This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

وتمت الموافقة على إجراءات تجريبية مع الفئران عن طريق لجنة رعاية الحيوان من جامعة ماكجيل (بروتوكول 4966). 1. إعداد مقتطفات البروتين من الخلايا المستزرعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المستزرعة مرتين مع 10 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط الخلايا الملتصقة مع أي شرطي المطاط أو مكشطة الخلية البلاستيكية في 1 مل من برنامج تلفزيوني، ونقل تعليق الجليد الباردة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 700 x ج، في 4 درجات مئوية. نضح PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من تحلل العازلة حشوية الجليد الباردة (الجدول 1) لكل 10 7 خلايا، وماصة صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه تجاهل. نقل طاف في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديتتركيز البروتين القاقم (عادة 1 - 10 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام مقايسة برادفورد 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وخلية متجر مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 2. إعداد مقتطفات من البروتين ماوس الكبد والطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس مع CO 2 الاستنشاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان الموت الرحيم على وسادة نظيفة على متن تشريح. فتح البطن مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الكبد والطحال باستخدام مقص وملقط، وشطف كل الأنسجة في برنامج تلفزيوني ما يقرب من 50 مل الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على الفور الأنسجة الى قطع صغيرة مع مشرط (على سبيل المثال: ما يقرب من 1 - 2 مم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون تأخير، ووضع قطعة من الأنسجة في cryotube طازج و المفاجئة ثم تجميدها في النيتروجين السائل. متجر مأخوذة الأنسجة المجمدة الأداة الإضافية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس قطعة واحدة من الأنسجة المجمدة (حوالي 1 - 2 مم 3) في ،25-،5 مل منالجليد الباردة العازلة تحلل حشوية (الجدول 1) مع الخالط الأنسجة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جناسة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والبرد على الجليد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بيليه ونقل طاف في أنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل. الحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين (عادة 1 - 10 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام مقايسة برادفورد 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وخلية متجر مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 3. إعداد رديولبلد غضب مسبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي IRE التي تحتوي على البلازميد I-12.CAT 22 التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع نوكلياز داخلية تقييد XbaI (1 U في ميكروغرام البلازميد)، الذي يشق المصب من تسلسل غضب. وسوف تستخدم البلازميد خطي كقالب لفي المختبر النسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لن في المختبر رد فعل النسخ في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر. استخدام الحلول الأسهم هو مبين في الجدول رقم 2 وإضافة: 1 ميكرولتر قالب البلازميد خطي، 4 ميكرولتر العازلة النسخ. 1 ميكرولتر مزيج من ATP / CTP / GTP المزيج، 10 ميكرولتر [α- 32 P] -UTP، 2 ميكرولتر dithiothreitol، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع و 1 ميكرولتر T7 RNA البلمرة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة 24. </li></ol> 4. تنقية رديولبلد غضب مسبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء النسخ في المختبر رد فعل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال، والناقل لهطول الأمطار أفضل. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 82.5 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 3 M. مزيج من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 273 ميكرولتر من الايثانول. مزيج من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الوقوف في RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في RT. طاف تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge في RT. طاف تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من ضعف المقطر، تعقيمها قبل H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ السائل، قسامة رديولبلد غضب التحقيق وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. مأخوذة المجمدة يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 3 أسابيع. </li></ol> 5. إعداد هلام بولي أكريلاميد الأصلي للEMSA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع هلام (16 × 16 سم) باستخدام 1.5 ملم الفواصل والمشط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 6٪ هلام بولي أكريلاميد الأصلي، استخدم الحلول الأسهم هو مبين في الجدول 3 مزيج 7.5 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد: bisacrylamide، 5 مل من 5X TBE و 37.5 ملمزدوج H المقطر 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من 10٪ بيرسلفات الطازجة الأمونيوم (APS) و 25 ميكرولتر tetramethylethylenediamine (TEMED). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب فورا الحل الأكريلاميد إلى هلام والسماح لها تتبلمر. انتظر حوالي 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الجهاز الكهربائي مع هلام، وملء خزانات مع 0.5X TBE والتواصل مع امدادات الطاقة. </li></ol> 6. الكهربي التنقل التحول الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 25 ميكروغرام من استخراج البروتين من الخلايا أو الأنسجة مع حشوية العازلة تحلل (الجدول 1) في الحجم الكلي للفي 10 ميكرولتر (يمكن أن تستخدم أيضا تركيزات بروتين أقل). الحفاظ على الجليد. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميكرولتر من 1: 4 المخفف 2-المركابتويثانول (2-ME) لتنشيط IRP1 نائمة (تركيز النهائي: 2٪) 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف غضب التحقيق في رديولبلد مزدوج المقطر H 2 O إلى 200،000 نسخة في الدقيقة / ميكرولتر، بدل طبيعة الحرارة على 95 درجةC لمدة 1 دقيقة، ويبرد في RT لمدة 5 دقائق على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل EMSA بإضافة 1 ميكرولتر من التحقيق غضب رديولبلد لاستخراج البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الهيبارين إلى رد فعل (لكبح تفاعلات البروتين غير محددة مع التحقيق 9) والاستمرار في الحضانة لمدة 10 دقيقة أخرى. قسامة حل سهم الهيبارين (50 ملغ / مل) وتخزينها في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام تحقيقات رديولبلد طويلة (&gt; 60 النيوكليوتيدات)، إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز T1 (1 U / ميكرولتر) واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT للحد من البروتين غير محددة ملزمة لجنة التحقيق، والسماح فصل أفضل من الحمض النووي الريبي / البروتين مجمع خلال الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من العازلة تحميل (80٪ الجلسرين + برموفينول الأزرق)، ومزيج الحمل على 6٪ غير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام لمدة 60 دقيقة في 130 V (5 V / سم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تيransfer هلام على ورقة مرشح كبيرة وجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح لفيلم وتطوير تصوير الإشعاع الذاتي. زمن التعرض قد تتراوح بين 1 ساعة (أو أقل) حتى O / N. </li></ol>

<ol>
	<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome.">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-mediated+degradation+of+IRP2:+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity.">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li><li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements.">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li><li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+iron+regulatory+protein-1+(IRP1)+by+oxidative+stress.">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li><li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+iron+metabolism.">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li><li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA.">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li><li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-responsive+elements:+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation.">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li><li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA.">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li><li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements.">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li><li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1,+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation.">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li><li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter.">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li><li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency.">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li><li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+and+the+cell+cycle:+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3'-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy.">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li><li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA.">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron.">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li><li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein,+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch.">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein(s)+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages.">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li><li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction.">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li><li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis.">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li><li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis.">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li><li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload:+from+pathophysiology+to+clinical+practice.">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li><li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+(IRP)-1+and+-2+genes.">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li><li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-/-+mice:+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels.">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530 (2014).</li><li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy.">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li><li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+RNA-protein+interactions.">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم تطويره لدراسة الأنشطة غضب ملزم من IRP1 وIRP2، ونحن نبين بيانات تمثيلية. باستخدام مجسات مختلفة، يمكن هذا البروتوكول أيضا أن تعدل لدراسة أخرى البروتينات ملزم RNA. والخطوة الحاسمة هي حجم التحقيق. استخدام تحقيقات طويلة، وهو أمر شائع عند موقع مل...

وقد تم تطوير EMSA في الأصل لدراسة العلاقة من البروتينات الحمض النووي ملزم مع تسلسل الحمض النووي الهدف 1،2. والمبدأ هو مماثل لتفاعلات RNA / البروتين 3، الذي هو محور من هذه المادة. لفترة وجيزة، واتهم RNA سلبا وسوف يهاجر نحو القطب الموجب خلال عدم تغيير طبيعة-الكهربائي في بولي أكريلاميد (أو الاغاروز) المواد الهلامية. الهجرة داخل هلام تعتمد على حجم الحمض النووي الريبي، والذي يتناسب مع شحنتها. ملزمة محددة من البروتين لRNA يغير التنقل بها، ويهاجر المعقدة أبطأ بالمقارنة مع RNA مجانا. ويرجع ذلك أساسا إلى زيادة في الكتلة الجزيئية، ولكن أيضا إلى تغييرات في تهمة وربما التشكل هذا. الاستفادة من RNA وصفت بأنها التحقيق يتيح رصد سهل من &quot;التخلف هلام&quot; أو &quot;bandshift&quot;. استخدام 32 تحقيقات RNA المسمى P شائع جدا ويوفر حساسية عالية. تم الكشف عن هجرة RNA / مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي مجاناعن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. السلبيات هي قصيرة العمر النصفي لل32 P (14.29 يوما)، وتدهور تدريجي في نوعية التحقيق بسبب الإنحلال الإشعاعي، واشتراط وجود رخصة النشاط الإشعاعي والبنية التحتية للعمل الإشعاعي، والمخاوف المحتملة للسلامة الأحيائية. لذلك، تم تطوير أساليب غير النظائر بديلة لوصفها التحقيق RNA، على سبيل المثال مع fluorophores أو البيوتين، والتي تتيح الكشف عن طريق الفلورسنت أو chemiluminescent التصوير 4،5. القيود المفروضة على هذه الأساليب هي تكلفة أعلى، وغالبا ما خفض حساسية مقارنة مع وضع العلامات النظائر، واحتمال من التسميات غير النظائر للتدخل في التفاعل RNA / البروتين. غير تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد هي مناسبة لمعظم التطبيقات EMSA وتستخدم بشكل شائع. في بعض الأحيان، قد المواد الهلامية الاغاروز تشكل بديلا لتحليل المجمعات الكبيرة. والميزة الرئيسية لEMSA هو أنه يجمع بين البساطة، والحساسية، ومتانة 4 &lt;/ سوب&gt;. الفحص يمكن أن تكتمل في غضون ساعات قليلة و لا يتطلب أجهزة متطورة. يمكن الكشف عن التفاعلات RNA / البروتين EMSA في تركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر أو أقل، وضمن مجموعة واسعة من الشروط الملزمة (درجة الحموضة 4،0-9،5، أحادي التكافؤ تركيز الملح 1-300 ملم، ودرجة حرارة 0-60 درجة مئوية). ويمكن أيضا RNA / البروتين تشكيل معقد دراستها من قبل مقايسة ملزمة التصفية. هذا هو إجراء بسيط، سريع، وغير مكلفة على أساس الإبقاء على المجمعات RNA / البروتين في مرشح النيتروسليلوز، في حين يمر التحقيق RNA مجانا إلى 6. مقارنة EMSA، هي محدودة في الحالات التي يحتوي التحقيق RNA مواقع ملزمة متعددة، أو استخراج النفط الخام يحتوي على أكثر من البروتينات ملزم RNA التي تربط إلى التحقيق في نفس الموقع. في حين متعددة التفاعلات RNA / البروتين سوف يعدم قبل الفحص ملزمة التصفية، يمكن تصور بسهولة عن طريق EMSA. في بعض الحالات، والتصور هو عشيةن ممكن عندما مجمعين RNA / البروتين شارك في ترحيل (على سبيل المثال، IRP1 البشرية / IRE وIRP2 / المجمعات غضب)، وذلك بإضافة الأجسام المضادة ضد واحد من البروتينات ملزم RNA إلى رد فعل EMSA، مما أسفر عن مزيد من التخلف على هلام ( &quot;supershift&quot;) 7. وقد تم EMSA تستخدم على نطاق واسع لدراسة IRP1 وIRP2، والتي هي المنظمين ما بعد النسخي من استقلاب الحديد 8-10. وهي تعمل عن طريق ملزمة لIRES، والهياكل دبوس الحفاظ phylogenetically داخل UTRs العديد من mRNAs 11. تم اكتشاف IRES لأول مرة في من mRNAs ترميز الفيريتين 12 و ترانسفيرين مستقبلات 1 (TfR1) 13، والبروتينات من تخزين الحديد وامتصاص، على التوالي. في وقت لاحق، تم العثور على IRES في محمر محددة أمينوليفولينات سينسيز (ALAS2) 14، أكونيتاز الميتوكوندريا 15، ferroportin 16، نقل معدن ثنائي التكافؤ 1 (DMT1) 17، نقص الأكسجة عامل محرض 2 <eم&gt; α (HIF2α) 18، وغيرها من mRNAs 19-21. وH- النموذج و-L فيريتين من mRNAs احتواء غضب واحدة في حياتهم 5 &#39;UTR، في حين TfR1 مرنا يحتوي IRES متعددة في تقريرها 3&#39; UTR. التفاعلات IRE / IRP تمنع تحديدا الفيريتين الترجمة مرنا من خلال منع sterically ارتباطه من 43S الوحيدات الريباسي. وعلاوة على ذلك، فإنها استقرار TfR1 مرنا ضد الانقسام endonucleolytic. IRP1 وحصة IRP2 تسلسل واسعة التشابه وعرض عالية النشاط ملزم غضب في الخلايا المتعطشة الحديد. في الخلايا من الحديد حافل، IRP1 يجمع على cubane الحديد-S العنقودية التي تحولها إلى أكونيتاز عصاري خلوي على حساب النشاط IRE ملزم، في حين IRP2 يخضع لتدهور proteasomal. وهكذا، فإن التفاعلات IRE / IRP تعتمد على حالة الحديد الخلوي، ولكن يتم تنظيمها أيضا إشارات أخرى، مثل H 2 O 2، وأكسيد النيتريك (NO) أو نقص الأكسجة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم النشاط IRE ملزم من خلية النفط الخام والأنسجة مقتطفات عن طريق البريدMSA. استخدمنا 32 ف المسمى التحقيق غضب H-فيريتين التي تم إنشاؤها بواسطة النسخ في المختبر من قالب DNA البلازميد (I-12.CAT)، حيث تم إدخال تسلسل غضب في الأصل بمعنى التوجه المصب لموقع البلمرة T7 RNA من قبل استنساخ [أليغنوكليوتيد الاصطناعية صلب 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="430">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:195px;">Name of the Materials&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">leupeptin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2884</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PMSF</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td align="right">78830</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BioRad Protein Assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15518-012</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UTP [alpha-32P]</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>NEG507H</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation liquid</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">141349</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">heparin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0777</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase T1</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Equipments&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue Ruptor</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">9001271</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean II xi Cell&#160;&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1834</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">20 wells combs 1.5mm thick</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1868</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mm spacers</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1849</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerPac</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>164-5070</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

التفاعلات RNA / بروتين حاسمة لمسارات التنظيمية ما بعد النسخي. بين البروتينات ملزم RNA عصاري خلوي أفضل وصف هم البروتينات التنظيمية الحديد، IRP1 وIRP2. كانت ملزمة لتسوية عناصر الاستجابة (IRES) داخل المناطق غير مترجمة (UTRs) من عدة أنواع من mRNAs الهدف، وبالتالي السيطرة على الترجمة من mRNAs أو الاستقرار. تم التفاعلات IRE / IRP درس على نطاق واسع من قبل EMSA. هنا، نحن تصف بروتوكول EMSA لتحليل النشاط IRE ملزم من IRP1 وIRP2، والتي يمكن تعميمها على تقييم نشاط البروتينات الأخرى ملزم RNA كذلك. والمحللة البروتين الخام التي تحتوي على البروتين ملزم RNA، أو إعداد النقي من هذا البروتين، وحضنت مع وجود فائض من 32 ف المسمى RNA التحقيق، والسماح لتشكيل تعقيدا. يضاف الهيبارين لمنع البروتين غير محددة للتحقيق ملزمة. وفي وقت لاحق، ويتم تحليل خليط من غير تغيير طبيعة-الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد. التحقيق الحرةيهاجر بسرعة، في حين أن RNA / البروتين المعارض معقدة التنقل المتخلفين. وبالتالي، يتم استدعاء الإجراء أيضا &quot;التخلف هلام&quot; أو &quot;bandshift&quot; الفحص. بعد الانتهاء من الكهربي، وجفت جل ويتم الكشف عنها المجمعات RNA / البروتين، وكذلك التحقيق الحرة، من خلال تصوير الإشعاع الذاتي. ويتمثل الهدف العام من البروتوكول هو لكشف وتحديد IRE / IRP وغيرها من التفاعلات RNA / البروتين. وعلاوة على ذلك، EMSA يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد النوعية وتقارب ملزم، ورياضيات الكيمياء للتفاعل RNA / البروتين قيد التحقيق.

تم إعداد IRE التحقيق رديولبلد، كما هو موضح في المادتين 3 و 4 من البروتوكول. كان تسلسل التحقيق 5&#39;-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 &#39;؛ النيوكليوتيدات الغامق تمثل C بقايا المفردة والحلقة، التي هي ملامح غضب حرجة. وكان النشاط الإشعاعي محدد من التحق?...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

هنا نقدم بروتوكول لتحليل التفاعلات RNA / البروتين. ويستند هذا التحول فحص التنقل الكهربي (EMSA) على الهجرة التفاضلية المجمعات RNA / البروتين والحمض النووي الريبي مجانا خلال الأصلي الكهربائي للهلام. باستخدام مسبار RNA رديولبلد، RNA المجمعات / البروتين يمكن تصور من قبل تصوير الإشعاع الذاتي.

التحول التنقل الكهربي الفحص (EMSA) لدراسة التفاعلات RNA-البروتين: حفيظة / IRP مثال

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa-for-study-rna-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

53.2K Views.  Jewish General Hospital.  هنا نقدم بروتوكول لتحليل التفاعلات RNA / البروتين. ويستند هذا التحول فحص التنقل الكهربي (EMSA) على الهجرة التفاضلية المجمعات RNA / البروتين والحمض النووي الريبي مجانا خلال الأصلي الكهربائي للهلام. باستخدام مسبار RNA رديولبلد، RNA المجمعات / البروت?...

Video: Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...