Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
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R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) 및 P30EY014104 :이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호에 따라 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 추가 지원은 매사추세츠 라이온스 안구 연구 기금 (KMC)와 (KMC에) 실명 예방 연구에서 특별 장학생 상에 의해 제공되었다.

동물의 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문 협회에 대한 연구에 따라 처리하고, 지침과 규정은 매사추세츠 눈과 귀 양호​​실 동물 관리위원회 규정. 실험 전날 : 유량 용기 용 튜브 1. 준비 <ol><li> 경정맥면을 준비하려면, 5cm 폴리에틸렌 튜브 다음 6cm 실리콘 튜브에 1cm PE10 폴리에틸렌 튜브를 연결합니다. 경동맥 측, 약 1.5 cm 떨어진 1cm 폴리에틸렌 튜브에서 6cm 실리콘 튜브 내의 T-튜브의 첨가 경정맥 측 비슷하게 준비 (도 1A, B). T 관을 삽입하기 위해, 필요하다면 미세 핀셋을 이용하여 실리콘 튜브를 넓혀. </li><li> 압력 변환기에 실리콘 튜브 10cm의 일단을 연결하는 것은 다음 경동맥 T (S)의 단부를 삽입다른 쪽 끝으로 IDE T-튜브. 사이트가 꽉 연결을 확인하고 무료 누출. 필요한 경우 튜브가 함께 맞는 곳을 통해 파라 필름의 작은 사각형 조각을 적용, 누설 (그림 1C)을 방지합니다. </li></ol> 2. 상공 회의소 코팅 <ol><li> 내피 표면 단백질 코팅을 준비 (예를 들어, P 셀렉틴, 간 부착 분자 -1 (ICAM-1), 혈관 세포 부착 단백질 -1 (VCAM-1)) 0.1 % BSA에서. 가이드 라인으로, 단백질의 1 μg의 200 μL에서 BSA는 4-5 챔버 코트에 충분하다. 내피 표면 코팅 단백질과 각 챔버 (0.04 X 0.4 X 50mm)를 주입, 25 G 바늘에 연결된 1 ML의 주사기를 사용하여. 4 ° C에서 하룻밤 15 ML 튜브에 코팅 챔버를 저장합니다. </li></ol> 실험 일 : 3. 상공 회의소 준​​비 <ol><li> 4 ° C에서 코팅 챔버를 제거하고 각 측면에 경정맥과 경동맥 튜브를 연결합니다. 접속 .. 물개조심스럽게 튜브가 챔버를 만나는 곳 이상의 파라 필름의 작은 사각형 조각을 늘려서 기능. 주사기를 사용, 0.1 % BSA (누출 검사)와 챔버와 튜브를 입력합니다. 45 분 동안 품어. </li><li> 접시의 양쪽에있는 노치를 절단하여 챔버를 보유하는 35mm 페트리 접시를 준비합니다. 홈에서 실을 안정; 다음 노치 사이트에있는 접시에 실을 부착하는 실리콘의 작은 방울을 사용합니다. 챔버는 현미경으로 조사하여 수준인지 확인합니다. 실리콘은 적어도 15 분 동안 건조시킵니다. </li><li> 헤파린 60 ml의 잠금 주사기를 입력하고 압력 변환기에 연결합니다. 트랜스 듀서, 실리콘 튜브, 및 T-관 : 경동맥 다음과 같은 순서로 튜브에 압력 변환기를 연결합니다. <ol><li> 트랜스 듀서와 연결을 확보하기 위해 T-튜브에 연결된 실리콘 튜브 사이에 1cm의 PE50을 사용합니다. 가압 클램프 (도 1d)를 통해 경동맥 실리콘 튜브를 통과한다. 100USP 헤파린 죽을 실행우 기포는 튜브와 챔버가 없을 때까지. </li></ol></li></ol> 4. 소프트웨어 설정 <ol><li> 소프트웨어를 준비하려면, 컴퓨터, 현미경, 개방 실험실 장치의 전원을 켭니다. 더블 라이카 애플리케이션 스위트 (LAS) (또는 동급)을 클릭하고 비디오 저장할 폴더를 준비 : 검색을 → 획득 → 영화 → 클립의 순서를 정의 (클립 = 15, 녹화 시간 = 30 초, 그리고 간격 = 15 초) 다음 확인하기 위해 &quot;+&quot;기호를 클릭합니다. </li><li> 유동 압력이 위의 단계 4.1에 기록 폴더에 파일 이름을 LabChart (또는 동급) 파일을 열고 좌표를 기록합니다. </li></ol> 5. 수술 <ol><li> 케타민 (60 ㎎ / kg)과 자일 라진 (6 ㎎ / kg)의 조합을 사용하여 8-10 주령 마우스를 마취하여 복강 내 (IP) 주사. 깊은 진정 페달 철수 반사의 손실로 5 ~ 10 분 이내에 얻을 수 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 이소 플루 란 경우필요에 따라 얼굴 마스크를 통해 전달을들 수있다. </li><li> 마취하는 동안, 케이지에서 온난화 패드를 배치하고 체온을 유지하기 위해 37 ° C로 설정. 적절한 마취가 확인되면, 안구 건조를 방지하기 위해 바시 트라 신 연고와 복부 위치와 코트에 눈을 마우스를 놓습니다. </li><li> 그 후, 면도날을 사용하여 절개 부위에서 털을 면도하고 철저 알코올 현장 청소. </li><li> 일단 완전 마취하면 테이프 복부 위치에 마우스를 유지하는 동물을 고정. 가위로 목 영역을 노출하고 기관 및 선박 (그림 2A)를 노출하는 갑상선을 제거합니다. </li><li> 완전히 미주 신경 (그림 2B)을 손상하지 않도록주의하면서 노출 될 때까지 경동맥를 청소합니다. 봉합사의 조각을 접어 후 경동맥 아래에 봉합의 2 개는 지금 거기 그래서 굽힘 절단 경동맥 아래 벤드를 전달합니다. 루프 매듭으로 각 봉합 (를 체결하지노트). </li><li> 동일한 방식으로 (도 2D)에 봉합사를 제조 좌측 경정맥 (도 2C)을 노출시키기 위해 동일한 절차를 반복한다. </li><li> 마우스 혈관에 튜브를 연결합니다. <ol><li> 헤파린 IP 1 ㎖를 주입하여 마우스를 Heparinize. </li><li> 경동맥에 상단 봉합을 조입니다. 이 경동맥 (그림 3A)에 갈 수 낮은 선박 클램프를 놓습니다. microscissors (그림 3B)를 사용하여, 작은 절개, 동맥의 둘레의 약 1/8을 상단 봉합에 의한 동맥을 잡고 수 있도록 집게를 사용합니다. </li><li> 상부 봉합사 및 동맥 내로 만들어진 절개를 통하여 제 매듭 경동맥 튜빙 합격. 동맥 (도 3C를 여러 매듭이 단단히 밀착을 보장해야한다) 튜브 주위에 밀봉되도록 낮은 봉합을 묶어. </li><li> (경정맥 관을 삽입하기위한 용기를 동일한 절차를 반복클램프는 경정맥 측면에 대한 필요하지 않습니다 그림 3D)를. </li><li> 선박 클램프를 풀어 흐름을 테스트합니다. 누출이없는 경우 현미경으로 마우스를 이동하고 챔버 튜브 (수술 과정을 보여주는 부착 된 비디오 참조) 경동맥 튜브 및 경정맥을 연결합니다. </li></ol></li></ol> 6. 녹음 회전 속도 <ol><li> 마우스 순환 시스템 회로를 만들고, 챔버를 채우기 위해 경동맥 클램프를 연다. 흐름 조건이 안정되도록 피가 3 ~ 5 분 동안 순환 할 수 있습니다. 챔버는 현미경 대물 한 단부에서 다른 레벨이고 가장자리는 화면에 영상 녹화 윈도우로 평행이되도​​록 3-5 분의 대기 기간 동안, 현미경 스테이지를 조절. </li><li> 챔버를 통해 흐르는 셀이 보이도록 한 다음 접시에 10X 수침 대물 낮은 유리 물 챔버를 포함하는 수정 된 페트리 접시를 채운다.광 강도는 셀의 적절한 시청 조절 될 필요가있다. 일반적으로 낮은 강도가 더 낫다. </li><li> 트랜스 듀서는 중간 생리 흐름 압력에 상관, 꾸준한 30mm 수은을 읽도록하거나, 원하는대로 튜브에 클램프를 조정합니다. </li><li> 를 눌러 비디오 및 경정맥 끝 가까이에 완료 될 때까지 경동맥 끝쪽으로의 흐름에 대해 이동 처음 경과와 압력을 모두 기록 시작하기 위해 &quot;시작&quot;. 주의 : 다른 접착 분자를 이용한 여러 코팅 조건은 다중 챔버를 사용하여 동일한 마우스에서 연구 될 수있다. 오직 하나의 챔버는 한번에 기록된다. <ol><li> 기록이 완료되면, 혈류 정지, 입력 사이트 밸브를 닫는다. 챔버를 제거하고 다른 손에 한 손으로 미세 집게와 홈 집게를 사용하여 회로 (다른 접착 분자로 코팅 된) 새로운 실을 맞습니다. 단계에 설명 된대로 새로운 실에 대한 기록 재개6.1-6.4. </li></ol></li><li> CO에 의해 실험의 끝에서 척수 탈구 다음이 질식을 마우스를 모두 안락사. 절차는, 따라서, 마우스는 실험의 끝에 척수 전위 단자 의해 안락사된다. </li></ol> 7. 결과 해석 <ol><li> 기록 된 데이터가 ImageJ에 소프트웨어 (23)은 &quot;M TrackJ&quot;플러그인을 사용하여 분석합니다. </li><li> 파일 → 가져 오기 →의 AVI → 그레이 스케일로 변환하여 그레이 스케일로 파일을 변환합니다. </li><li> 글로벌 → 프레임 간격 (i)를 입력 재산 → → 선택 → 이미지로 프레임을 표준화. (J 비디오 이미지 윈도우의 상부 모서리에 도시)에 하나의 비디오 프레임의 개수에 의해 비디오 전체 기간 (통상 30 초)을 나누어 프레임 간격을 계산한다. </li><li> M TrackJ가 → 백혈구를 선택 트랙을 추가 → → 선택 플러그인하여 각 백혈구의 흐름을 측정→ (15)에 대한 각각의 프레임을 추적 - 20 초 → 병합. </li><li> 보기에서 모든 백혈구 단계를 반복 7.4. </li><li> 두 개의 열 복사 → M TrakJ의 모든 표시 → 선택 측정하여 백혈구의 평균 압연 속도를 결정 스프레드 시트로 추적합니다. &quot;V 의미&quot;열 픽셀 / 초 단위로 측정 백혈구 롤링입니다. 2/3로 나누어 μm의 / 초로 변환합니다. </li><li> 스프레드 시트로 압력 데이터 하이라이트 및 수출을 분석하고 다음과 같은 계산을 수행하려면 ΔP (mmHg로)와 t (다인 / cm 2) 각 실험군 간의 비교. 계산하면, 그래프에 대한 프리즘 소프트웨어로 데이터를 복사합니다. </li></ol>

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The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

백혈구 보충 프로세스는 염증 반응에서 중요한 단계이다; 이것은 그들이 그들의 작동 자 기능을 발휘할 수있는 표적 조직쪽으로 순환계에서 백혈구의 이동을 수반한다. 백혈구 보충은 죽상 경화성 플라크, 심근 경색, 허혈 / 재관류 및 이식 수술 일뿐만 아니라, 여러 CNS 관련 신경 염증성 질환 같은 염증성 10-12,20,24,25 다양한 조건에서 적분된다. 백혈구 보충 스팬은 autoperfused 마이크로 플로우 챔버는 조사자 백혈구 이주 역학을 연구 할 수있는 능력을 허용하는 필수 불가결 한 도구를 제공하는 질병 상태의 다양성을 고려. 지난 수십 년간, 시험 관내 검정법 다양한 백혈구 세포 유착 (26)의 동역학을 연구하기 위해 개발되었다. 불행히도, 이러한 모든 분석의 추출을 필요혈액에서 백혈구, 기계 활성화를 소개합니다. 생체 내 환경에 근접하게, 적응은 전혈 시료를 수집하고 혈역학 유동 조건 (16, 17)를 제어하도록 하였다. 여기서는 마우스 순환 시스템으로 코팅 챔버를 연결하여 필드 이전 발전을 연장한다. 우리는 생리적 범위로 혈액의 흐름을 조절하고 백혈구 롤링의 역학을 연구 할 수 있습니다. 코팅 챔버는 우리에게 특정 접착 분자와 백혈구의 상호 작용을 연구 할 수있는 기능을 제공합니다. 시스템이 살아있는 마우스에 의해 조작 수단으로서 기능하기 때문에,보다 밀접 우리 면역 마우스 모델의 다양한 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 연구 할 수 있도록, 자연 환경을 모방. 또한,이 시스템은 우리가 제공되는 다중 유전자 마우스 모델을 활용할 수있다. 시스템이 완전히 생체 환경을 복제하지 않지만, 그것은보고 특정을 연구하는 플랫폼을 제공한다생리적 조건에서 백혈구의 C 원소, 이전에 가능하지 않았다 묘기. 이 걸음 더 가까이 더 생리적 환경에 우리를 데려 간다하더라도 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 우리가 실 코팅으로 제한됩니다 백혈구 상호 작용의 특정 요소를 평가하는 유일한 수 있도록 완전히 혈관의 복잡한 3D 매트릭스를 복제하지 않습니다. 게다가,주의 깊게 프로토콜에서 언급 된 모든 단계에 따라 마우스의 순환하는 폐쇄 시스템을 확인해야한다. 기포의 도입은 크게 실험의 재현성 및 정확성에 영향을 미칠 것이다. 우리는 백혈구 롤링 역학을 평가 Autoperfused 마이크로 플로우 챔버의 사용을 설명하지만 절차는 다양한 질환을 연구 수사관 개인화 될 가능성이있다. 예를 들어, 암 세포는 백혈구 공유 공통 인테그린 많은 표현함으로써 전이. 나머지 공부g 더 가깝게 우리의 지식에 도움이 될 수있는 생체 내 환경을 모방 설정 및 특정 암 세포 침입의 가능성이 자연 예측에서의 롤링 역학. 하나의 가능한 접근법은 GFP를 발현하는 암세포의 롤링 역학을 추적하는 유량 용기 분석과 함께, 예컨대 27과 GFP 암세포에 대해 라벨링 기술을 결합 할 수있다. 그것은이 절차가 유전자 변형 마우스 및 질병 모델과 함께 다른 실험실에서 사용하기 위해 수정 방식을 볼 수 흥미로운 일이 될 것이다 물질의 다양한 챔버를 코팅과 같은 마우스에 여러 개의 챔버를 연결의 유연성을 감안할 때. 우리가 여기에서 설명하는 기술은 오직 연구자의 창의성에 의해 제한된다 훨씬 광범위한 응용 가능성에 감동.

염증은 손상에 대한 신체의 보편적 인 반응이다 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템 기능에 중요한 단계입니다. 부상 및 / 또는 염증성 자극에 응답하여, 특정 내피 세포 부착 분자를 상향 조절; 이것은 주로 후 모세관 세정맥에, 미세 혈관 내피 세포를 통해 혈관 외 유출을 백혈구에 이르게. 이 과정은 내피 세포에 혈류의 자유 흐르는 백혈구의 테 더링으로 시작합니다. 안정 압연 및 다시 윤회와 세포 독성 제의 분비로 연결 백혈구의 밀착성이가 1,2 테 더링 따릅니다. 셀렉틴은 계단식 3-5의 초기 단계를 매개하는 것으로 알려져있다; 인테그린은 회사의 부착과 윤회 1,6-8의 이후 단계에 대한 책임이 있습니다. 증거의 성장 몸은 허혈 재관류 손상 동물 모델에서 백혈구와 내피 세포 부착 분자가 중요한 역할을 제안합니다천식, 건선, 다발성 경화증, 및 연령 관련 황반 변성증 9-12. 이러한 조건 하에서, 염증 반응은 건강한 조직의 파괴의 결과, 자신의 몸을 공격하는 오 분사된다. (예를 들면 비 스테로이드 성 항염증제, 코르티코 스테로이드 또는 다른 화학 요법 제와 같은) 기존의 항염증제는 장기 사용 (13)으로 심각한 부작용의 위험을 수행한다. 따라서, 비 - 독성을 유지하면서 14 궁극적으로 목적하는 항 염증 효과가 대상이 될 수있는 질병 특정한 분자를 식별하는 능력을 가진 적절한 도구를 가지고 큰 관심사이다. 이러한 정적 백혈구 유착 검정 시험 관내 방법으로서 기존 빠르면 1976 15로 하였다. 병류 챔버는 제 1 유동 조건에서 백혈구의 내피 상호 작용을 연구하기 위해 1987 년에 시험 관내에서 사용 하였다. 이들 실험에서, 구호 물자를 자극N 정맥혈에서 다형 핵 백혈구 (백혈구)는 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)의 단층을 통해 관류 하였다. 혈역학 유동 조건에 대해 제어하기 위해 하버드 장치 주사기 펌프 (16)를 사용 하였다. 대안 적으로, 인공 백혈구 분리를 피하기 위해, 전혈 고정화 부착 분자 (17)로 코팅 된 유리 용기와 조합하여 사용 하였다. 백혈구 자극을 방지하고 기계적으로 대략적인 생리적 조건에서 부착 분자와의 상호 작용을 연구하기 위해, 생체 autoperfused, extracorporal은, 동정맥 회로 (16)를 개발 하였다. 이 회로에서 혈액 단일 또는 공동 고정화 부착 분자로 코팅 된 유리 마이크로 플로우 챔버 내에 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 가능하게 마취 살아있는 마우스의 우측 총 경동맥과 좌측 외부 경정맥 사이에 흐른다. 이 정기적 복용하기에 가장 큰 장점m은 염증 경로가 직접 또는 간접적으로 조작하는 유전자 조작 된 마우스를 사용하는 능력이다. 또한, 유동 조건 하에서, 외부의 자유 활성 염증, 백혈구 부착 분자의 격리 기여를 정확하게 할 수있는 능력이있다. 유동 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 애플리케이션은 동맥 또는 정맥 시스템 18-22를 모방하는 전단력의 실험 변동 폭넓게 제공한다. 여기에서 우리는 훌륭한 세부 사항에 생체 autoperfused 마이크로 플로우 챔버 분석의 준비와 성능에 관한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Micro glass chamber 0.4 x 0.04 x 50 mm</td><td>VitroCom</td><td>2540-050</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE 60</td><td>Fisher Scientific</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing 002</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15A</td><td></td></tr><tr><td>Y tube</td><td>Value Plastics</td><td>Y210-6</td><td></td></tr><tr><td>T tube</td><td>value plastics</td><td>T410-6</td><td></td></tr><tr><td>Silicone gel</td><td>Hardware store - Home Depo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Tube holder</td><td>FST</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Clamp applicator</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Vascular clamp</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>6-0 silk sutures</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-1215-6/0</td><td></td></tr><tr><td>25 x 1 G needles</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 x 1/2 G needles</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 100 USP units/ml</td><td>Hospital pharmacy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

백혈구 - 내피 상호 작용은 급성 및 만성 염증의 초기에 중요한 이벤트이며, 조절 곤란하면, 영구 병리학 적 손상으로 이어지는 조직 손상을 중재 할 수 있습니다. 기존의 종래 분석법은 혈액으로부터 백혈구 추출 후 백혈구 부착 분자의 분석을 허용한다. 이는 말초 혈액 백혈구 (말초 혈액 림프구)가 차례로 연구 결과에 영향을 미치는 말초 혈액 림프구를 자극 할 수있는 분석을위한 준비를하기 전에 몇 가지 단계를 받아야하는 혈액이 필요합니다. autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은, 그러나, 과학자들은 코팅 챔버를 조작하는 자유를하면서 라이브 마우스의 전신 흐름을 사용하여 기능 조절 장애 초기 백혈구를 연구 할 수 있습니다. 질병 모델을 통해, 백혈구 부착 분자의 기능적 발현을 평가할 수있다 고정화 내피 세포 부착 분자 생체 코팅 유리 마이크로 챔버 정량화. 이 모델에서 혈액 흐름챔버 내의 네이티브 말초 혈액 림프구의 상호 작용을 허용 우측 총 경동맥과 마취 살아있는 마우스의 왼쪽 외부 경정맥 사이. 실시간 분석 실험은 생체 내에 현미경의 도움뿐만 아니라 하버드 장치 압력 장치에 의해 달성된다. 유리 챔버의 입력 시점에서 유동 조절기의 어플리케이션의 사이에 유사한 생리 학적 실험 유량 조건을 허용한다. 백혈구 롤링 속도는 주요 결과이며, 건강 오픈 액세스 소프트웨어 ImageJ에 국립 연구소를 사용하여 측정한다. 요약하면, autoperfused 마이크로 흐름 챔버 분석은 백혈구를 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 최적의 생리 학적 환경을 제공하고 염증을 연구 할 때 연구자는 정확한 결론을 도출 할 수 있습니다.

<html> 각 기록 만 상호 작용 백혈구 동안 챔버에 분명하다. 대표적인 실험의 결과는도 4에서 볼 수있다. 흰색 화살표 관심 분자 접착에 의해 캡처하고, 혈류 내의 다른 자유 유동 챔버들 사이를 따라 굴러 개별 백혈구 가리. 챔버 외부의 일반적인 이슈는 모든 이미지에 큰 어두운 분야로 볼 수있다. 어두운 분야에서는 독자가 고정 점과 관련하여, 백혈구 이동을 이해할 도움. 22 초의 기간에 걸쳐 발전 백혈구는 관련 분야에서 볼 수있다. 동 도면에 그래프 TX1 압연 속도 (좌측 시프트)을 감소시키고 TX2는 대조군에 비해 속도 (우측 시프트)을 증가 최종 데이터 그래프를 보여준다. 0 &quot;/&gt; 그림 1 : 유량 용기 용 튜브의 준비. (A) 도구 실리콘은 002, Y 튜브, T 관, 35mm 페트리 접시, 미세 집게, 미세 가위 튜브, 튜브 및 챔버 어셈블리 (마이크로 유리 챔버 0.4 × 0.04 × 50 mm의 폴리에틸렌 튜브 PE10, 폴리에틸렌 튜브 PE60에 필요한, 튜브 홀더, 혈관 클램프 7-0 실크 봉합사. 코팅 챔버를 통해 마우스 혈액의 흐름을 다시 향하게하는 경동맥과 경정맥 튜빙 (B)의 제조. (C) 압력 변환기에 경동맥 연결 튜브. (D) 혈액의 흐름의 속도를 조정할 수있는 클램프를 통해 트랜스 듀서에서 튜브를 전달합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> 그림 2.. 경동맥과 경정맥을 노출하기 (A)을 조심스럽게 황색 점선 ((B) 기관을 노출 넥 영역을 잘라 봉합 부분이 용기의 아래에 전달 될 ​​수 있도록 우측 경동맥 청소 라인) 경동맥을 설명합니다. 봉합사의 조각 (노란 점선 라인은 경정맥을 설명) 선박에서 통과 될 수 있도록 (C)이 왼쪽 경정맥를 청소합니다. (D) 느슨하게 상부 및 하부 지역에서 봉합을 묶어 정렬 경동맥과 경정맥 (화살표 용기의 상부 및 하부 영역을 표시)의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> 그림 3 : 튜브를 연결하기 t하기그는 동맥 및 경정맥을 경동맥. (A) 경동맥에 위 매듭을 조여와 하부 매듭 아래의 클램프를 배치합니다. (B)를 microscissors를 사용하여 경동맥에 작은 절개를, 약 1/8 둘레 (점선 노란색 원은 절개를 나타낸다). ( C)는 경동맥에 튜브를 삽입하고 두 개 이상의 봉합 (녹색 점선 튜브와 노란색 점선 경동맥을 보여줍니다) 고정합니다. (D)을 마찬가지로 녹색 점선은 튜브와를 보여줍니다 (경정맥에 튜브를 삽입 노란색 점선 경정맥). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> 그림 4 : 흐름 참을 통해 압 백혈구의 대표적인 시간 코스BER (스케일 바 = 100 ㎛) (흰색 화살촉 롤링 백혈구 지적이). 그래프는 그래프 프로그램으로 보낸 후에 대표적인 결과를 보여줍니다 (TX1과 TX2는 실험 치료 그룹이며, CTR은 대조군)입니다. TX2는 속도 롤링 백혈구의 증가를 반영 우측 시프트 리드하면서 TX1은 속도 및 미처리 군 (CTR)와 비교하여 그래프의 좌측 시프트 압연 백혈구의 감소로 이어지는 느리게 백혈구하는 치료를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">를 클릭하세요 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a>

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.6K 조회수.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다. 

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

면역학 및 감염병학

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone and inflamed tissues.  E-selectin expression is constitutive on dermal and bone microvessels and is inducible by pro-inflammatory cytokines, such as IL-1&#945;/  and TNF-&#945;, on microvessels in inflamed tissues.  This lectin receptor mediates weak binding interactions with carbohydrate counter-receptor ligands on circulating leukocytes, which results in a characteristic  rolling  behavior.  Because these interactions precede more stable adhesive events and diapedesis activity, characterization of leukocyte rolling activity and identification of leukocyte E-selectin ligands have been major goals in studies of leukocyte trafficking and inflammation and in the development of anti-inflammatory therapeutics (1-5).  The intent of this report is to provide a visual, comprehensive description of the most widely-used technology for studying E-selectin   E-selectin ligand interactions under physiologic blood flow conditions.  Our laboratory in conjunction with the Harvard Skin Disease Research Center uses a state-of-the-art parallel-plate flow chamber apparatus accompanied by digital visualization and new recording software, NIS-Elements.  This technology allows us to analyze adhesion events in real time for onscreen visualization as well as record rolling activity in a video format.  Cell adhesion parameters, such as rolling frequency, shear resistance and binding/tethering efficiency, are calculated with NIS-Elements software, exported to an Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.  In the demonstration presented here, we employed the parallel-plate flow chamber to investigate E-selectin-dependent leukocyte rolling activity on live human bone marrow endothelial cells (hBMEC).  Human hematopoietic progenitor KG1a cells, which express a high level of E-selectin ligand, were used as our leukocyte model, while an immortalized hBMEC cell line, HBMEC-60 cells, was used as our endothelial cell model (6).  To induce and simulate native E-selectin expression in the flow chamber, HBMEC-60 cells were first activated with IL-1 .  Our video presentation showed that parallel-plate flow analysis is a suitable method for studying physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling activities and that functional characterization of leukocyte E-selectin ligand(s) in the flow chamber can be ascertained by implementing protease or glycosidase digestions.

This report provides a visual depiction of parallel-plate flow chamber analysis for studying leukocyte endothelial interactions under physiologic shear stress. This method is particularly useful for investigating the role of endothelial (E)-selectin and leukocyte E-selectin ligands that trigger leukocyte rolling on endothelial cell surfaces.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

생물학

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

발생학

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Source: Munir, H. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52480">Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation and Culture of Primary ...

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가

요약

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