة. ويتحقق في الوقت الحقيقي التحليل التجريبي بمساعدة مجهر حيوي داخلي وكذلك جهاز ضغط جهاز هارفارد. تطبيق منظم تدفق عند نقطة المدخلات من الغرفة الزجاجية يسمح ظروف تدفق الفسيولوجية للمقارنة بين التجارب. سرعة الكريات البيض المتداول هي النتيجة الرئيسية ويتم قياسها باستخدام المعاهد الوطنية للصحة الوصول المفتوح البرمجيات يماغيج. وباختصار، يوفر autoperfused الجزئي فحص غرفة التدفق بيئة الفسيولوجية المثلى لدراسة الكريات البيض البطاني التفاعل ويسمح للباحثين لرسم استنتاجات دقيقة عند دراسة الالتهاب.

<html> أثناء التسجيل كل الكريات البيض التفاعل فقط هي واضح على الغرفة. ويمكن رؤية النتائج من تجربة تمثيلية في الشكل (4). وتشير السهام البيضاء إلى الكريات البيض الفردية التي تم التقاطها بواسطة جزيء التصاق الفائدة والمتداول على طول الغرفة بين تلك التدفق الحر أخرى داخل تدفق الدم. وهناك قطعة أثرية مشتركة خارج الغرفة ويمكن رؤية مع الأجواء المظلمة الكبيرة في جميع الصور. المجالات المظلمة تساعد القارئ نقدر حركة الكريات البيض في ما يتعلق نقطة ثابتة. ويمكن رؤية الكريات البيض التقدم على مدى فترة من 22 ثانية فيما يتعلق المجالات. الرسم البياني في الشكل نفسه يظهر المؤامرة الأخيرة من البيانات حيث يقلل TX1 سرعة المتداول (التحول إلى اليسار) وTX2 يزيد من سرعة (التحول إلى اليمين) مقارنة بالكنترول. 0 &quot;/&gt; الشكل 1: إعداد أنابيب للغرفة التدفق. (A) الأدوات اللازمة لأنابيب والتجمع غرفة (غرفة زجاجية صغيرة 0.4 X 0.04 × 50 مم، أنابيب البولي ايثيلين PE10، PE60 أنابيب البولي ايثيلين، والسيليكون أنبوب 002، أنبوب Y، T أنبوب، طبق بيتري 35 ملم، ملقط غرامة، مقص غرامة، حامل أنبوب، المشبك الأوعية الدموية، 7-0 خياطة الحرير. (ب) إعداد الشريان السباتي والوريد الوداجي أنابيب لإعادة توجيه تدفق الدم-الماوس من خلال غرفة المغلفة. (C) ربط الشريان السباتي أنابيب إلى محول الضغط. (D) وتمرير أنابيب من محول من خلال المشبك لضبط معدل تدفق الدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /><bص /&gt; الشكل 2: كشف الشريان السباتي والوريد الوداجي (A) قطع بعناية منطقة الرقبة لفضح القصبة الهوائية (B) تنظيف الشريان السباتي الصحيح بحيث يمكن تمرير قطعة من الخيط تحت السفينة (منقط الأصفر. ويحدد خط الشريان السباتي). (C) تنظيف حبل الوريد الأيسر بحيث يمكن تمرير قطعة من الخيط تحت السفينة (يحدد خط أصفر منقط حبل الوريد). (D) الترتيب المرتبطة بشكل فضفاض الغرز في المناطق العلوية والسفلية من الشريان السباتي والوريد الوداجي (وأشارت سهام المناطق العلوية والسفلية من السفن). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> الشكل 3: توصيل الأنابيب إلى tانه الشريان السباتي والوريد الوداجي. (A) تشديد عقدة العليا على الشريان السباتي ووضع المشبك دون أدنى عقدة. (ب) استخدام microscissors، وجعل شق صغير في الشريان السباتي، حوالي 1/8 محيط (منقط دائرة صفراء تشير إلى شق). ( C) إدراج أنابيب في الشريان السباتي وآمنة مع اثنين على الاقل من الغرز (يظهر خط منقط الأخضر أنابيب وخط منقط الأصفر الشريان السباتي). (D) وبالمثل إدراج أنابيب في الوداجي (ويظهر خط منقط الأخضر أنابيب و الأصفر خط منقط حبل الوريد). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> الشكل 4: دوام الممثل من الكريات البيض المتداول من خلال تدفق شامنوفمبر (مقياس بار = 100 ميكرون) (السهام البيضاء تشير إلى الكريات البيض المتداول). يصور الرسم البياني نتائج ممثلة بعد تصدير إلى برنامج الرسوم البيانية (TX1 وTX2 هي مجموعات العلاج التجريبية ونسبة النقر إلى الظهور هو مجموعة المراقبة). TX1 يمثل العلاج في الكريات البيض التي تبطئ مما يؤدي إلى نقص في الكريات البيض المتداول السرعة والتحول الأيسر من الرسم البياني مقارنة مع مجموعة غير المعالجة (CTR)، في حين TX2 يؤدي إلى تحول الصحيح مما يعكس زيادة في الكريات البيض المتداول السرعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

هنا، نقدم البروتوكول الذي يسمح للمحقق لتقييم ديناميات التوظيف الكريات البيض خارج الحي من خلال ربط غرفة المغلفة مع المستمدة البطانية جزيئات الالتصاق لنظام الدورة الدموية على فأرة الحاسوب. ويوفر هذا الأسلوب مزايا هامة لأنه يسمح لتقييم الكريات البيض في ظل الظروف البيولوجية النسبية.

تقييم التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الفحص Autoperfused غرفة Microflow

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K Views.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  هنا، نقدم البروتوكول الذي يسمح للمحقق لتقييم ديناميات التوظيف الكريات البيض خارج الحي من خلال ربط غرفة المغلفة مع المستمدة البطانية جزيئات الالتصاق لنظام الدورة الدموية على فأرة الحاسوب. ويوفر هذا الأسلوب مزايا هامة لأنه يسمح لتقيي?...

Video: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

في المختبر 3D نماذج الشرايين الخلية المستزرعة لدراسة استهداف المخدرات الأوعية الدموية تحت التدفق

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

نظام فسيولوجي دقيق لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض أثناء الالتهاب

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

أتمتة مقايسة النواة الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير والذكاء الاصطناعي

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...