Name: electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비 <ol><li> 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오. </li><li> 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요. </li><li> 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS. </li><li> 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫. </li><li> 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비 <ol><li> CO 2 흡입으로 마우스를 안락사. </li><li> 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다. </li><li> 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3). </li><li> 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서. </li><li> 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화. </li><li> 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. </li><li> 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비 <ol><li> 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다. </li><li> 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 1 시간 24 40 ° C에서 품어. </li></ol> 방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제 <ol><li> 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다. </li><li> 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다. </li><li> 5 분 동안 RT에 서 보자. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛. </li><li> RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액. </li><li> 10 분 동안 공기 건조 펠렛. </li><li> 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균 </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다. </li></ol> EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비 <ol><li> 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다. </li><li> 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O </li><li> 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다. </li><li> 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결. </li></ol> 6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 <ol><li> 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각. </li><li> 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는. </li><li> 긴 방사성 표지 된 프로브 (&gt; 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한. </li><li> 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드. </li><li> 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다. </li><li> 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤. </li><li> 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생...

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 &quot;젤 지연&quot;또는 &quot;bandshift&quot;쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다. EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 &lt;/ SUP&gt;. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃). RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( &quot;supershift&quot;) 7. EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 <em&gt; α (HIF2α) (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR &#39;TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR&#39;프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

<table><tbody><tr><td>leupeptin</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Protein Assay</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermoscientific</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alpha-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG507H</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation liquid</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Name of the Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>20 wells combs</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td><td>1.5 mm thick</td></tr><tr><td>1.5 mm spacers</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 &quot;겔 위상차&quot;또는 &quot;bandshift&quot;분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5&#39;-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 &#39;이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다. 활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW...

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Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

53.5K 조회수.  Jewish General Hospital.  여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

생화학

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

생물학

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay for Detection of Transcription Factor-DNA Complexes

Source: Hsieh, Y. W. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54863">An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate the electrophoretic mobility shift assay to detect protein-DNA interactions using infrared fluorescent-labeled DNA probes. When the protein binds to the DNA probe, it forms a large complex that migrates slowly on and appears as a shifted band on the gel.

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

Source: Hsieh, Y. W. et al., An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Biomolecular Interaction Detection Techniques

Protein-nucleic acid interactions

SELEX-Based In Vitro Binding Assay to Identify RNA-Protein Interactions

Source: Singh, R. <a href="https://app.jove.com/v/59635">Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins.</a> J. Vis. Exp. ( (2019).
In this video, we describe the systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (SELEX) method to identify specific RNA-binding sequences for a target protein of interest. The protein is incubated with a large pool of randomized RNA sequences, and the protein-binding RNA sequences are isolated, PCR-amplified, and sequenced to identify their protein-binding sites.