We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate.">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype.">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li><li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5'+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress.">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li><li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation.">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום. בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL 12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) 14. השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא &quot;פסאודו-polysomes&quot; 20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ&quot;מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע. מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע 21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל&#39;ניגר &#39;של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל&#39;ניגר &#39;של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם. השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל 14 נתונים. כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה -21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays 15 ולאחרונה עם רצף של הדור הבא 16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים 23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני 24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף 26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.

רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות 1. שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים. המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי &#39;&#39; הקפאה &#39;&#39; ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום 2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות 3, ניתן להשתמש. בניגוד למערבי סופג ו -35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום 4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום 7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון 1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis 12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA 15 או רצף של הדור הבא 16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ &#39;שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.

יש לנו לאחרונה תיארתי תפקיד חדש למדכא גידול PDCD4 כמעכב תרגום סלקטיבי של IRES-מחסה mRNAs קידוד מעכבים אפופטוטיים XIAP וBcl-XL 12. פרופיל Polysome היה טכניקת מפתח כדי להדגים את המעורבות הספציפית של PDCD4 בתרגום תיווך IRES. HEK293 תאים היו transfected זמני לרוקן רמות אנדוגני של PDCD4 (איור 1 א), ואז העביר לpolysome ניתוח פרופיל. הבחנו כי רמות הפחתה של PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי, כמו להישפט על ידי חוסר השינויים בפרופיל polysome כאשר משווים siCTRL וsiPDCD4 תאים שטופלו (איור 1). באופן דומה, polysome הפצה של גרסה הלא-IRES של XIAP 19 הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). בניגוד לכך, polysome הפצה של mRNAs שני IRES-מחסה, XIAP וBcl-XL, הייתה שונה באופן משמעותי. בהעדר PDCD4 ההפצה של שני mRNAs אלה מוסטת לribopolysomes הכבד (1D איור, E). מכיוון שזו אינה מלווה בשינויים ברמות מצב היציב של XIAP וBcl-XL mRNA (איור 1F) תוצאות אלו מראות משופרים תרגום של XIAP וBcl-XL בתאים עם רמות PDCD4 מופחתות, אשר אושר גם על ידי מערבי (איור סופג 1G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> איור 1:. פרופיל Polysome מזהה PDCD4 כמעכב סלקטיבי של תרגום XIAP וBcl-XL () טופלו HEK293 תאים עם PDCD4 siRNA או שליטה (CTRL), ללא מיקוד siRNA, lysed ונתון ניתוח כתם מערבי עם אנטי PDCD4 ונוגדנים נגד Nucleolin כדי לוודא את מידת PDCD4 לדפוק למטה. (ב) PDCD4 ופל כמו ב() וlysates התא היו נתונים לpolysome פרופיל. פרופיל polysome נציג מוצג בפנל העליון; חלוקת הלא IRES XIAP (C), Bcl-XL (ד &#39;), וXIAP IRES (E) mRNAs ביחס לזה של GAPDH מוצג כאחוז מה- mRNA הכולל (% mRNA) בכל חלק. (F) יציב רמות ה- mRNA -state נמדדו על ידי RT-qPCR בPDCD4 siRNA או שליטה (CTRL) siRNA תאים שטופלו. (G) lysates מ (A) גם היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי XIAP, אנטי-Bcl-XL, ו נוגדנים נגד Nucleolin. (NB. הנתונים המוצגים באיור 1 פורסם במקור ב -12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling at JoVE.com

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

27.9K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Video: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...