This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

הפרוצדורות עם עכברים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת מקגיל (פרוטוקול 4966). 1. הכנת תמציות חלבון מתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים בתרבית פעמיים עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט קר כקרח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד תאים חסיד עם או שוטר גומי או מגרד תא פלסטיק ב 1 מיליליטר של השעיה PBS, העברה קרה כקרח לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 700 XG, 4 ° C. לשאוב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ תמוגה cytoplasmic קר כקרח 100 μl (טבלת 1) לכל 10 7 תאים, ופיפטה למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה מחק. העברת supernatant לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Detריכוז חלבון סמור (בדרך כלל 1-10 מיקרוגרם / μl) באמצעות assay ברדפורד 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמציות Aliquot ותא לאחסן ב -80 ° C עד שימוש. </li></ol> 2. הכנת תמציות חלבון מעכבר כבד וטחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החיה מורדמים על משטח נקי על לוח לנתח. פתח את הבטן עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הכבד והטחול באמצעות מספריים ומלקחיים, ולשטוף כל רקמה בPBS כ 50 מיליליטר קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לחתוך רקמות לחתיכות קטנות עם סכין מנתחים (לדוגמא: כ 1 - 2 מ&quot;מ 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא דיחוי, לשים חתיכות של רקמות בcryotube טרי ולאחר מכן הצמדתי את להקפיא אותם בחנקן נוזלי. חנות snap-קפוא aliquots רקמה ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize פיסת הרקמה קפוא אחד (כ 1 - 2 מ&quot;מ 3) ב0.25-0.5 מיליליטר שלקר כקרח חיץ תמוגה cytoplasmic (טבלה 1) עם homogenizer רקמות במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את homogenate 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge ומקררים על קרח במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל גלולה וsupernatant העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש. שמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון (בדרך כלל 1-10 מיקרוגרם / μl) באמצעות assay ברדפורד 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמציות Aliquot ותא לאחסן ב -80 ° C עד שימוש. </li></ol> 3. הכנת radiolabeled IRE-הבדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize I-12.CAT פלסמיד IRE המכיל 22 על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם endonuclease הגבלת XbaI (U 1 לכל מיקרוגרם של פלסמיד), שדבק במורד הזרם של רצף IRE. פלסמיד לינארית, שישמש כתבנית לשעתוק במבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר אתn תגובת שעתוק במבחנה בנפח כולל של 20 μl. השתמש בפתרוני המניות שמוצגים בטבלה 2 ולהוסיף: 1 μl תבנית פלסמיד לינארית, חיץ שעתוק 4 μl; תמהיל 1 μl של ATP תערובת / CTP / GTP, -UTP 10 μl [α- 32 P], dithiothreitol 2 μl, מעכב RNase μl 1 וRNA פולימראז T7 μl 1. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 24. </li></ol> 4. טיהור של radiolabeled IRE-בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים תגובת שעתוק במבחנה על ידי הוספת 1 ​​μl של 0.5 M EDTA, pH 8. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר tRNA, כמוביל למשקעים טובים יותר. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 82.5 μl של אמוניום אצטט 3 M. מערבבים על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 273 μl של אתנול. מערבבים על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו נעמוד על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge ב RT. supernatant מחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם גלולה של 70% אתנול 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge ב RT. supernatant מחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה האוויר יבשה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה בשל מזוקק פעמיים 100 μl, autoclaved H 2 O. בעבר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת רדיואקטיביות במונה נצנץ נוזלי, בדיקה IRE radiolabeled aliquot ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש. aliquots הקפוא יכול לשמש לתקופה של עד 3 שבועות. </li></ol> 5. הכנת ג&#39;ל polyacrylamide מקורי עבור Emsa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הג&#39;ל (16 x 16 סנטימטרים) באמצעות 1.5 מ&quot;מ מפרידי ומסרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 6% ג&#39;ל polyacrylamide ילידים, להשתמש בפתרוני המניות שמוצגים בטבלה 3. מערבבים acrylamide 7.5 מיליליטר של 40%:. Bisacrylamide, 5 מיליליטר של 5x TBE ו37.5 מיליליטרH מזוקק פעמיים 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של 10% persulfate מוכן טרי אמוניום (APS) ו -25 tetramethylethylenediamine μl (TEMED). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשפוך את פתרון acrylamide לג&#39;ל ולתת לו לפלמר. המתן כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מנגנון אלקטרופורזה עם ג&#39;ל, למלא את הטנקים עם TBE 0.5x ולהתחבר עם אספקת החשמל. </li></ol> Assay Shift 6. Electrophoretic ניידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מיקרוגרם של תמצית חלבון מהתאים או רקמות עם חיץ תמוגה cytoplasmic (טבלת 1) בהיקף כולל של 10 בμl (עשויים לשמש גם ריכוזי חלבון נמוכים יותר). שמור על קרח. במידת צורך, להוסיף 1 μl של 1: 4 בדילול 2-mercaptoethanol (2-ME) כדי להפעיל IRP1 הרדום (ריכוז סופי: 2%) 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הבדיקה IRE radiolabeled בH מזוקק פעמיים 2 O 200,000 עותקים לדקה / μl, לפגל חום על 95 מעלותC 1 דקות, ולהתקרר בRT במשך 5 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת Emsa על ידי הוספת 1 μl של הבדיקה IRE radiolabeled לתמצית החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 50 מ&quot;ג / מיליליטר הפרין לתגובה (לעכב אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיות עם החללית 9) ולהמשיך את הדגירה לעוד 10 דקות. Aliquot פתרון המניות של הפרין (50 מ&quot;ג / מיליליטר) ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בבדיקות ארוכות radiolabeled (&gt; 60 נוקלאוטידים), להוסיף μl 1 RNase T1 (1 U / μl) ו דגירה של 10 דקות ב RT להפחית חלבון שאינו ספציפי מחייב הבדיקה, וכדי לאפשר הפרדה טובה יותר של RNA / החלבון מורכב באלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של חיץ טעינה (גליצרול 80% + bromophenol הכחול), לערבב ועומס על 6% ג&#39;ל polyacrylamide שאינו denaturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ג&#39;ל למשך 60 דקות ב 130 V (5 V / סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfer ג&#39;ל על נייר סינון גדול ויבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף לסרט ולפתח autoradiography. זמן חשיפה עשוי לנוע בין 1 שעה (או פחות) עד O / N. </li></ol>

<ol>
	<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome.">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-mediated+degradation+of+IRP2:+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity.">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li><li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements.">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li><li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+iron+regulatory+protein-1+(IRP1)+by+oxidative+stress.">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li><li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+iron+metabolism.">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li><li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA.">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li><li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-responsive+elements:+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation.">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li><li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA.">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li><li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements.">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li><li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1,+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation.">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li><li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter.">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li><li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency.">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li><li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+and+the+cell+cycle:+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3'-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy.">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li><li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA.">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron.">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li><li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein,+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch.">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein(s)+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages.">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li><li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction.">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li><li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis.">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li><li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis.">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li><li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload:+from+pathophysiology+to+clinical+practice.">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li><li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+(IRP)-1+and+-2+genes.">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li><li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-/-+mice:+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels.">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530 (2014).</li><li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy.">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li><li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+RNA-protein+interactions.">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בזאת, אנו מתארים פרוטוקול שפותחה כדי לחקור את פעילות IRE מחייבת של IRP1 וIRP2, ואנו מראים נתונים נציג. באמצעות בדיקות שונות, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ללימוד מחייב חלבוני RNA אחרים. שלב קריטי הוא בגודל של החללית. שימוש בבדיקות ארוכות, שהוא נפוץ כאשר אתר הקישור המדויק אי?...

Emsa פותח במקור כדי ללמוד את הקשר בין חלבוני קושרי DNA עם רצפי DNA היעד 1,2. העיקרון דומה לאינטראקציות RNA / חלבון 3, המהווה את המוקד של מאמר זה. בקצרה, RNA טעון שלילי ויהגר להאנודה שבאינה denaturing אלקטרופורזה בpolyacrylamide (או agarose) ג&#39;לי. הגירה בתוך ג&#39;ל תלוי בגודל של RNA, באופן פרופורציונלי למטען שלה. ספציפי מחייב של חלבון לRNA משנה הניידות שלה, והפליטים המורכבים איטי יותר בהשוואה לRNA החופשי. זאת בעיקר כתוצאה מגידול במסה המולקולרית, אלא גם לשינויים בקונפורמציה תשלום ואולי. ניצול RNA שכותרתו בדיקה מאפשר ניטור קל של &quot;פיגור ג&#39;ל&quot; או &quot;bandshift&quot;. שימוש של 32 בדיקות RNA שכותרתו P הוא נפוץ מאוד ומציע רגישות גבוהה. ההגירה של RNA / קומפלקסי חלבונים ו- RNA החופשי מזוהותעל ידי autoradiography. חסרונות הם זמן מחצית החיים קצרים של 32 P (14.29 ימים), ההידרדרות ההדרגתית באיכות של החללית בשל radiolysis, דרישת רישיון רדיואקטיביות ותשתית לעבודת רדיואקטיביות, וחששות בטיחות ביולוגיים הפוטנציאליים של. לכן, שיטות לא-איזוטופי חלופיים לתיוג הבדיקה RNA פותחו, למשל עם fluorophores או ביוטין, המאפשר זיהוי על ידי ההדמיה ניאון או chemiluminescent 4,5. מגבלות של שיטות אלה הן העלות גבוהה יותר ולעתים קרובות רגישות מופחתת בהשוואה לתיוג איזוטופי, ואת הפוטנציאל של תוויות שאינן איזוטופים להתערב באינטראקצית RNA / החלבון. ג&#39;לים polyacrylamide-denaturing ללא מתאים למרבית יישומי Emsa ומשמש בדרך כלל. בהזדמנות, ג&#39;לים agarose עלול להוות חלופה לניתוח מתחמים גדולים. היתרון העיקרי של Emsa הוא שהוא משלב פשטות, רגישות, וחוסן 4 &lt;/ Sup&gt;. Assay יכול להסתיים בתוך כמה שעות ואינו דורש מכשור מתוחכם. ניתן לאתר אינטראקציות RNA / חלבון על ידי Emsa בריכוזים נמוכים כמו 0.1 ננומטר או פחות, ובתוך מגוון רחב של תנאים המחייבים (pH 4.0-9.5, ריכוז מלח חד ערכי 1-300 מ&quot;מ, וטמפרטורה 0-60 מעלות צלזיוס). היווצרות מורכבת RNA / חלבון גם ניתן ללמוד על ידי assay מחייב הסינון. זהו הליך פשוט, מהיר, וזול המבוסס על השימור של מתחמי RNA / חלבון במסנן nitrocellulose, תוך בדיקה RNA חופשית עוברת דרך 6. בהשוואה לEmsa, הוא מוגבל במקרים שבהם הבדיקה RNA מכילה אתרי קישור מרובים, או התמצית גולמי מכילה יותר מאחד מחייב חלבוני RNA אשר נקלטים על ידי הבדיקה באותו האתר. בעוד אינטראקציות RNA / חלבון מרובות להתחמק מזיהוי על ידי assay מחייב המסנן, הם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי Emsa. במקרים מסוימים, להדמיה היא ערבn אפשרי כאשר שני מתחמי RNA / חלבון שיתוף להגר (למשל, IRP1 / IRE אדם וIRP2 / מתחמי IRE), על ידי הוספת נוגדנים נגד אחד מחייב חלבוני RNA לתגובת Emsa, מניב פיגור נוסף על ג&#39;ל ( &quot;Supershift&quot;) 7. Emsa כבר בשימוש נרחב ללמוד IRP1 וIRP2, שהם רגולטורים לאחר תעתיק של חילוף חומרים ברזל 8-10. הם פועלים על ידי קישור לIRES, מבני סיכה נשמרים פילוגנטית בתוך UTRs של כמה mRNAs 11. IRES התגלה לראשונה בmRNAs קידוד פריטין 12 וtransferrin קולט 1 (TfR1) 13, חלבונים של אחסון ברזל וספיגה, בהתאמה. בהמשך, IRES נמצא בsynthase aminolevulinate erythroid הספציפי (ALAS2) 14, aconitase המיטוכונדריה 15, ferroportin 16, טרנספורטר דו הערכי מתכת 1 (DMT1) 17, גורם עין מתנהל היפוקסיה 2 <eמ &#39;&gt; α (HIF2α) 18, וmRNAs 19-21 אחר. H- אב הטיפוס וmRNAs L-פריטין להכיל IRE אחד ב 5 &#39;UTR, בעוד TfR1 mRNA מכיל IRES מרובה בה 3&#39; UTR. אינטראקציות IRE / IRP במיוחד מעכבות תרגום mRNA פריטין ידי sterically חסימת הקשר שלה של 43s מקטע ריבוזומלי; יתר על כן, הם לייצב TfR1 mRNA נגד מחשוף endonucleolytic. IRP1 ודמיון רצף נרחב נתח IRP2 ולהציג פעילות מחייב IRE גבוהה בתאים רעבי ברזל. בתאי ברזל גדוש, IRP1 מרכיב אשכול Fe-S cubane שממיר אותו לaconitase cytosolic על חשבון פעילות IRE מחייב שלה, בזמן שIRP2 עובר השפלה proteasomal. כך, אינטראקציות IRE / IRP תלוי במעמד הברזל הסלולרי, אלא גם מוסדרות על ידי אותות אחרים, כגון H 2 O 2, תחמוצת חנקן (NO) או היפוקסיה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול להערכת פעילות IRE-מחייבת מתמציות תא ורקמה גסים על ידי EMSA. אנחנו השתמשנו בדיקה 32 שכותרתו P H-פריטין IRE שנוצר על ידי שעתוק במבחנה מתבנית ה- DNA פלסמיד (I-12.CAT), שבו רצף IRE הוצג במקור באוריינטצית תחושה במורד הזרם של אתר פולימראז T7 RNA על ידי שיבוט של oligonucleotides הסינתטי המרותק 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="430">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:195px;">Name of the Materials&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">leupeptin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2884</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PMSF</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td align="right">78830</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BioRad Protein Assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15518-012</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UTP [alpha-32P]</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>NEG507H</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation liquid</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">141349</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">heparin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0777</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase T1</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Equipments&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue Ruptor</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">9001271</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean II xi Cell&#160;&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1834</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">20 wells combs 1.5mm thick</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1868</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mm spacers</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1849</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerPac</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>164-5070</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

אינטראקציות RNA / חלבון הן קריטיות למסלולים רגולטוריים שלאחר תעתיק. בין מחייב חלבוני RNA cytosolic המאופיין ביותר חלבונים רגולטוריים ברזל, IRP1 וIRP2 הם. הם נקשרים לגהץ אלמנטי תגובה (IRES) בתוך האזורים מתורגמים (UTRs) של כמה mRNAs היעד, ובכך לשלוט בתרגום mRNAs או יציבות. אינטראקציות IRE / IRP נחקרו בהרחבה על ידי Emsa. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול Emsa לניתוח פעילות IRE מחייב של IRP1 וIRP2, שניתן להכליל על מנת להעריך את פעילותם של חלבוני קושרי RNA אחרים גם כן. Lysate חלבון גולמי המכיל חלבון קושר RNA, או הכנה מטוהרת של חלבון זה, הוא מודגרות עם עודף של 32 בדיקה RNA שכותרתו P, המאפשר להיווצרות מורכבת. הפרין מתווסף מונע חלבון שאינו ספציפי לבדיקה מחייבת. בהמשך לכך, התערובת מנותחת על ידי אלקטרופורזה שאינו denaturing על ג&#39;ל polyacrylamide. הבדיקה בחינםנודד במהירות, תוך תצוגות מורכבות RNA / חלבון ניידות מפגרת; לכן, ההליך המכונה גם &quot;פיגור ג&#39;ל&quot; או assay &quot;bandshift&quot;. לאחר השלמת אלקטרופורזה, ג&#39;ל הוא מיובש ומתחמי RNA / חלבון, כמו גם בדיקה בחינם, מזוהים על ידי autoradiography. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לזהות ולכמת IRE / IRP ואינטראקציות RNA / חלבון אחרות. יתר על כן, Emsa יכול לשמש גם כדי לקבוע סגוליות, זיקה מחייבת, והרכב של האינטראקציה RNA / חלבון נחקרים.

בדיקה IRE radiolabeled הוכנה, כפי שמתוארת בסעיפים 3 ו -4 לפרוטוקול. הרצף של החללית היה 5&#39;-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 &#39;; נוקלאוטידים המודגשים מייצגים שאריות מזווגים C והלולאה, שהם תכונות IRE קריטיות. הרדיואקטיביות הספציפית של החללית הייתה 4.5 x 10 ...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג&#39;ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa-for-study-rna-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

53.2K Views.  Jewish General Hospital.  כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי ...

Video: Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...