We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. 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B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Profilatura polisomale è una tecnica potente che consente la quantificazione dello stato della traduzione di trascritti specifici in diverse condizioni di trattamento. Si tratta di una tecnica molto semplice principio che tuttavia richiede diverse fasi di esecuzione, alcune delle quali sono critici per la produzione di buoni profili polisoma. Questi passaggi chiave sono: 1) uso di prodotti chimici RNase-free e plasticware, 2) la preparazione di ottimi gradienti di saccarosio (nella nostra esperienza un 10-50% gradienti di saccarosio funzionano meglio per risolvere in modo efficiente 40 / 60S subunità e mRNA con ribosomi legato), e 3 ) utilizzando cellule che sono in crescita esponenziale e non confluenti oltre l&#39;80%, al fine di catturare i più alti tassi di traduzione. Quest&#39;ultimo passo dovrebbe essere presa in considerazione quando si fa trattamenti lunghi cellulari, come knockdown gene o sovraespressione, in modo che la quantità di cellule per piastra sarà una funzione di quanto le cellule saranno confluenti al punto finale. Nei risultati presented qui, polisoma analisi del profilo è stato uno strumento importante per valutare il ruolo PDCD4 nella regolazione traduzione dei IRES-mRNA ospitano XIAP e Bcl-xL 12. Il fatto che non abbiamo osservato alcun cambiamento nei profili generali polisoma su PDCD4 knock-down (Figura 1B) ci ha permesso di concludere che PDCD4 non ha compromesso traduzione globale cellulare nelle condizioni dell&#39;esperimento. Abbiamo poi utilizzato l&#39;analisi di RT-qPCR per determinare la distribuzione del XIAP e Bcl-xL mRNA in cellule trattate con PDCD4 o siRNA di controllo. qPCR è un metodo di scelta per analizzare profili polisoma, rispetto allo standard di RT-PCR o Northern blotting, perché permette di quantitativa piuttosto che un&#39;analisi semi-quantitativa della distribuzione mRNA e per la rilevazione di sottili variazioni nell&#39;efficienza traslazionale tra i trattamenti. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che la distribuzione delle XIAP e Bcl-xL mRNA (espresso come percentuale del target totale mRNA in tutto il gradient) era significativamente spostato in poliribosomi pesanti (mRNA con un gran numero di ribosomi ad essi associati) dopo PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando così un aumento di definizione di questi mRNA. Ciò è stato ulteriormente confermato da un aumento XIAP e Bcl-xL livelli di proteina, ma non nei loro livelli di RNA allo stato stazionario (Figura 1F, G). È importante sottolineare che la distribuzione polisoma della variante non-IRES di XIAP è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). In alternativa, l&#39;efficienza traduzionale potrebbe essere presentato come un rapporto di contenuto di mRNA in polisomi (solitamente frazioni 5 a 10) rispetto monosomes (solitamente frazioni 2 a 4) 14. L&#39;uso dei controlli in tutta il protocollo è importante nel convalidare qualsiasi polisoma risultato profiling, come picchi osservati dalle letture di assorbanza a 254 nm non possono da soli essere attribuito ad RNA ribosomiale (detergentes, come Triton X-100 fortemente assorbono in questa regione dello spettro e possono oscurare 40 / 60S picchi nella parte superiore del gradiente). Sfumature in bianco, senza lisato e / o con tampone lisato devono essere eseguiti per determinare il contributo relativo dei buffer per l&#39;assorbanza a 254 nm. Artefatti strutture di ordine superiore possono anche portare a interpretazioni errate di polisomi dove ci sono in effetti nessuno (ad esempio, &quot;pseudo-polisomi&quot; 20). Sequestranti magnesio (utilizzato durante tutta la procedura di stabilizzare ribosomi 80S) con l&#39;EDTA cationi bivalenti chelante aggiunti lisati e al buffer gradiente (20 mM per 15 min) provoca la separazione del ribosoma nei suoi componenti piccoli (40S) e grandi (60S ) subunità. Pertanto, se i picchi di assorbanza a 260 nm registrati sono infatti polisomi, trattamento EDTA collasserà il profilo tale osserverà una singola massima nella parte superiore del gradiente che corrisponde a liberare mRNA e unità ribosomiale (dati non mostrati). Coincidentecon EDTA indotta crollo del profilo, tutti gli obiettivi specifici analizzati da qPCR occorre ora trovato nella parte superiore del gradiente. Il numero dei ribosomi associati ad un mRNA non è sempre un indicatore di quanto efficientemente quel particolare mRNA viene tradotto. Infatti, ci sono contesti specifici in cui traduzione attiva su polisomi diventa stallo 21,22 che il lettore dovrebbe essere a conoscenza. Determinare se trascrizioni sono attivamente impegnati con i macchinari di traduzione può essere fatto da a) trattando il campione con puromicina, che a differenza di EDTA, provoca &#39;run-off&#39; di ribosomi che sono attivamente translocating in un mRNA, oppure b) il trattamento del campione con homoharringtonine che inibisce la traslocazione di solo il primo ribosoma al codone di inizio, di nuovo causando &#39;run-off&#39; di tutti i ribosomi translocating a valle. L&#39;uso di trascritti di controllo per l&#39;analisi qPCR è anche critico. Il Seleczione di trascrizioni che non sono affetti da diverse condizioni di trattamento come alcuni geni housekeeping (GAPDH, actina, tubulina Nucleolina), mRNA ribosomali (18S, RPL13A) o in questo caso la variante non-IRES del XIAP IRES, è importante in verificare se l&#39;effetto del trattamento sulla traduzione è specifica o generalizzata. Queste trascrizioni di controllo possono essere utilizzati per normalizzare la distribuzione dei mRNA analizzati come è stato fatto qui (XIAP e Bcl-xL mRNA sono stati normalizzati per GAPDH mRNA e espressa in percentuale del contenuto totale di mRNA rappresentato dalla somma del contenuto di mRNA in ogni frazione ) o, in alternativa, di destinazione e di controllo mRNA possono essere espressi come valori assoluti ed esposti separatamente. analisi qPCR dei lisati ingresso (solitamente il 10% del volume totale) è un altro passo che il controllo della distribuzione di specifici mRNA. Idealmente, il contenuto di un trascritto di mRNA specifico nel lisato ingresso dovrebbe essere paragonabile alla somma del contenuto di mRNA in tutte le 10 frazioni analizzati. Infine, Un passaggio facoltativo per il controllo per il fenolo: cloroformio fase di estrazione è a picco ogni frazione polisoma con un in vitro trascritto mRNA giornalista (come CAT, cloramfenicolo acetil transferasi) che verrà successivamente quantificato qPCR e può anche essere usato per normalizzare la dati 14. Come con qualsiasi tecnica, la profilatura polisoma presenta alcune limitazioni. Il fatto che di solito un minimo di 10 frazioni (cambiamenti più sottili di efficienza di traduzione può richiedere 20 o più) devono essere raccolti in modo da avere distribuzioni polisoma curato rende questo passaggio limitante, nel senso che solo un massimo di 4 campioni può essere analizzati alla volta per poter gestire comodamente estrazione dell&#39;RNA e analisi qPCR di 40 campioni e controlli di ingresso 4 alla volta. La dimensione del campione può facilmente aggiungere il passo con il numero di trascrizioni devono essere analizzati e il numero di qPCR replica di fare, e questo può essere costoso. Un altro limite di una base-qPCR polisomale profiling unnalisi è che può essere fatto solo su un approccio basato candidato (dove i trascritti da analizzare sono noti in anticipo) e non possono essere applicati per l&#39;analisi dell&#39;intero genoma di traduzione. Tuttavia, all&#39;inizio del 21 ° secolo, gli investigatori hanno cominciato a interrogare i loro RNA polisomale a livello genomico mediante DNA microarrays 15 e più recentemente con sequenziamento di prossima generazione 16,17. In questo approccio potente, profilazione polisomale viene eseguita come descritto in questo protocollo la differenza che, invece di effettuare analisi qPCR delle singole frazioni, monosomes frazioni (frazioni di solito 2-4) e polisomi frazioni (di solito frazioni) sono raggruppati insieme e variazioni nella traduzione globale analizzati da DNA microarray o dell&#39;intero genoma RNA sequencing. Quindi con questo approccio, è possibile valutare tutti gli mRNA la cui distribuzione si sposta dal polisomi a monosomes (diminuzione in traduzione) o viceversa (aumento in traduzione) su un trattamento specificomento. Validazione e quantificazione di specifica distribuzione polisomi di mRNA possono quindi essere fatto da qPCR. Un uso ancora più potente del principio polisomale profiling è profiling ribosoma. Ulteriore estensione alto rendimento di questa tecnica è stato segnalato di recente che consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di polisoma 23 frazioni. Ciò fornisce un chiaro vantaggio quando sondare l&#39;efficienza traslazionali delle collezioni mutanti o in una grande scala schermi RNAi. Profiling ribosoma è una tecnica che si avvale di sequenziamento di nuova generazione per mappare frammenti di RNA protetti da ribosomi (impronte ribosoma) impegnati nella sintesi proteica 24,25. In questa tecnica, traslocazione ribosoma può essere inibita con cicloeximide (reversibile) o emetine (irreversibile) seguita da lisi cellulare e la digestione RNasi per produrre una popolazione di impronte ribosoma. I ribosomi sono arricchiti, l&#39;RNA totale è isolato, e contaminando ribosomiale e RNA ribosomiale mitocondriale viene rimosso.Impronte di RNA di circa 26-28 nucleotidi sono isolati, a trascrizione inversa, trasformato in una libreria di cDNA e sequenziati 26. A differenza di profilazione polisoma di serie, questo approccio non solo identifica specifici mRNA che sono regolati traslazione, ma produce anche informazioni mRNA specifico per una risoluzione di codone, come l&#39;occupazione e la densità esatta di ribosomi lungo una trascrizione specifico. Ciò è particolarmente interessante per mRNA con specifiche modalità di traduzione, come mRNA IRES-ospitano, in quanto potrebbe dare più informazioni su dove sulla trascrizione ribosoma-reclutamento si sta verificando.

Regolazione della sintesi proteica (traduzione) è un processo cellulare fondamentale che è intimamente legata alla sopravvivenza cellulare. Dato che la traduzione consuma più del 50% dell&#39;energia della cellula, non è sorprendente che la traduzione è strettamente regolata e che perturbazioni in una versione non sono ben tollerati. Al contrario, molti processi cellulari aberranti richiedere che le macchine di traduzione e l&#39;uscita di traduzione (cioè proteoma) devono essere modificati. Questo è spesso il caso in vari stati di risposta allo stress e malattie, ed è probabilmente meglio esemplificato nel cancro. Uno dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la capacità delle cellule di riprogrammare rapidamente la produzione di proteine ​​in risposta a vari trigger esterni ed interni, così bene meccanismo di regolazione che consigli l&#39;equilibrio tra la sopravvivenza delle cellule e la morte 1. Due aspetti del controllo traduzionale sono particolarmente interessanti; comprensione della natura del mec normativohanism (s) ed elementi di comando che consentono una versione specifica, e l&#39;identificazione di specifici mRNA e dei loro prodotti proteici che partecipano alla risposta cellulare al particolare trigger che ha suscitato una versione selettiva in primo luogo. Profilatura polisoma è una tecnica che permette efficace studio di entrambi i processi. L&#39;obiettivo generale della tecnica polisoma profiling è quello di studiare e quantificare lo stato di traduzione di specifici mRNA in condizioni cellulari diversi. Il principio della tecnica è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA da &#39;&#39; congelamento &#39;&#39; ribosomi traducono attivamente su diversi trascritti e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo una distinzione tra trascrizioni altamente tradotte (vincolato da più ribosomi) e quindi mal quelli tradotti (vincolati da uno o due ribosomi). In questo particolare protocollo, la cicloesimmide antibiotico che si lega allaSubunità ribosomiale 60S e inibisce la produzione di deacetilato tRNA dal sito E ribosoma 2, viene utilizzato per inibire la traslocazione del ribosoma ribosomi e stallo sul mRNA traduzione. Tuttavia, altri agenti bloccanti come emetine tale definizione anche i blocchi di allungamento 3, può essere utilizzato. A differenza del western blotting e 35 S-metionina tecniche di marcatura che misurano l&#39;output finale del processo di traduzione, polisoma profilazione ha il vantaggio di misurare ribosomi associazione con mRNA attivamente tradotte, consentendo così uno studio più dettagliato di meccanismi di conversione in condizioni diverse. Quindi, la tecnica può essere facilmente adattato per studiare specificamente diverse modalità di definizione 4-6, fattori proteine ​​coinvolte nella regolazione definizione 7-9, condizioni di stress che interessano la sintesi proteica 1,10,11 o gli effetti delle strutture di mRNA come IRES oa monte aperte fasi di lettura su proteine ​​synthESIS 12-14. Al giorno d&#39;oggi, polisoma applicazioni di profilatura sono ancora più ampia con l&#39;uso di DNA microarray 15 o sequenziamento di prossima generazione 16,17 per analizzare polisomi-associati mRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regolazione della sintesi proteica rappresenta un punto di controllo chiave nella risposta cellulare allo stress. In particolare, RNA discreto elementi regolatori sono stati mostrati per permettere alla traduzione selettiva di specifici mRNA che codificano per proteine ​​tipicamente richiesti per una particolare risposta allo stress. L&#39;identificazione di questi mRNA, così come la caratterizzazione dei meccanismi di regolamentazione responsabili della traduzione selettiva è stata in prima linea di biologia molecolare per qualche tempo. Profiling polisoma è un metodo pietra miliare in questi studi. L&#39;obiettivo di polisoma profiling è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA immobilizzando ribosomi traducono attivamente diverse trascrizioni e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo così una distinzione tra trascrizioni altamente tradotti e quelli mal tradotti. Questi possono poi essere ulteriormente caratterizzate da metodi tradizionali biochimica e biologia molecolare. È importante sottolineare che, combinando polysome profilatura con approcci genomici ad alto rendimento consente una vasta analisi di scala di regolazione traduzionale.

Abbiamo recentemente descritto un nuovo ruolo per il tumore soppressore PDCD4 come un inibitore selettivo di traduzione degli mRNA codificanti inibitori di apoptosi XIAP e Bcl-xL 12 IRES-ospitare. Profiling polisoma era una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico di PDCD4 nella traduzione IRES-mediata. HEK293 cellule sono state trasfettate per esaurire i livelli endogeni di PDCD4 (Figura 1A) e poi sottoposti ad polisoma analisi del profilo. Abbiamo osservato che la riduzione dei livelli di PDCD4 non ha compromesso la traduzione globale cellulare, come giudicato dalla mancanza di cambiamenti nel profilo polisoma quando si confrontano i siCTRL e siPDCD4 cellule trattate (Figura 1B). Allo stesso modo, polisoma distribuzione di non-IRES variante di XIAP 19 è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). Al contrario, polisoma distribuzione dei mRNA due IRES-ospitano, XIAP e Bcl-xL, è risultata significativamente modificata. In assenza di PDCD4 la distribuzione di questi due mRNA viene spostata in ribopolysomes pesanti (Figura 1D, E). Dal momento che questo non è accompagnato da variazioni dei livelli di steady-state di XIAP e Bcl-xL mRNA (Figura 1F) Questi risultati dimostrano una maggiore traduzione di XIAP e Bcl-xL in cellule con livelli PDCD4 ridotti, che è stato ulteriormente confermato mediante Western blotting (Figura 1G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Profiling polisoma identifica PDCD4 come inibitore selettivo della traduzione XIAP e Bcl-xL (A) HEK293 cellule sono state trattate con PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL), non-targeting siRNA, lisati e sottoposti ad analisi Western blot con anti-PDCD4 e gli anticorpi anti-nucleolina per verificare il grado di PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 è stato abbattuto come in (A) eI lisati cellulari sono stati sottoposti a polisoma profilatura. Profilo polisoma Rappresentante è mostrato nel pannello superiore; distribuzione del XIAP non IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) mRNA relativi a quella della GAPDH è mostrato come la percentuale di mRNA totale (% mRNA) di ogni frazione. (F) fissa livelli di mRNA -state sono stati misurati mediante RT-qPCR in PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL) siRNA cellule trattate. (G) I lisati da (A) sono stati anche sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi anti-XIAP, anti-Bcl-xL, e anticorpi anti-nucleolina. (NB. I dati presentati nella figura 1 sono stati originariamente pubblicati in 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.9K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 