We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ポリソームプロファイリングは、異なる処置条件下での特異的転写物の翻訳の状態の定量化を可能にする強力な技術である。それはまだそれが良いソームプロファイルを生成するために重要であるそのうちのいくつかは、実行のいくつかのステップを必要とし、原則として、非常に単純な手法である。これらの重要なステップは次のとおりです。1）RNaseフリー化学物質やプラスチック製品を使用して、2）優れたショ糖勾配を（我々の経験では10-50％スクロース勾配が効率的にバインドされたリボソームを持つ40 / 60SサブユニットとmRNAを解決するための最善の仕事）を​​製造し、3 ）指数関数的に翻訳の最高速度を捕捉するために成長し、80％以下のコンフルエントされた細胞を使用。そのような遺伝子ノックダウンまたは過剰発現する限り、細胞治療を行う際にめっきする細胞の量は、細胞は、エンドポイントでコンフルエントにどれだけの関数になるように、この後者のステップは、考慮されるべきである。 結果にPRESENテッドはここで、ポリソームプロファイル分析は、IRES-保有するmRNA XIAPおよびBcl-xLの12の翻訳調節にPDCD4の役割を評価するための重要なツールでした。我々はPDCD4ノックダウン（ 図1B）の際に、一般的なポリソームプロファイルの変化を観察しなかったという事実は、私たちはPDCD4、実験の条件の下でグローバルセルラー翻訳を損なわなかったと結論することができました。我々は次に、PDCD4または対照siRNAで処理した細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布を決定するために、RT-qPCR分析を使用した。それはmRNAの分布を定量的にではなく、半定量的分析のために、および処置の間の翻訳効率の微妙なシフトの検出を可能にするため、定量PCRは、標準的なRT-PCRまたはノーザンブロット法とは対照的に、ポリソームプロファイルを分析するために選択される方法である。この技術を用いて、XIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布は、（グラムでの合計は、標的mRNAのパーセントとして表されていることを示すことができたadient）PDCD4がノックダウン後に有意したがって、これらのmRNAの翻訳の増加を示している（ 図1D、E）重いポリリボソーム（それらに関連するリボソームの数が多いのmRNA）にシフトした。これをさらにXIAPおよびBcl-xLのタンパク質レベルではなく、それらの定常状態のRNAレベル（ 図1F、G）の増加によって確認された。重要なことは、XIAPの非IRES変異体のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）の間で変化しなかった。代わりに、翻訳効率は14（通常2〜4を留分）モノソーム対ポリソーム中のmRNA量の比率（通常は5から10分画）として提示することができた。 254nmでの吸光度測定から観察されたピークが自分でリボソームRNA（洗剤に起因することができないようなプロトコルを通じてコン​​トロールの使用は、結果プロファイリング任意のポリソームを検証する上で重要であるトリトンX-100のようなsは、強く）スペクトルのこの領域で吸収し、勾配の最上部40 / 60Sピークを不明瞭にすることができる。溶解物なしで、および/または溶解物緩衝液ブランク勾配は、254nmにおける吸光度のバッファの相対的な寄与を決定するために実行される必要がある。人為的な高次構造も事実なしで（ 例えば 「擬似ポリソーム」20）があるポリソームの誤った解釈につながることができます。 EDTAが溶解物への勾配緩衝液（15分間の20mM）に加え、二価カチオンキレート剤は、その成分の小さい（40S）にリボソームの分離を引き起こし、大きな（60Sになると（80Sリボソームを安定化するための手順を通して使用される）、マグネシウムを封鎖）サブユニット。 260nmで記録された吸光度ピークがポリソーム確かであればこのように、EDTA処理は、単一の最大値は、mRNAとリボソームユニットを解放するために対応する勾配の最上部付近に観察されるように、プロファイルを崩壊する（データは示さず）。一致するプロファイルのEDTA誘発性崩壊で、定量PCRによって分析具体的な目標のすべてが今、勾配の上部に見つかるはずです。 mRNAと関連したリボソームの数は、常に特定のmRNAが翻訳されていることをどのように効率的にするものではありません。実際、ポリソーム上のアクティブな変換は、読者が知っておくべき21,22失速となるような特定のコンテキストがあります。転写物は積極的にEDTAとは異なり、「流出」を積極的mRNAを横切って転位されたリボソームを引き起こすピューロマイシンで試料を処理すること）により行うことができる翻訳機構に係合し、またはb）試料を処理しているか否かを判定する再び、任意の下流の転位リボソームの「流出」を引き起こし、開始コドンでのみ最初のリボソームの転位を抑制するホモハリングトニンと。 qPCR分析のための制御転写物の使用も重要である。セレクXIAP IRESの非IRES変種など、いくつかのハウスキーピング遺伝子（GAPDH、アクチン、チューブリン、ヌクレオリン）、リボソームのmRNA（18S、RPL13A）などの異なる処理条件によって、またはこの場合には影響を受けません転写物るが、中には重要である翻訳に対する治療の効果は、特定または一般化されている場合を検証。 XIAPおよびBcl-xLのmRNAはGAPDH mRNAに対して標準化し、すべての画分中のmRNA含有量の和で表される全mRNA含量の百分率として表し（ここで行ったように、これらの制御転写産物は、分析のmRNAの分布を正規化するために使用することができ）、又は代替的に、標的および対照mRNAは、絶対値として表され、別々に表示することができる。入力された溶解物（総体積の通常10％）のqPCR分析は、特定のmRNAの分布のた​​めに制御するもう一つのステップである。理想的には、入力された溶解物中の特定の転写物のmRNA含有量を分析し、すべての10の画分中のmRNA量の合計に匹敵する必要があります。最終的にフェノールのために制御するための任意のステップ：クロロホルム抽出工程（たとえばCAT、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど） のin vitro転写レポーターmRNAと各ポリソーム画分をスパイクすることで、その後、qPCRにより定量化され、さらに正規化するために使用することができるデータ14。 任意の技術と同様に、ポリソームプロファイリングは、いくつかの制限を提示します。通常、10画分の最小（変換効率のより微妙なシフトが20以上を必要とするかもしれない）素晴らしいポリソーム分布を有するために収集する必要があるという事実は、4つのサンプルのみを最大とすることができるという意味で、このステップは制限させる快適に一度に40個のサンプルと4の入力コントロールのRNA抽出およびqPCR分析を扱うことができるように時間に分析した。サンプルサイズは、容易に定量PCRを行うためにレプリケートする方法の多くの転写物解析されるべきであり、何を追加することができ、これはコストがかかる。プロファイリング定量PCRベースのポリソームの別の制限nalysisはそれだけで（分析される転写物が予め分かっている）は、候補ベースの手法で行うことができ、翻訳のゲノムワイドな解析のために適用することができないことである。しかし、21 世紀の初めに、研究者らは、DNAを用いてゲノムレベルでのそれらのポリソームRNAを調べるために開始した次世代シーケンス16,17とより最近15とをマイクロアレイ。むしろ個々の画分の定量PCR解析を行うよりも、ことを除いて、このプロトコルで説明したように、この強力なアプローチでは、ポリソームプロファイリングが行われ、グローバルな翻訳にフラクション（通常分2-4）およびポリソーム画分（通常留分）を一緒にプールされ、バリエーションを分析したモノソームDNAマイクロアレイまたは全ゲノムRNA配列決定によって。したがって、このアプローチでは、特定の治療の際に、その分布のシフトポリソームからモノソームに（翻訳の減少）またはその逆（翻訳の増加）全てのmRNAを評価することが可能であるメント。特定のmRNAのポリソーム分布の検証および定量化は、その後qPCRにより行うことができる。ポリソームプロファイリング原理のさらに強力な使用はリボソームプロファイリングです。この技術のさらなる高スループット拡張がポリソーム画分23の何百もの同時モニタリングが可能になることが最近報告された。変異体のコレクションや大規模RNAiスクリーニングの並進効率をプロービングするときに明確な利点を提供する。リボソームプロファイリングは、タンパク質合成24,25に従事リボソーム（リボソームフットプリント）によって保護RNA断片をマッピングするために、次世代シークエンシングを利用している技術である。この技術では、リボソームの転位は、リボソーム足跡の集団を得るために細胞溶解およびRNase消化に続いて（可逆）、シクロヘキシミドまたはエメチン（不可逆的）を抑制することができる。リボソームは、濃縮された全RNAを単離し、夾雑リボソームおよびミトコンドリアリボソームRNAを除去する。約26〜28ヌクレオチドのRNA足跡を単離し、逆転写、cDNAライブラリーに変換され、26を配列決定した。標準ポリソームプロファイリングとは異なり、このアプローチは、翻訳制御されている特定のmRNAを識別するだけでなく、そのような特定の転写物に沿ってリボソームの正確な占有密度などコドン解像度でのmRNAに固有の情報が得られる。それは転写物上リボソームの募集が行われている場所の詳細な情報を与えることができるので、これは、そのようなIRES-保有するmRNAの翻訳などの特定のモードを持つmRNAをするために特に重要である。

タンパク質合成（翻訳）の調節は、密接に細胞生存にリンクされている重要な細胞プロセスです。翻訳が細胞のエネルギーの50％以上を消費することを考慮すると、変換が厳密に調節されていること、および翻訳の摂動が十分に許容されていないことは驚くべきことではない。逆に、多くの異常な細胞プロセスは、翻訳機構と翻訳出力（ すなわちプロテオーム）を修正しなければならないことを要求している。これは、しばしば、様々なストレス応答および疾患状態における場合であり、おそらく最も癌に例示されている。翻訳制御の重要な利点は、迅速に、様々な外部及び内部トリガー、先端細胞生存および死亡1のバランスそれによって微調整機構に応じて、タンパク質の出力を再プログラムする細胞の能力である。 翻訳制御には2つの側面は、特に興味深いものです。規制MECの性質の理解hanism（単数または複数）と特定の変換を可能にする制御エレメントは、特定のmRNAおよび最初の場所で選択的翻訳を誘発し、特定のトリガに対する細胞応答に関与するそれらのタンパク質産物の同定。ソームプロファイリングは、両方のプロセスの効果的な研究を可能にする技術である。 ポリソームプロファイリング技術の全体的な目標は、異なる細胞条件下で特定のmRNAの翻訳状態を研究し、定量化することである。技術の原理は、「異なる転写産物上で「積極的に翻訳するリボソームを「凍結」することによってmRNAの翻訳を取り込むため、（数リボソームによって結合された）高度に翻訳された転写産物の区別を考慮して、ショ糖勾配上で遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することで、不十分（1つまたは2つのリボソームによって結合された）ものを翻訳した。この特定のプロトコルに結合する抗生物質シクロヘキシミド中60SリボソームサブユニットとブロックリボソームのEサイト2からの脱アセチル化されたtRNAのリリースは、リボソームの転位を阻害し、mRNAの翻訳にリボソームを停止するために使用されます。しかし、このようなエメチンもブロック翻訳伸長3などの他のブロッキング剤を使用することができる。 翻訳プロセスの最終的な出力を測定し、ウェスタンブロッティングおよび35 Sメチオニン標識技術とは異なり、ポリソームプロファイリングは、このように異なる条件下で変換メカニズムのより詳細な研究を可能にし、積極的に翻訳mRNAとリボソームとの関連を測定するという利点を有する。したがって、この技術は、容易に翻訳調節7-9、タンパク質合成1,10,11、又はIRESの上流またはmRNA構造の効果に影響を与えるストレス状態に関与するタンパク質因子は、特異的に翻訳4-6の異なるモードを研究するために適合させることができるタンパク質シンセ上のオープンリーディングフレームESIS 12-14。今日では、ポリソームプロファイリングアプリケーションがさらに広いポリソーム関連するmRNAを分析するためのDNAマイクロアレイ15または次世代シーケンス16,17を用いている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

タンパク質合成の調節は、ストレスに対する細胞応答の重要な制御点を表す。具体的には、控えめなRNA調節エレメントは通常、特定のストレス応答に必要なタンパク質をコードする特定のmRNAの選択的翻訳を可能にすることが示された。これらのmRNAの同定だけでなく、選択的な翻訳のために責任を調節メカニズムの特徴付けは、しばらくの間、分子生物学の最前線に立ってきました。ソームプロファイリングは、これらの研究における礎石方法です。ポリソームプロファイリングの目標は、異なる転写に積極的に翻訳するリボソームを固定化することによってmRNAの翻訳をキャプチャし、これにより、高度に翻訳された転写物および不完全に翻訳されたものとの区別を可能にする、スクロース勾配上の超遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することである。次いで、これらは、さらに伝統的な生化学的および分子生物学的方法によって特徴付けることができる。重要なことは、組み合わせのpハイスループットゲノムアプローチとolysom​​eプロファイリングは翻訳制御の大規模解析を可能にします。

我々は最近、アポトーシス阻害剤XIAPおよびBcl-xLの12をコードするIRES-保有するmRNAの選択的な翻訳阻害剤として腫瘍抑制PDCD4のための新規の役割を説明した。ソームプロファイリングはIRES媒介翻訳PDCD4の具体的な関与を実証するための重要な技術だった。 HEK293細胞を一過性にPDCD4（ 図1A）の内因性レベルを枯渇させるトランスフェクトし、その後、プロファイル分析をポリソームに供した。我々は、比較siCTRLとsiPDCD4細胞（ 図1B）で処理ソームプロフィールの変化の欠如によって判断されるようにPDCD4のレベルを減らすことが、グローバル細胞翻訳を損なわなかったことを観察した。同様に、XIAP 19の非IRES変異型のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）との間で変化しなかった。対照的に、2つのIRES-保有するmRNAのポリソーム分布は、XIAPおよびBcl-xLのは、有意に変化した。 Pの非存在下でDCD4これら2つのmRNAの分布は重いribopolysomes（ 図1D、E）にシフトされます。これはXIAPおよびBcl-xLのmRNAは（ 図1F）の定常状態レベルの変化を伴わないので、これらの結果は、ウェスタンブロッティング（ 図によって確認された減少PDCD4のレベルの細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのの翻訳の増強を実証1G）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 図1：ポリソームプロファイリングがXIAPおよびBcl-xLの翻訳の選択的阻害剤としてPDCD4を識別し、（A）HEK293細胞を、PDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）で処理し、抗PDCD4で溶解し、ウェスタンブロット分析に供したsiRNAを、非標的およびPDCD4の程度を確認するために、抗ヌクレオリン抗体がノックダウン（B）PDCD4は（A）のようにノックダウンしたと細胞溶解物をプロファイリングポリソームに供した。代表ポリソームプロファイルは、トップパネルに示されている。 XIAP非IRES（C）の分布は、GAPDHのそれと比較したBcl-xLの（D）、およびXIAP IRES（E）のmRNAが各画分中の全mRNAのパーセント（％mRNA）のように示されている。（F）で点灯-state mRNAレベルはPDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）siRNA処理細胞におけるRT-qPCRにより測定した。（G）からの溶解物（A）抗XIAP、抗-Bcl-xLの、及び用いたウエスタンブロット分析に供した抗ヌクレオリン抗体。 （NB。データが元々 12に掲載された図1に示した） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Biology

27.9K ビュー.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 